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गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) मरीजों के प्लाज्मा में Exosomal miRNA विश्लेषण qPCR के माध्यम से: एक व्यवहार्य लिक्विड बायोप्सी उपकरण

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

NSCLC (गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर) के रोगियों में कम जीवित रहने की दर मुख्य रूप से उन्नत रोग और गरीब जल्दी पता लगाने 1 में उपचार के सीमित प्रभावकारिता के कारण है। EGFR जीन म्यूटेशन में सक्रिय हैं, कि NSCLC रोगियों की एक उप-जनसंख्या में खोज की गई है, काइनेज अवरोधकों (TKIs) tyrosine के प्रति संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए जाना जाता है। दुर्भाग्य से, EGFR उत्परिवर्तित NSCLC रोगियों के बहुमत TKI प्रतिरोध 2 का विकास। खास तौर पर इस संदर्भ में, एक सही निदान अनिवार्य है। सामान्य, ट्यूमर के स्थानीयकरण, के कारण NSCLC में बायोप्सी ऊतक प्राप्त करने में हमेशा संभव नहीं है। इसलिए, कई अध्ययनों से चल रही है कि गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग इन जैविक डेटा प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। Exosomes तरल बायोप्सी घटक है कि आदेश गैर इनवेसिव तकनीक 3 के साथ नैदानिक ​​और शकुन मूल्यों को प्राप्त करने के लिए जांच की जा सकता है के रूप में वर्णित हैं।

ई - (100 एनएम व्यास 40) Exosomes nanovesicles हैंndocytic मूल है कि दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति 4 में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है। वे प्रोटीन, लिपिड, mRNA और microRNAs ले जा सकता है। इसके अलावा, कई अध्ययनों से ट्यूमर निकाली गई exosomes है, जो ट्यूमर कोशिकाओं, angiogenesis, stromal और बाह्य मैट्रिक्स remodeling और दवा प्रतिरोध 5 के विकास और अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं की एक pleiotropic भूमिका सुझाव देते हैं।

MicroRNAs (miRNAs) लघु गैर-कोडिंग आरएनए कि, बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में शामिल कर रहे हैं लक्ष्य mRNAs का 3'-UTR बंधन और क्षरण करने के लिए या एक गैर अनुवाद करने के लिए 6 mRNA अग्रणी रहे हैं। exosomes में miRNAs के चुनिंदा छँटाई वर्णित किया गया है। इस संदर्भ में, हाल ही में इन विट्रो और इन विवो में प्रदर्शन किया गया था, curcumin उपचार के बाद 7 पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया सेल लाइनों द्वारा जारी exosomes में मीर -21 (ऑन्कोजेनिक प्रभाव के साथ एक प्रसिद्ध miRNA) के एक चयनात्मक पैकेजिंग।

exosomal miRNA प्रोफ़ाइल प्राथमिक ट्यूमर के miRNA प्रोफ़ाइल के समान है और इस सुविधा शीघ्र निदान और रोग का निदान 3 में शोषण किया जा सकता है। विशेष रूप से, वहाँ चिह्नित करने के लिए, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा एक संभावना है, रोग के आणविक प्रोफाइल, साथ सहसंबद्ध चयन किया miRNAs जैसे।, दूसरों के बीच में 8 EGFR म्यूटेशन।

इधर, NSCLC सहसंबद्ध miRNAs 8-9 के एक चयनित पैनल के विश्लेषण में वर्णित है कि NSCLC रोगियों के रक्त में जारी exosomes से अलग थे जाता है। मरीजों से सहमति की रिपोर्ट को सूचित प्राप्त करने के बाद, 12 NSCLC रोगियों और 6 स्वस्थ नियंत्रण के प्लाज्मा, विश्लेषण किया गया। exosome अलगाव निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक किट के साथ प्रदर्शन किया गया था। exosome अलगाव से पहले, प्लाज्मा नमूनों आदेश संदूषक घूम miRNAs नीचा करने में, RNase के साथ इलाज किया गया। हम अन्य तकनीक की सीमित मानकीकरण के कारण एक वाणिज्यिक किट के साथ इस विश्लेषण प्रदर्शन करने का निर्णय लियासवाल (जैसे।, ultracentrifugation), जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब नैदानिक ​​नमूनों के साथ काम कर रहे हैं। इस किट में एक proteinase कश्मीर इलाज है, जो RNAse नीचा दिखाना होगा, और इस तरह जोखिम exosome सेल के बाद exosomal miRNAs नीचा करने के लिए कम हो जाती है। MicroRNA विश्लेषण संवेदनशील और विशिष्ट रियल-टाइम पीसीआर विश्लेषण द्वारा किया गया था; ΔΔct - मीर 1228-3p सूत्र 2 के अनुसार एक अंतर्जात नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और डेटा सामान्यीकृत थे। नियंत्रण मूल्यों आधार रेखा के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और परिणाम एक लघुगणकीय पैमाने में दिखाया जाता है।

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Protocol

1. Exosome अलगाव

नोट: प्लाज्मा नमूनों से exosomes के अलगाव, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार और उनका कहना है RNAse उपचार से, एक वाणिज्यिक किट के साथ प्रदर्शन किया गया था: (इन सभी चरणों व्यक्तिगत और पर्यावरण सुरक्षा उपकरणों और जैविक नमूने के हेरफेर के लिए विशिष्ट कानूनी प्रक्रिया का पालन के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए )।

  1. प्रत्येक नमूने की प्लाज्मा के 1 मिलीलीटर, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ले लो, और बर्फ पर जगह है।
  2. आरटी पर 20 मिनट के लिए 2,000 × छ पर नमूना अपकेंद्रित्र; इस मार्ग कोशिकाओं और मलबे को हटाने के क्रम में अनिवार्य है।
  3. एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को स्वच्छ प्लाज्मा युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  4. आरटी पर 20 मिनट के लिए 10,000 × छ पर नया ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  5. एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को स्वच्छ प्लाज्मा युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  6. में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला को RNAse के 100 एनजी / एमएल जोड़ें और ट्यूब सेतेआदेश RNAs घूम नीचा करने के लिए।
  7. एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सभी का इलाज किया प्लाज्मा स्थानांतरण और 1x पीबीएस के 0.5 मात्रा में जोड़ें।
  8. आदेश समाधान मिश्रण करने में नमूना भंवर।
  9. Proteinase कश्मीर समाधान (किट में लगा देना) नमूना के 0.05 मात्रा में जोड़ें।
  10. भंवर नमूना और फिर 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. नमूने के लिए exosome वर्षा बफर के 0.2 मात्रा में जोड़ें और उलटा द्वारा समाधान मिश्रण।
  12. 30 मिनट के लिए 8 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं और फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए 10,000 × छ पर नमूना अपकेंद्रित्र।
  13. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली पृथक exosomes में शामिल है।
  14. आदेश exosomes resuspend करने में exosome गोली चयनित बफर जोड़ें। बफर के चयन की योजना बनाई बहाव के विश्लेषण पर निर्भर करता है इस मामले में:
    1. आदेश में मंदिर विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए 1x पीबीएस के 100 μl जोड़ें।
    2. विशेष सेल buf के 346.5 μl जोड़ेशाही सेना निष्कर्षण (वाणिज्यिक किट से) (: रासायनिक खतरा चेतावनी) के लिए Fer।
    3. प्रोटीन निकासी के लिए lysis बफर के 100 μl जोड़ें (Tris एचसीएल 50 मिमी पीएच 7.6 - सोडियम क्लोराइड 300 मिमी - ट्राइटन X-100 0.5% - PMSF 1 मिमी - leupeptin / Aprotinin 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के क्रम में पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण प्रदर्शन करने में। (चेतावनी: रासायनिक खतरों)।
  15. दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर resuspended exosomes।

2. Exosome विशेषता पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा

नोट: पृथक nanovesicles को चिह्नित करने के लिए, एलिक्स और TSG101 (प्रसिद्ध exosomal मार्कर) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता की सिफारिश की है।

  1. Lysis बफर में exosome गोली के मेजबान के बाद, क्रम exosomal झिल्ली भंग करने के लिए 1 घंटे के लिए बर्फ पर जगह है।
  2. 10 मिनट के लिए 12,000 ग्राम में lysate अपकेंद्रित्र और गोली परेशान बिना एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  3. कुल exosomal प्रोटीन सामग्री के योंब्रैडफोर्ड परख या अन्य तरीकों से टी और लोड एक Tris / ग्लाइसिन एसडीएस में अच्छी तरह से प्रति प्रोटीन की 50 ग्राम - 8% polyacrylamide जेल। (चेतावनी: रासायनिक खतरों)।
  4. रासायनिक खतरों: चल बफर (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस) 1 घंटे के लिए और 120 वी पर 30 मिनट (चेतावनी के साथ 8% एसडीएस पृष्ठ जेल वैद्युतकणसंचलन में प्रोटीन (और एक उचित आणविक वजन मार्कर) अलग )।
  5. (: रासायनिक खतरों चेतावनी) लगातार 50 वी पर 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ठंड स्थानांतरण बफर (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 20% मेथनॉल) के साथ electroblotting द्वारा एक nitrocellulose झिल्ली प्रोटीन स्थानांतरण।
  6. 5% 1x टीबीएस -Tween 0.1% में गैर वसा शुष्क दूध के साथ धीमी गति से आंदोलन में 1 घंटे के लिए झिल्ली ब्लॉक।
  7. बीच 0.1% - 1x टीबीएस के साथ तेजी से आंदोलन में 5 मिनट के लिए झिल्ली धो 4 बार।
  8. एलिक्स और TSG101 (झिल्ली प्रति एक) उचित बफर के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (तदनुसार निर्माता से एंटीबॉडी पत्रक के लिए) और सेते झिल्ली हे / एन; धीमी गति से आंदोलन में।
  9. अत्यधिक एंटीबॉडी को दूर करने के क्रम में बीच 0.1% - झिल्ली धो 1x टीबीएस के साथ तेजी से आंदोलन में 5 मिनट के लिए 5 बार।
  10. उचित माध्यमिक एंटीबॉडी उचित बफर में (निर्माता से एंटीबॉडी datasheet के हिसाब से) जोड़ें और धीमी गति से आंदोलन में 1 घंटे के लिए झिल्ली सेते हैं।
  11. अत्यधिक एंटीबॉडी को दूर करने के क्रम में बीच 0.1% - झिल्ली धो 1x टीबीएस के साथ तेजी से आंदोलन में 5 मिनट के लिए 5 बार।
  12. Chemiluminescence विश्लेषण 11 द्वारा चयनित प्रोटीन का पता लगाने।

3. Exosome विशेषता मंदिर विश्लेषण द्वारा

नोट: पृथक exosomes कल्पना करने के लिए, मंदिर (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) विश्लेषण किया गया था।

  1. प्लेस ~ 10 माइक्रोग्राम एक parafilm पर 1x पीबीएस में resuspended बरकरार exosomes के नमूने की (पहले ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मात्रा) और नमूना पर डाल दिया 1 घंटे के लिए एक formvar कार्बन लेपित निकल ग्रिड ड्रॉप।
    2. <li> तीन 40 μl पर यह स्थिति 1x पीबीएस बूंदों से ग्रिड 3 बार धोएं।
  2. पांच से 30 μl ultrapure पानी की बूंदों पर यह स्थिति से ग्रिड धो 5 बार।
  3. 10 मिनट के लिए 2.5% glutaraldehyde (रासायनिक खतरा चेतावनी) की एक बूंद जोड़कर नमूना ठीक करें।
  4. तीन 40 μl पर यह स्थिति 1x पीबीएस बूंदों से ग्रिड 3 बार धोएं।
  5. 2% uranyl एसीटेट की एक बूंद जोड़ें (चेतावनी: रासायनिक खतरों) और आदेश नमूना इसके विपरीत करने के लिए 15 मिनट के लिए यह की चोटी पर ग्रिड डाल दिया।
  6. 0.13% methylcellulose की एक बूंद पर नमूना एम्बेड (चेतावनी: रासायनिक खतरों) और 0.4% uranyl एसीटेट और 10 मिनट के लिए ड्रॉप के शीर्ष पर ग्रिड सेते हैं।
  7. धीरे एक दिलचस्प कागज के साथ तरल अधिक दूर और लेपित पक्ष के साथ 5 मिनट के लिए ग्रिड सूखी।
  8. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 12 से ग्रिड की जांच करना।

4. Exosomal शाही सेना निकालना और मात्रा का ठहराव

नोट: हम perf करने का निर्णय लियाएक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर exosomal नमूनों से कुल शाही सेना निकासी ORM निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार: (चेतावनी: रासायनिक खतरों, निर्माता प्रोटोकॉल और दिशा निर्देशों की समीक्षा)।

  1. lysis बफर के 346.5 μl में exosome गोली के मेजबान के बाद, β-mercaptoethanol के 3.5 μl जोड़ने (चेतावनी: रासायनिक खतरों) और भंवर सख्ती; इस मार्ग आदेश लिपिड झिल्ली को नष्ट करने के लिए अनिवार्य है।
  2. 1 मिनट के लिए 11,000 × छ पर एक संग्रह ट्यूब और अपकेंद्रित्र में वाशिंग स्तंभ के लिए lysate जोड़ें। centrifugation के बाद, स्तंभ त्यागने और एक नया 1.5 मिलीलीटर RNase मुक्त ट्यूब को छानना हस्तांतरण।
  3. 70% इथेनॉल के 350 μl जोड़ें (चेतावनी: रासायनिक खतरों) और 5 सेकंड के लिए vortexing द्वारा मिश्रण।
  4. पर 8000 × छ 30 सेकंड के लिए हल करने के स्तंभ और अपकेंद्रित्र में lysate लोड। centrifugation के बाद, flowthrough त्यागने और एक नया संग्रह ट्यूब के लिए स्तंभ हस्तांतरण।
  5. desalting buffe के 350 μl लोडआर और पर 1 मिनट के लिए 11,000 × छ सेंट्रीफ्यूज। centrifugation के बाद, flowthrough त्यागने और एक ही संग्रह ट्यूब में स्तंभ वापसी।
  6. स्तंभ की सिलिका झिल्ली पर DNase मैं प्रतिक्रिया मिश्रण के 95 μl (पुनर्गठन DNase के 10 μl मैं, DNase बफर के 90 μl + प्रत्येक नमूने के लिए) जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। (चेतावनी: रासायनिक खतरा)
  7. 1 मिनट के लिए कम से 11,000 × छ स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए: (रासायनिक खतरा चेतावनी) धोने बफर के 200 μl जोड़ें। स्तंभ एक नया संग्रह ट्यूब में रखें।
  8. 1 मिनट के लिए कम से 11,000 × छ स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज को धोने बफर के 600 μl जोड़ें। centrifugation के बाद, flowthrough त्यागने और एक ही संग्रह ट्यूब में स्तंभ जगह है।
  9. 2 मिनट के लिए कम से 11,000 × छ स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज को धोने बफर के 250 μl जोड़ें। स्तंभ एक 1.5 मिलीलीटर RNase मुक्त ट्यूब में रखें।
  10. 11,000 पर RNase मुक्त पानी के 40 μl में शाही सेना और सेंट्रीफ्यूज Elute 5; 1 मिनट के लिए जी, क्रम में इस छोटी मात्रा में एक उच्च आरएनए एकाग्रता है।
  11. बर्फ पर तुरंत eluted आरएनए जगह -80 डिग्री सेल्सियस पर संभावित गिरावट या दुकान को रोकने के लिए।
  12. आरएनए सामग्री यों। नोट: यहाँ, आरएनए परिमाणीकरण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से नमूने के 1 μl का उपयोग करके किया गया था।

5. Exosomal miRNAs की Retrotrascription

नोट: कारण exosomes में miRNAs सामग्री की वर्णित सीमित मात्रा में करने के लिए, यह एक वाणिज्यिक किट प्रत्येक miRNA के लिए एक व्यक्ति को परख का उपयोग कर के माध्यम से चयनित miRNAs की रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करने का फैसला किया गया था, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार। प्रत्येक नमूने के लिए, 8 miRNAs NSCLC स्थिति के लिए सहसंबद्ध (मीर 30B चयन किया गया था, मीर 30c, मीर 103, मीर 122, मीर 195, मीर 203, मीर 221, मीर 222, और मीर 1228- 3 पी अंतर्जात नियंत्रण के रूप में)।

  1. रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण (आरटी मिश्रण) तैयार करें। में वर्णित के रूप में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, आरटी मिश्रण के 7 μl तैयारhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें) (चेतावनी: रासायनिक खतरा)।
    नोट: इस प्रयोग में, 9 अलग आरटी मिश्रण प्रत्येक नमूना के लिए तैयार थे।
  2. धीरे मिक्स और बर्फ पर आरटी मिश्रण की दुकान। प्रतिक्रिया ट्यूब प्रति आरटी मिश्रण के 7 μl जोड़ें।
  3. नमूना शाही सेना (कुल शाही सेना के 10 माइक्रोग्राम) प्रतिक्रिया ट्यूब प्रति के 5 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण।
  4. प्रत्येक परख इसी प्रतिक्रिया ट्यूब में सेट से: (रासायनिक खतरा चेतावनी) 5x रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमरों के 3 μl जोड़ें।
  5. धीरे-धीरे मिक्स, ट्यूब बंद करने और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  6. थर्मल cycler में प्रतिक्रिया ट्यूब लोड और 30 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर निम्न पैरामीटर मान (पकड़ का उपयोग कर रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया शुरू, 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर पकड़, 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर पकड़; पकड़ ∞ 4 सी)।

6. रीयल टाइम पीसीआर Exosomal miRNAs का विश्लेषण

नोट: यह विश्लेषण किया गयारियल टाइम पीसीआर (qPCR) के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग नमूना प्रति तीन जैविक और तकनीकी प्रतिकृति के साथ प्रदर्शन किया।

  1. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, (पीसीआर मास्टर मिक्स + Nuclease मुक्त पानी की 7.67 μl के 10 μl) रीयल टाइम पीसीआर मिश्रण के 17.67 μl तैयार करते हैं, यह मिश्रण और बर्फ पर डाल दिया। (चेतावनी: रासायनिक खतरा)
  2. (: रासायनिक खतरा चेतावनी) 1 μl, प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए 20x qPCR प्राइमरों के जोड़ें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से थाली में qPCR मिश्रण का 18.67 μl रखें।
  4. संवाददाता अच्छी तरह से थाली में रिवर्स प्रतिलेखन उत्पाद का 1.33 μl जोड़ें।
  5. प्लेट बंद करो और यह (300 GX 5 सेकंड) स्पिन।
  6. एक रीयल टाइम पीसीआर प्रणाली में थाली डालें और निम्न पीसीआर शर्तों का उपयोग रन शुरू: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पकड़; 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड और 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के 40 चक्रों। ΔΔct 13 - प्रक्रिया और सूत्र के अनुसार 2 डेटा मानक के अनुसार।

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Representative Results

NSCLC रोगियों के 12 प्लाज्मा और 6 स्वस्थ नियंत्रण के कुल प्लाज्मा से exosome अलगाव के लिए वाणिज्यिक किट के साथ प्रोसेस किया गया। प्रत्येक नमूना आदेश exosomal मार्कर एलिक्स (96 केडीए) और TSG101 (43 केडीए) का मूल्यांकन करने में वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण द्वारा संसाधित किया गया था। इन परिणामों का एक उदाहरण चित्रा 1 में 3 नमूने लिए दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि प्लाज्मा नमूनों से exosome अलगाव इस प्रोटोकॉल के साथ संभव है।

आदेश biophysically exosomal नमूनों को चिह्नित करने के लिए, मंदिर विश्लेषण किया गया था। मंदिर से पता चला है कि nanovesicles इस अलगाव प्रोटोकॉल के द्वारा प्राप्त exosomal आकार की सीमा में एक आकार औसत है, 40 के बीच - 100 एनएम (चित्रा 2)।

exosome अलगाव और लक्षण के बाद, हम उनकी miRNAs सामग्री की जांच की। हम 8 विशिष्ट miRNAs, deregulat होने के लिए जाना चुने गएNSCLC में एड। आंतरिक नियंत्रण के रूप में, हम मीर 1228 है कि पहले से विभिन्न प्रकार के ट्यूमर 10 में एक स्थिर और कुशल अंतर्जात नियंत्रण के रूप में मान्य किया गया है इस्तेमाल किया। इन परिणामों के अनुसार मीर 1228 एक विश्वसनीय और स्थिर अंतर्जात नियंत्रण है। जब 8 स्वस्थ दाताओं और फेफड़ों के कैंसर के रोगियों के बीच miRNA से चयनित की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में थे, यह पाया गया है कि इन miRNAs दृढ़ता से विश्लेषण किया नैदानिक ​​नमूनों में नियंत्रण मुक्त कर रहे हैं। चित्रा 3 में 8 से चयनित miRNAs की अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया 12 नमूने (PAD1-12) के लिए एक लघुगणकीय पैमाने पर दिखाया गया है। नहीं सभी miRNAs हर नमूने में पहचाने जा रहे थे और नमूनों की सीमित मात्रा के कारण हम सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन नहीं कर सकते।

आकृति 1
चित्रा एलिक्स और TSG101 के लिए 3 Exosomal नमूने में 1. वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण। वेस्टर्न ब्लाट की मौजूदगी से पता चलता हैजाने-माने exosomal मार्कर, एलिक्स और टीएसजी-101, विश्लेषण नमूनों में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मंदिर Exosomal नमूनों के विश्लेषण से ये परिणाम दिखाना है कि पृथक nanovesicles एक व्यास के औसत है, 40 के बीच -।। 100 एनएम, exosomal सीमा के अंदर यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा Exosomal नमूने में 8 चुने miRNAs की 3. अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल। इन आंकड़ों, लघुगणकीय पैमाने में दिखाया गया है, कि throug का प्रदर्शनज इस प्रोटोकॉल के ऊपर देखते हैं या नीचे विनियमन नैदानिक ​​NSCLC प्लाज्मा रोगियों (PAD1-12) से चयनित exosomal miRNAs की, NSCLC के exosomal बायोमार्कर की खोज के संभावित करने के लिए अग्रणी करने के लिए संभव है। डेटा अभिव्यक्ति स्वस्थ नियंत्रण के सापेक्ष के गुना के रूप में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस संयुक्त प्रोटोकॉल के साथ यह NSCLC रोगियों के प्लाज्मा से एक exosomal miRNA विश्लेषण करने के लिए संभव था। इन आंकड़ों से रोग की स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, लेकिन यह आगे के अध्ययन से इस बात की पुष्टि करने की जरूरत है।

इस लेख में इस्तेमाल प्रोटोकॉल exosome अलगाव के लिए एक वाणिज्यिक किट पर आधारित था। कारण यह है कि अन्य ज्ञात अलगाव प्रक्रियाओं (जैसे।, घनत्व ढाल ultracentrifugation) अधिक मैनुअल प्रक्रियाओं की आवश्यकता, एक सीमित मानकीकरण के लिए अग्रणी था। फिर भी, इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक है कि exosome अलगाव के लिए घनत्व ढाल ultracentrifugation के साथ तुलना में, घनत्व ढाल ultracentrifugation एक बहुत ही उपयोगी exosome अलगाव में (- 1.19 ग्राम / मिलीलीटर 1.13 के बीच) है कि exosomes के विशिष्ट घनत्व कारनामे तकनीक बनी हुई है। एक संभावित संशोधन दोनों प्रक्रियाओं, जो इस क्षेत्र में एक स्वर्ण मानक हो सकता है की एक मिश्रण है।

संभावना नैदानिक ​​sampl संसाधित करने के लिएRNase उपचार के साथ es miRNAs घूम के प्रदूषण के बिना हमें शुद्ध नमूने दे दी है। हालांकि, RNase की उपस्थिति के नमूनों में एंजाइमों exosome सेल के बाद exosomal miRNA की राशि प्रभाव सकता है। इस कारण से हम आदेश घूम दूषित पदार्थों को समाप्त करने के लिए प्रोटीन और RNase एंजाइमों नीचा करने में proteinase कश्मीर उपचार के साथ एक किट चुना है।

सभी अलगाव प्रक्रियाओं के मानकीकरण के बाद, भविष्य लक्षण और इन आंकड़ों के विश्लेषण miRNA प्रारंभिक निदान के दौरान एक गैर इनवेसिव रास्ते में बायोमार्कर का पता लगाने और अनुवर्ती करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बना सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

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References

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चिकित्सा अंक 111 Exosomes miRNAs NSCLC लिक्विड बायोप्सी कर्क Biomarker
गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) मरीजों के प्लाज्मा में Exosomal miRNA विश्लेषण qPCR के माध्यम से: एक व्यवहार्य लिक्विड बायोप्सी उपकरण
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Giallombardo, M., Chacártegui… More

Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

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