Introduction
Le faible taux de survie dans le CPNPC (cancer non à petites cellules du poumon) des patients est principalement due à l'efficacité limitée des traitements dans la maladie avancée et la détection précoce pauvres 1. Des mutations activatrices du gène EGFR, qui ont été découverts dans une sous - population de patients atteints de CPNPC, sont connus pour conférer une sensibilité à la tyrosine kinase (ITK inhibiteurs). Malheureusement, la majorité des patients atteints de CPNPC EGFR muté développent une résistance de TKI 2. Surtout dans ce contexte, un diagnostic correct est obligatoire. D'une manière générale, en raison de la localisation de tumeurs, l'obtention d'un tissu de biopsie dans NSCLC est pas toujours possible. Par conséquent, plusieurs études sont en cours qui utilisent des méthodes non invasives pour obtenir ces données biologiques. Les exosomes sont décrits comme composants de biopsie liquides qui pourraient être étudiés afin d'obtenir des valeurs diagnostiques et pronostiques avec des techniques non-invasives 3.
Les exosomes sont des nanovésicules (40-100 nm de diamètre) de l'eorigine ndocytic qui sont libérés par les différents types de cellules à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques 4. Ils peuvent transporter des protéines, des lipides, des ARNm et microARN. En outre, plusieurs études suggèrent un rôle pleiotrope des exosomes tumorales dérivées qui peuvent influencer la croissance et la survie des cellules tumorales, l' angiogenèse, stroma et la matrice extracellulaire et le remodelage 5 résistance aux médicaments.
Les microARN (miARN) sont courts ARN non codantes qui sont impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle, liant l'extrémité 3 'UTR des ARNm cibles et conduisant l'ARNm à la dégradation ou à une non-traduction 6. Le tri sélectif des miARN dans exosomes a été décrite. Dans ce contexte, il a récemment été démontré in vitro et in vivo, un emballage sélectif de miR-21 (un miARN bien connu des effets oncogenes) dans les exosomes libérés par les lignées cellulaires de la leucémie myéloïde chronique après traitement curcumine 7.
leprofil exosomal miARN est similaire au profil miRNA de la tumeur primitive et cette caractéristique peut être exploitée dans le diagnostic précoce et le pronostic 3. Plus précisément, il est possible de caractériser, par PCR en temps réel miARN sélectionnés en corrélation avec le profil moléculaire de la maladie, par exemple., Les mutations de l' EGFR , entre autres 8.
Ici, l'analyse d'un panel sélectionné de NSCLC corrélé miARN 8-9 est décrite qui ont été isolés à partir des exosomes libérés dans le sang des patients atteints de CPNPC. Après avoir obtenu le rapport de consentement informer des patients, le plasma de 12 patients atteints de CPNPC et 6 témoins en bonne santé, ont été analysés. L'isolement exosomes a été réalisée avec le kit commercial en suivant le protocole du fabricant. Avant l'isolement exosomes, des échantillons de plasma ont été traités avec la RNase, afin de dégrader les contaminants circulant miARN. Nous avons décidé d'effectuer cette analyse avec un kit commercial en raison de la normalisation limitée d'autres techniques (par ex., l' ultracentrifugation) , ce qui est particulièrement important lorsque l'on travaille avec des échantillons cliniques. Ce kit comprend un traitement à la protéinase K, ce qui dégrade la RNAse, et diminue ainsi le risque de se dégrader miARN exosomales après exosomes lyse. l'analyse de micro-ARN a été réalisée par une analyse sensible et spécifique PCR en temps réel; miR-1228-3p a été utilisé comme contrôle endogène et les données ont été normalisés selon la formule 2 - ΔΔct. Les valeurs de contrôle sont utilisés comme référence et les résultats sont présentés sur une échelle logarithmique.
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Protocol
1. Exosome Isolation
Note: L'isolement des exosomes à partir d'échantillons de plasma, a été réalisée avec un kit commercial, selon le protocole du fabricant et en ajoutant le traitement RNAse: (toutes ces étapes doivent être effectuées avec des équipements de protection individuelle et de l'environnement et suivants procédure juridique spécifique pour la manipulation d'échantillons biologiques ).
- Prendre 1 ml de plasma de chaque échantillon, stockés à -80 ° C, et le placer sur la glace.
- Centrifuger l'échantillon à 2000 × g pendant 20 min à température ambiante; ce passage est obligatoire afin d'éliminer les cellules et les débris.
- Transférer le surnageant contenant le plasma propre à un nouveau tube de 1,5 ml.
- Centrifuger le nouveau tube à 10.000 x g pendant 20 min à température ambiante.
- Transférer le surnageant contenant le plasma propre à un nouveau tube de 1,5 ml.
- Ajouter 100 ng / ml de RNAse au surnageant et on incube le tube à 37 ° C pendant 10 minafin de dégrader les ARN circulant.
- Transférer tout le plasma traité à un nouveau tube de 2 ml et ajouter 0,5 volume de PBS 1x.
- Vortex l'échantillon afin de mélanger les solutions.
- Ajouter 0,05 volumes de solution de proteinase K (joindre dans le kit) à l'échantillon.
- Tourbillon l'échantillon et ensuite incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Ajouter 0,2 volume de tampon de précipitation exosomes à l'échantillon et mélanger la solution par inversion.
- Incuber l'échantillon à 2 ° C à 8 ° C pendant 30 min, puis centrifuger l'échantillon à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer et jeter le surnageant. Le culot contient les exosomes isolés.
- Ajouter un tampon sélectionné au culot exosomes afin de remettre en suspension les exosomes. La sélection de la mémoire tampon dépend de l'analyse en aval prévu, dans ce cas:
- Ajouter 100 ul de PBS 1x afin d'effectuer une analyse de TEM.
- Ajouter 346,5 pi de lyse buf spécifiquefer pour l'extraction de l'ARN (de kit commercial) (ATTENTION: risques chimiques).
- Ajouter 100 pi de tampon de lyse pour l'extraction de la protéine (mM à pH 7,6 Tris-HCl 50 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - leupeptine / aprotinine 10 ug / ml) afin d'effectuer une analyse Western Blot. (ATTENTION: risques chimiques).
- Stocker les exosomes remises en suspension à -20 ° C.
2. Exosome Caractérisation par Analyse Western Blot
Remarque: Afin de caractériser les nanovésicules isolés, western blot avec des anticorps contre ALIX et TSG101 (Marqueurs exosomales bien connus) est recommandé.
- Après la remise en suspension du culot exosomes dans un tampon Lysis, placez-le sur la glace pendant 1 heure afin de dissoudre la membrane exosomal.
- Centrifuger le lysat à 12000 g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot.
- Quantifier le total conten de protéine exosomalt par le dosage de Bradford ou d'autres méthodes et de la charge 50 pg de protéines par puits dans un tampon Tris / Glycine SDS - gel de Polyacrylamide à 8%. (ATTENTION: risques chimiques).
- Séparer les protéines (et un marqueur approprié de poids moléculaire) dans électrophorèse 8% de gel SDS-PAGE avec un tampon en cours d'exécution (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS à 0,1%) pendant 1 heure et 30 min à 120 V. (ATTENTION: risques chimiques ).
- Transférer la protéine à une membrane de nitrocellulose par électrotransfert avec 4 ° C tampon de transfert à froid (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 20% de méthanol) pendant 1 h à température constante de 50 V. (ATTENTION: risques chimiques).
- Bloquer la membrane pendant 1 h dans une agitation lente avec 5% de lait sec non gras dans 1x TBS -Tween 0,1%.
- Laver la membrane 4 fois pendant 5 min dans une agitation rapide avec 1x TBS - Tween 0,1%.
- Ajouter les anticorps primaires contre ALIX et TSG101 (une par membrane) dans un tampon approprié (en conséquence à la fiche technique d'anticorps du fabricant) et incuber la membrane O / N; Dans une agitation lente.
- Laver la membrane 5 fois pendant 5 min dans une agitation rapide avec 1x TBS - Tween 0,1% afin d'éliminer l'anticorps excessive.
- Ajouter l'anticorps secondaire approprié dans un tampon approprié (en conséquence à la fiche technique d'anticorps du fabricant) et incuber la membrane pendant 1 h dans une agitation lente.
- Laver la membrane 5 fois pendant 5 min dans une agitation rapide avec 1x TBS - Tween 0,1% afin d'éliminer l'anticorps excessive.
- Détecter la protéine choisie par l' analyse de chimioluminescence 11.
3. Exosome Caractérisation par Analyse TEM
Remarque: Afin de visualiser les exosomes isolés, TEM (Transmission Electron Microscopy) analyse a été réalisée.
- Lieu ~ 10 ug (préalablement quantifiés par le dosage de Bradford) de l'échantillon d'exosomes intactes remises en suspension dans du PBS 1X sur un parafilm et de mettre l'échantillon tomber une grille de nickel revêtue de carbone Formvar pendant 1 heure. <li> Laver la grille 3 fois en le positionnant sur trois 40 pl PBS 1x gouttes.
- Laver la grille 5 fois en le positionnant sur cinq 30 ul de gouttes d'eau ultrapure.
- Fixer l'échantillon en ajoutant une goutte de 2,5% de glutaraldéhyde (ATTENTION: risque chimique) pendant 10 min.
- Laver la grille 3 fois en le positionnant sur trois 40 pl PBS 1x gouttes.
- Ajouter une goutte de 2% d'acétate d'uranyle (ATTENTION: risques chimiques) et de mettre la grille au-dessus de celui-ci pendant 15 minutes afin de comparer l'échantillon.
- Incluez l'échantillon sur une baisse de 0,13% de méthylcellulose (ATTENTION: risques chimiques) et 0,4% d'acétate d'uranyle et incuber la grille au-dessus de la goutte pendant 10 min.
- Retirez délicatement l'excès de liquide avec un papier absorbant et sécher la grille pendant 5 min avec la face enduite vers le haut.
- Examiner la grille par un microscope électronique à transmission 12.
4. exosomal ARN Extraction et quantification
Note: Nous avons décidé de perform l'extraction totale à partir d'échantillons exosomales en utilisant un kit commercial d'ARN, selon le protocole du fabricant: (ATTENTION: risques chimiques, examiner le protocole et les directives du fabricant).
- Après la remise en suspension du culot exosomes dans 346,5 pi de tampon de lyse, ajouter 3,5 ul de β-mercaptoéthanol (ATTENTION: risques chimiques) et vortex vigoureusement; ce passage est obligatoire afin de détruire les membranes lipidiques.
- Ajouter le lysat sur la colonne de lavage dans un tube collecteur et centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Après centrifugation, éliminer la colonne et le transfert du filtrat dans un nouveau tube de 1,5 ml sans RNase.
- Ajouter 350 ul de 70% d'éthanol (ATTENTION: risques chimiques) et mélanger par tourbillonnement pendant 5 secondes.
- Chargez le lysat dans la colonne de résolution et centrifugeuse pendant 30 secondes à 8000 × g. Après centrifugation, jeter le accréditive et transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte.
- Charger 350 pi de dessalage buffer et centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Après centrifugation, jeter le accréditive et retourner la colonne dans le même tube de collecte.
- Ajouter 95 ul de désoxyribonucléase I mélange réactionnel (10 ul de désoxyribonucléase I reconstitué + 90 ßl de tampon DNase, pour chaque échantillon) sur la membrane de silice de la colonne et incuber à température ambiante pendant 15 min à température ambiante. (ATTENTION: risque chimique)
- Ajouter 200 pi de tampon de lavage (ATTENTION: risques chimiques) à la colonne et centrifuger à 11000 × g pendant 1 min. Placer la colonne dans un nouveau tube de collecte.
- Ajouter 600 pl de tampon de lavage à la colonne et centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Après centrifugation, jeter accréditive et placer la colonne dans le même tube de collecte.
- Ajouter 250 pi de tampon de lavage à la colonne et centrifuger à 11 000 x g pendant 2 min. Placer la colonne dans un tube sans RNAse 1,5 ml.
- Eluer l'ARN dans 40 pi d'eau sans RNase et centrifuger à 11.000 5; g pendant 1 minute, afin d'avoir une forte concentration d'ARN dans ce petit volume.
- Immédiatement placer l'ARN élue sur la glace pour empêcher la dégradation potentielle ou conserver à -80 ° C.
- Quantifier le contenu de l'ARN. Remarque: Ici, la quantification de l'ARN a été réalisée en utilisant 1 pi de l'échantillon à travers un spectrophotomètre.
5. Retrotrascription des miARN exosomal
Remarque: En raison de la quantité limitée décrite de contenu miARN dans exosomes, il a été décidé d'effectuer la transcription inverse de miARN sélectionnés par le biais d'un kit commercial en utilisant un test individuel pour chaque miARN, selon le protocole du fabricant. Pour chaque échantillon, 8 miARN corrélées au statut NSCLC ont été sélectionnés (miR-30b; miR-30c; miR-103, miR-122, miR-195, miR-203, miR-221, miR-222 et miR-1228- 3p comme contrôle endogène).
- Préparer le mélange maître de transcription inverse (RT mix). Pour chaque réaction préparer 7 pi de mélange de RT, comme décrit danshttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (cliquez ici pour télécharger) (ATTENTION: risque chimique).
Remarque: Dans cette expérience, 9 mix RT différents ont été préparés pour chaque échantillon. - Mélanger délicatement et stocker le mélange RT sur la glace. Ajouter 7 pl de RT mélange par tube de réaction.
- Ajouter 5 pi d'ARN de l'échantillon (10 ug d'ARN total) par tube de réaction et mélanger doucement.
- Ajouter 3 pi des amorces de transcription inverse 5x (ATTENTION: risque chimique) de chaque essai fixé dans le tube de réaction correspondante.
- Mélanger lentement, fermer le tube et incuber sur la glace pendant 5 min.
- Chargez le tube de réaction dans le cycleur thermique et commencer la réaction de transcription inverse en utilisant les valeurs des paramètres suivants (HOLD à 16 ° C pendant 30 min; TENIR à 42 ° C pendant 30 min; TENIR à 85 ° C pendant 5 min; TENIR ∞ 4 ° C).
6. Analyse PCR en temps réel de exosomal miARN
Note: Cette analyse a étéréalisée en utilisant un kit commercial pour PCR en temps réel (qPCR), avec trois répétitions biologiques et techniques par échantillon.
- Pour chaque réaction, préparer 17,67 pi de mélange PCR en temps réel (10 pl de PCR Master Mix + 7,67 ul d'eau exempte de nucléase), mélanger et mettre sur la glace. (ATTENTION: risque chimique)
- Ajouter 1 pl, pour chaque tube PCR, des amorces 20x qPCR (ATTENTION: risque chimique).
- Placez 18.67 ul du mélange qPCR dans chaque puits de plaque.
- Ajouter 1,33 ul du produit de transcription inverse dans le correspondant bien-plaque.
- Fermez la plaque et la faire tourner (300 gx 5 sec).
- Insérez la plaque dans un système PCR en temps réel et commencer la course en utilisant les conditions de PCR suivantes: HOLD à 95 ° C pendant 10 min; 40 cycles de 15 sec à 95 ° C et 60 sec à 60 ° C. Procédé et normaliser les données conformément à la formule 2 - 13 ΔΔct.
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Representative Results
Un total de 12 plasma de patients atteints de CPNPC et 6 témoins en bonne santé ont été traités avec le kit commercial pour l'isolement des exosomes du plasma. Chaque échantillon a été traité par une analyse Western Blot afin d'évaluer les marqueurs exosomales ALIX (96 kDa) et TSG101 (43 kDa). Un exemple de ces résultats est présentée pour 3 échantillons de la figure 1, ce qui indique que l' isolement d' exosomes à partir d' échantillons de plasma est réalisable avec ce protocole.
Afin de caractériser biophysique échantillons exosomales, l'analyse TEM a été réalisée. MET ont montré que les nanovésicules obtenus par ce protocole d'isolement ont une taille moyenne dans la gamme de taille de exosomal entre 40-100 nm (figure 2).
Après isolement et la caractérisation des exosomes, nous avons étudié leur contenu de miARN. Nous avons sélectionné 8 miARN spécifiques, connus pour être deregulated dans le CBNPC. Comme contrôle interne, nous avons utilisé miR-1228 qui a été préalablement validé comme un contrôle endogène stable et efficace dans les types 10 de tumeurs. Selon ces résultats miR-1228 est un contrôle endogène fiable et stable. Lorsque le niveau du 8 sélectionné miRNA entre donneurs sains et les patients atteints de cancer du poumon expression ont été comparés, il a été constaté que ces miARN sont fortement déréglementés dans les échantillons cliniques analysés. Dans la figure 3 , le schéma d'expression des miARN 8 sélectionnés est représentée sur une échelle logarithmique pour les 12 échantillons analysés (PAD1-12). tous les miARN étaient non détectable dans tous les échantillons et en raison de la quantité limitée d'échantillons nous ne pouvons pas effectuer des analyses statistiques.
Figure 1. Analyse par transfert de Western dans 3 échantillons exosomal pour Alix et TSG101. Le Western Blot montre la présence deles marqueurs exosomales bien connus, ALIX et STG-101, dans les échantillons analysés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. TEM Analyse des échantillons exosomal Ces résultats démontrent que les nanovésicules isolés ont un diamètre moyen, entre 40 -.. 100 nm, à l' intérieur de la plage de exosomal S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Profil d'expression de 8 miARN sélectionnés dans des échantillons exosomal. Ces données, présentées en échelle logarithmique, démontrer que through ce protocole est possible de voir le haut ou vers le bas-régulation des miARN exosomales choisis parmi les patients NSCLC plasmatiques cliniques (PAD1-12), conduisant à la découverte éventuelle de biomarqueurs exosomales de NSCLC. Les données sont présentées comme un facteur d'expression par rapport aux témoins sains. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Avec ce protocole combiné, il était possible d'effectuer une analyse exosomal miRNA à partir du plasma de patients atteints de CPNPC. Ces données peuvent refléter l'état de la maladie, mais cela doit être confirmé par une étude plus approfondie.
Le protocole utilisé dans cet article était basé sur un kit commercial pour l'isolement des exosomes. La raison en est que les autres procédés d'isolement connus (par ex., Une ultracentrifugation à gradient de densité) nécessitent des procédures plus manuelles, ce qui conduit à une uniformisation limitée. Néanmoins, l'une des limites de ce protocole est que, en comparaison avec un gradient de densité ultracentrifugation pour l'isolement des exosomes, gradient de densité ultracentrifugation reste une technique très utile dans l'isolement de exosomes qui exploite la densité spécifique des exosomes (entre 1.13 à 1.19 g / ml). Une modification potentielle est un mélange des deux procédures, qui pourraient être un étalon-or dans ce domaine.
La possibilité de traiter sampl cliniquees avec traitement RNase nous a donné des échantillons purs sans contamination de circulation miARN. Cependant, la présence d'enzymes RNase dans les échantillons pourrait affecter la quantité de miARN exosomal après lyse exosomes. Pour cette raison, nous avons choisi un kit avec un traitement à la protéinase K, afin d'éliminer les protéines contaminantes en circulation et à dégrader les enzymes RNase.
Après la normalisation de toutes les procédures d'isolement, la caractérisation et l'analyse future miRNA de ces données peuvent former un outil utile pour détecter les biomarqueurs d'une manière non invasive au cours du diagnostic initial et le suivi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1 ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
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