Introduction
Il basso tasso di sopravvivenza nel NSCLC (non a piccole cellule cancro ai polmoni) pazienti è dovuta principalmente alla limitata efficacia dei trattamenti di malattia avanzata e poveri diagnosi precoce 1. Mutazioni attivanti nel gene EGFR, che sono stati scoperti in una sottopopolazione di pazienti con NSCLC, sono noti per conferire sensibilità agli inibitori della tirosin-chinasi (TKI). Purtroppo, la maggior parte dei pazienti con NSCLC EGFR mutanti sviluppare una resistenza TKI 2. Soprattutto in questo contesto, una diagnosi corretta è obbligatoria. In generale, a causa della localizzazione dei tumori, l'ottenimento di tessuto bioptico nel NSCLC non è sempre possibile. Pertanto, diversi studi sono in corso che utilizzano metodi non invasivi per ottenere questi dati biologici. Exosomes sono descritti come componenti biopsia liquidi che potrebbero essere studiati in modo da ottenere valori diagnostici e prognostici con tecniche non invasive 3.
Esosomi sono nanovesicles (40 - 100 nm di diametro) di eorigine ndocytic che vengono rilasciati da diversi tipi di cellule, sia in condizioni fisiologiche e patologiche 4. Possono trasportare proteine, lipidi, mRNA e microRNA. Inoltre, diversi studi suggeriscono un ruolo pleiotropico di tumore derivato esosomi, che possono influenzare la crescita e la sopravvivenza delle cellule tumorali, l'angiogenesi, stromale e rimodellamento della matrice extracellulare e la resistenza ai farmaci 5.
I microRNA (miRNA) sono di breve RNA non codificanti che sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale, vincolante il 3'-UTR dei mRNA bersaglio e che porta l'mRNA di degrado o di un non-traduzione 6. Raccolta differenziata dei miRNA in esosomi è stato descritto. In questo contesto, recentemente è stato dimostrato, in vitro e in vivo, un imballaggio selettiva di miR-21 (un miRNA noto con effetti oncogeni) in esosomi rilasciati da linee cellulari leucemia mieloide cronica dopo il trattamento curcumina 7.
Ilprofilo exosomal miRNA è simile al profilo miRNA del tumore primario e questa caratteristica può essere sfruttata nella diagnosi precoce e la prognosi 3. In particolare, vi è la possibilità di caratterizzare, mediante real-time PCR, miRNA selezionati correlate con il profilo molecolare della malattia, per esempio., Mutazioni EGFR tra gli altri 8.
Qui, l'analisi di un panel selezionato di NSCLC-correlato miRNA 8-9 è descritto che sono stati isolati da exosomes liberati nel sangue di pazienti con NSCLC. Dopo aver ottenuto il consenso informare rapporto dai pazienti, al plasma di 12 pazienti con NSCLC e 6 controlli sani, sono stati analizzati. L'isolamento exosome è stata eseguita con kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Prima isolamento exosome, campioni di plasma sono stati trattati con RNAsi, per degradare contaminanti circolanti miRNA. Abbiamo deciso di effettuare questa analisi con un kit commerciale a causa della standardizzazione limitato di altri Techniques (ad es., ultracentrifugazione) che è particolarmente importante quando si lavora con campioni clinici. Questo kit comprende un trattamento proteinasi K, che degradano la RNAsi, e diminuisce il rischio di degradare miRNA exosomal dopo exosome lisi. analisi microRNA è stata effettuata da Real Time-analisi sensibile e specifica PCR; mir-1228-3p è stato utilizzato come controllo endogeno ed i dati sono stati normalizzati in base alla formula 2 - ΔΔct. I valori di controllo sono utilizzati come riferimento e risultati sono riportati in scala logaritmica.
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Protocol
1. Isolamento Exosome
Nota: L'isolamento di esosomi da campioni di plasma, è stato eseguito con un kit commerciale, secondo il protocollo del produttore e con l'aggiunta di un trattamento RNAsi: (tutti questi passaggi devono essere eseguite con dispositivi di protezione personale e dell'ambiente, secondo procedura giuridica specifica per la manipolazione di campioni biologici ).
- Prendere 1 ml di plasma di ogni campione, conservati a -80 ° C, e posizionarlo sul ghiaccio.
- Centrifugare il campione a 2000 xg per 20 minuti a RT; questo passaggio è obbligatorio per rimuovere le cellule e detriti.
- Trasferire il surnatante contenente il plasma pulito in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Centrifugare il nuovo tubo a 10.000 xg per 20 minuti a RT.
- Trasferire il surnatante contenente il plasma pulito in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Aggiungere 100 ng / ml di RNAsi al supernatante e incubare il tubo a 37 ° C per 10 min inper degradare RNA circolante.
- Trasferire tutto il plasma trattato in una nuova provetta 2 ml e aggiungere 0,5 volume di PBS 1x.
- Agitare il campione al fine di mescolare le soluzioni.
- Aggiungere 0,05 volumi di soluzione proteinasi K (racchiudere nel kit) al campione.
- Vortex campione e incubare a 37 ° C per 10 min.
- Aggiungere 0,2 volumi di tampone exosome precipitazioni al campione e mescolare le soluzioni per inversione.
- Incubare il campione a 2 ° C a 8 ° C per 30 min e poi centrifugare il campione a 10.000 xg per 5 minuti a RT.
- Aspirare e scartare il surnatante. Il pellet contiene i exosomes isolati.
- Aggiungere tampone selezionato al pellet exosome per risospendere le esosomi. La selezione del buffer dipende dall'analisi valle prevista, in questo caso:
- Aggiungere 100 pl di PBS 1x per eseguire analisi TEM.
- Aggiungere 346,5 ml di specifica buf lisiFer per l'estrazione di RNA (dal kit commerciale) (ATTENZIONE: rischio chimico).
- Aggiungere 100 pl di tampone di lisi per l'estrazione delle proteine (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - leupeptina / Aprotinin 10 ug / ml) per eseguire l'analisi Western Blotting. (ATTENZIONE: rischi chimici).
- Conservare le exosomes risospeso a -20 ° C.
2. Exosome Caratterizzazione da Analysis Western Blot
Nota: Al fine di caratterizzare i nanovesicles isolate, si raccomanda western blotting con anticorpi contro ALIX e Tsg101 (ben noti marcatori exosomal).
- Dopo risospensione del pellet exosome in Lysis buffer, posizionarlo in ghiaccio per 1 ora in modo da sciogliere la membrana exosomal.
- Centrifugare il lisato a 12,000 g per 10 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta senza disturbare il pellet.
- Quantificare il conten totale di proteine exosomalt da Bradford Assay o altri metodi e carico di 50 ug di proteine per pozzetto in Tris / glicina SDS - gel di poliacrilammide all'8%. (ATTENZIONE: rischi chimici).
- Separare le proteine (e di un indicatore di peso molecolare appropriato) a 8% SDS-PAGE elettroforesi su gel con tampone di corsa (25 mM Tris, 192 mm glicina, 0,1% SDS) per 1 ora e 30 min a 120 V. (attenzione: rischi chimici ).
- Trasferire la proteina ad una membrana di nitrocellulosa da elettroblotting con 4 ° C buffer di trasferimento fredda (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo) per 1 ora a 50 V. costante (NOTA: rischi chimici).
- Bloccare la membrana per 1 ora in agitazione lenta con il 5% di latte secco non grasso in 1x TBS -Tween 0,1%.
- Lavare la membrana 4 volte per 5 min in agitazione veloce con 1x TBS - Tween 0,1%.
- Aggiungere gli anticorpi primari contro ALIX e Tsg101 (uno per membrana) in tampone appropriato (di conseguenza la scheda tecnica degli anticorpi dal produttore) e incubare la membrana O / N; In lenta agitazione.
- Lavare la membrana 5 volte per 5 min in rapida agitazione con 1x TBS - Tween 0,1% per rimuovere l'anticorpo eccessiva.
- Aggiungere l'anticorpo secondario appropriato tampone appropriato (di conseguenza la scheda tecnica degli anticorpi dal produttore) e incubare la membrana per 1 ora in agitazione lenta.
- Lavare la membrana 5 volte per 5 min in rapida agitazione con 1x TBS - Tween 0,1% per rimuovere l'anticorpo eccessiva.
- Rilevare la proteina selezionato mediante l'analisi chemiluminescenza 11.
3. Caratterizzazione Exosome da Analysis TEM
Nota: Per visualizzare i esosomi isolati, TEM (Transmission Electron Microscopy) analisi è stata effettuata.
- Luogo ~ 10 mcg (precedentemente quantificati da saggio Bradford) del campione di esosomi intatto risospesi in PBS 1x su una parafilm e mettere sul campione cadere un carbonio griglia di nichel rivestito Formvar per 1 ora. <li> Lavare la griglia 3 volte posizionandola su tre di 40 microlitri 1x gocce di PBS.
- Lavare la griglia 5 volte posizionandolo su cinque 30 microlitri gocce d'acqua ultrapura.
- Fissare il campione aggiungendo una goccia di 2,5% glutaraldeide (ATTENZIONE: rischio chimico) per 10 min.
- Lavare la griglia 3 volte posizionandolo su tre 40 microlitri 1x gocce PBS.
- Aggiungere una goccia del 2% acetato di uranile (NOTA: rischi chimici) e mettere la griglia su di esso per 15 minuti per contrastare il campione.
- Incorporare il campione su una goccia di 0,13% metilcellulosa (NOTA: rischi chimici) e lo 0,4% acetato di uranile e incubare la griglia sulla parte superiore della goccia per 10 min.
- Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso con carta assorbente ed asciugare la griglia per 5 min con il lato rivestito up.
- Esaminare la griglia di trasmissione microscopio elettronico a 12.
4. Exosomal RNA Estrazione e quantificazione
Nota: Abbiamo deciso di Perform l'estrazione totale RNA da campioni exosomal utilizzando un kit commerciale, secondo il protocollo del produttore: (ATTENZIONE: rischio chimico, rivedere il protocollo e le linee guida del produttore).
- Dopo la risospensione del pellet exosome a 346,5 ml di tampone di lisi, aggiungere 3,5 ml di β-mercaptoetanolo (ATTENZIONE: rischi chimici) e vortex con forza; questo passaggio è obbligatorio al fine di distruggere le membrane lipidiche.
- Aggiungere il lisato alla colonna di lavaggio in un tubo di raccolta e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Dopo la centrifugazione, scartare la colonna e trasferire il filtrato in un nuovo tubo di 1,5 ml RNasi-free.
- Aggiungere 350 ml di etanolo al 70% (ATTENZIONE: rischi chimici) e mescolare nel vortex per 5 secondi.
- Caricare il lisato nella colonna risoluzione e centrifugare per 30 secondi a 8000 × g. Dopo centrifugazione, eliminare l'eluato e trasferire la colonna in un tubo di raccolta.
- Caricare 350 ml di dissalazione Buffer e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Dopo la centrifugazione, eliminare l'eluato e restituire la colonna nella stessa provetta di raccolta.
- Aggiungere 95 ml di miscela di reazione DNasi I (10 ml di DNasi ricostituito I + 90 ml di tampone DNasi, per ogni campione) sulla membrana di silice della colonna e incubare a RT per 15 minuti a RT. (ATTENZIONE: rischio chimico)
- Aggiungere 200 ml di tampone di lavaggio (ATTENZIONE: rischio chimico) alla colonna e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Porre la colonna in un nuovo tubo di raccolta.
- Aggiungere 600 ml di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Dopo la centrifugazione, scartare eluato e posizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta.
- Aggiungere 250 pl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 11.000 g per 2 min. Porre la colonna in un tubo RNasi-free 1,5 ml.
- Eluire l'RNA in 40 ml di acqua RNase-free e centrifugare a 11.000 5; g per 1 minuto, in modo da avere una concentrazione elevata di RNA in questo piccolo volume.
- Porre immediatamente RNA eluito su ghiaccio per prevenire i potenziali danni o conservare a -80 ° C.
- Quantificare il contenuto di RNA. Nota: Qui, la quantizzazione RNA è stata effettuata utilizzando 1 ml di campione attraverso spettrofotometro.
5. Retrotrascription dei miRNA Exosomal
Nota: A causa della quantità limitata descritto di contenuti miRNA in esosomi, si è deciso di eseguire la trascrizione inversa di miRNA selezionati mediante un kit commerciale utilizzando un test individuale per ciascun miRNA, secondo il protocollo del produttore. Per ogni campione, 8 miRNA correlate allo stato di NSCLC sono stati selezionati (miR-30b; miR-30c, miR-103, miR-122, miR-195, miR-203, miR-221, miR-222 e miR-1228- 3p come controllo endogeno).
- Preparare la master mix di trascrizione inversa (RT mix). Per ogni reazione preparare 7 ml di RT mix, come descritto inhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (clicca qui per scaricarlo) (ATTENZIONE: rischio chimico).
Nota: In questo esperimento, 9 diverso mix RT sono stati preparati per ogni campione. - Mescolare delicatamente e conservare la miscela RT sul ghiaccio. Aggiungere 7 ml di RT mix per provetta di reazione.
- Aggiungere 5 ml di RNA del campione (10 mg di RNA totale) per ogni tubo di reazione e mescolare delicatamente.
- Aggiungere 3 ml di primer trascrizione inversa 5x (ATTENZIONE: rischio chimico) da ogni saggio impostare nel tubo di reazione corrispondente.
- Mescolare lentamente, chiudere il tubo e incubare in ghiaccio per 5 min.
- Caricare il tubo di reazione nel termociclatore e avviare la reazione di trascrizione inversa utilizzando i seguenti valori di parametro (HOLD a 16 ° C per 30 minuti; tenere a 42 ° C per 30 minuti; tenere a 85 ° C per 5 minuti; tenere premuto ∞ 4 ° C).
6. Tempo reale analisi PCR di Exosomal miRNA
Nota: Questa analisi è stataeseguita utilizzando un kit commerciale per Real Time PCR (qPCR), con tre repliche biologiche e tecniche per campione.
- Per ogni reazione, preparare 17.67 ml di mix Real Time PCR (10 ml di PCR Master Mix + 7,67 ml di acqua priva di nucleasi), mescolare e mettere in ghiaccio. (ATTENZIONE: rischio chimico)
- Aggiungere 1 ml, per ogni tubo di PCR, di 20x primer qPCR (ATTENZIONE: rischio chimico).
- Mettere 18.67 ml di mix qPCR in ciascun pozzetto della piastra.
- Aggiungere 1,33 ml di prodotto trascrizione inversa nel suo corrispondente a micropiastre.
- Chiudere la piastra e girare esso (300 gx 5 sec).
- Inserire la piastra in un sistema di Real Time PCR e iniziare la corsa con le seguenti condizioni di PCR: tenere a 95 ° C per 10 minuti; 40 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 60 secondi a 60 ° C. Processo e normalizzare i dati secondo la formula 2 - ΔΔct 13.
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Representative Results
Un totale di 12 nel plasma di pazienti con NSCLC e 6 controlli sani sono stati trattati con il kit commerciale per l'isolamento exosome dal plasma. Ogni campione è stato elaborato da analisi Western Blot per valutare l'marcatori exosomal ALIX (96 kDa) e Tsg101 (43 kDa). Un esempio di questi risultati sono presentati 3 campioni in figura 1, che indica che l'isolamento exosome da campioni di plasma è fattibile con questo protocollo.
Per caratterizzare biofisico campioni exosomal, analisi TEM è stata eseguita. TEM hanno dimostrato che i nanovesicles ottenuti con tale protocollo isolamento hanno una dimensione media nell'intervallo di dimensioni exosomal, tra 40 - 100 nm (Figura 2).
Dopo l'isolamento e la caratterizzazione exosome, abbiamo studiato il loro contenuto miRNA. Abbiamo selezionato 8 miRNA specifici, noto per essere deregulatDE NSCLC. Come controllo interno, abbiamo usato miR-1228 che è stato precedentemente validato come controllo endogeno stabile ed efficiente in diversi tipi di tumore 10. In base a questi risultati miR-1228 è un controllo endogeno affidabile e stabile. Quando il livello di espressione del 8 selezionato miRNA tra donatori sani e pazienti affetti da cancro del polmone sono stati confrontati, si è constatato che questi miRNA sono fortemente deregolamentati nei campioni clinici analizzati. Nella figura 3 il pattern di espressione dei miRNA 8 selezionata viene visualizzata su una scala logaritmica per i 12 campioni analizzati (PAD1-12). Non tutti miRNA erano rilevabili in ogni campione ea causa della quantità limitata di campioni non possiamo effettuare analisi statistiche.
Figura 1. Analisi Western Blot in 3 campioni Exosomal per ALIX e Tsg101. Il Western Blot mostra la presenza dii ben noti marcatori exosomal Alix e STG-101, nei campioni analizzati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi TEM di Exosomal campioni Questi risultati dimostrano che i nanovesicles isolate hanno un diametro medio, tra il 40 -.. 100 nm, all'interno della gamma exosomal Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Espressione del profilo di 8 miRNA selezionati in Exosomal campioni. Questi dati, riportati in scala logaritmica, dimostrare che through questo protocollo è fattibile per vedere up- o down-regulation dei miRNA exosomal selezionati da pazienti NSCLC plasmatici clinici (PAD1-12), che porta a potenziale scoperta di biomarcatori exosomal di NSCLC. I dati sono mostrati come piega di espressione rispetto ai controlli sani. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Con questo protocollo combinato è stato possibile eseguire un'analisi exosomal miRNA dal plasma di pazienti con NSCLC. Questi dati possono riflettere lo stato della malattia, ma questo deve essere confermato da ulteriori studi.
Il protocollo utilizzato in questo articolo è basato su un kit commerciale per l'isolamento exosome. La ragione è che le altre procedure di isolamento noto (ad es., La densità ultracentrifugazione gradiente) richiedono procedure più manuali, portando ad una standardizzazione limitata. Tuttavia, uno dei limiti di questo protocollo è che in confronto con ultracentrifugazione gradiente di densità per isolamento exosome, gradiente di densità ultracentrifugazione rimane una tecnica molto utile in isolamento exosome che sfrutta la densità specifica di exosomes (tra 1.13 - 1,19 g / ml). Una modifica potenziale è un mix di entrambe le procedure, che potrebbe essere un gold standard in questo campo.
La possibilità di elaborare sampl clinicaes con trattamento RNAsi ci ha dato campioni puri senza contaminazione di circolazione miRNA. Tuttavia, la presenza di RNasi enzimi nei campioni potrebbe influenzare la quantità di exosomal miRNA dopo exosome lisi. Per questo motivo abbiamo scelto un kit con trattamento proteinasi K, al fine di eliminare le proteine circolanti contaminanti e per degradare gli enzimi RNasi.
Dopo la normalizzazione di tutte le procedure di isolamento, il futuro caratterizzazione e analisi miRNA di questi dati possono formare un utile strumento per individuare biomarker in modo non invasivo durante diagnosi iniziale e di follow-up.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1 ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
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