Introduction
Низкий уровень выживаемости в НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) больных, в основном , из - за ограниченной эффективности лечения в поздних стадиях заболевания и плохого раннего выявления 1. Активирующие мутации в гене EGFR, которые были обнаружены в субпопуляции пациентов с немелкоклеточным раком легких, как известно, придают чувствительность к ингибиторы тирозин - киназы (ИТК). К сожалению, большинство из EGFR , мутировавших пациентов с немелкоклеточным раком легких развивается устойчивость Tki 2. Особенно в этом контексте, правильный диагноз является обязательным. В общем случае, из-за локализации опухолей, получение тканей при биопсии НМРЛ не всегда осуществимо. Таким образом, некоторые исследования продолжаются, которые используют неинвазивные методы для получения этих биологических данных. Экзосомы описаны как жидкие биопсии компонентов , которые могут быть исследованы с целью получения диагностических и прогностических значений с неинвазивными методами 3.
Экзосомы являются nanovesicles (40 - 100 нм в диаметре) из еndocytic происхождения , которые выпускаются различными типами клеток , как в физиологических и патологических состояниях 4. Они могут нести белки, липиды, мРНК и микроРНК. Кроме того, некоторые исследования предполагают плейотропным роль опухолей происходит экзосомы, которые могут влиять на рост и выживаемость опухолевых клеток, ангиогенеза, стромальных и внеклеточного матрикса ремоделирования и лекарственной устойчивости 5.
MicroRNAs (микроРНК) короткие некодирующие РНК, которые участвуют в пост-транскрипционной регуляции, связывание 3'-UTR из мРНК мишеней и ведет к деградации мРНК или не-перевод 6. Сортировкой микроРНК в экзосомы было описано. В связи с этим, в последнее время было показано, в пробирке и в естественных условиях, селективной упаковки MIR-21 (известный микроРНК с онкогенных эффектов) в экзосомы высвобождаемых хронического миелолейкоза клеточных линий после того, как куркумин лечения 7.
exosomal микроРНК профиль похож на профиль микроРНК первичной опухоли , и эта функция может быть использована в ранней диагностике и прогнозировании 3. В частности, есть возможность охарактеризовать, с помощью ПЦР в реальном времени, выбранные микроРНК коррелировали с молекулярным профилем заболевания, например., EGFR мутации среди других 8.
Здесь анализ выбранной панели НМРЛ-коррелировала микроРНК 8-9 описано , что были выделены из экзосомы выпущенных в крови больных НМРЛ. После получения отчета сообщить согласие от пациентов, плазмы 12 пациентов с немелкоклеточным раком легких и 6 здоровых, были проанализированы. Изоляция экзосом была выполнена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Перед изоляцией экзосома образцы плазмы обрабатывали РНКазой, для того, чтобы разлагать загрязняющие циркулирующих микроРНК. Мы решили провести такой анализ с коммерческого набора из-за ограниченной стандартизации другой техниQues (например., ультрацентрифугирования), что особенно важно при работе с клиническими образцами. Этот набор включает в себя лечение протеиназы К, который будет ухудшать РНКазы, и, таким образом, уменьшает риск деградировать exosomal микроРНК после экзосома лизиса. Анализ микроРНК проводили высокой чувствительностью и специфичностью в режиме реального времени ПЦР-анализа; Mir-1228-3p был использован в качестве эндогенного контроля и данные были нормализованы в соответствии с формулой 2 - ΔΔct. Контрольные значения используются в качестве базовой линии, и результаты приведены в логарифмической шкале.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. экзосома Изоляция
Примечание: Выделение экзосомы из образцов плазмы, осуществляли с помощью коммерческого набора, в соответствии с протоколом производителя и путем добавления лечения РНКазы: (все эти шаги должны быть выполнены с персональными и окружающей среды, защиты оборудования и следующих конкретной правовой процедуры для манипуляции биологических образцов ).
- Принимать по 1 мл плазмы каждого образца, которые хранятся при температуре -80 ° С, и поместить его на льду.
- Центрифуга образца при 2000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре; этот проход является обязательным для того, чтобы удалить клеток и мусора.
- Передача супернатант, содержащий чистую плазму в новую 1,5 мл трубки.
- Центрифуга новую трубу при 10000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Передача супернатант, содержащий чистую плазму в новую 1,5 мл трубки.
- Добавить 100 нг / мл РНКазы в супернатант и инкубировать пробирку при температуре 37 ° С в течение 10 мин вдля того, чтобы ухудшить циркулирующих РНК.
- Перенесите все обработанную плазму в новую 2 мл пробирку и добавляют 0,5 объема 1x PBS.
- Vortex образец для смешивания растворов.
- Добавить 0,05 объемов раствора протеиназы К (вложить в комплект поставки ) к образцу.
- Вихревой образец, а затем инкубируют при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
- Добавить 0.2 объема осаждения экзосом буфера к образцу и смешивать растворы путем инверсии.
- Инкубируйте образца при температуре от 2 ° C до 8 ° С в течение 30 мин, а затем центрифугировать образец при 10000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Отберите и отбросить супернатант. Осадок содержит отдельные экзосомы.
- Добавить выбранный буфер в экзосома гранулы, чтобы Ресуспендируют экзосомы. Выбор буфера зависит от того, вниз по течению анализа планируемого, в этом случае:
- Добавьте 100 мкл 1x PBS с целью проведения анализа ПЭМ.
- Добавить 346,5 мкл специфического лизиса BUFфер для экстракции РНК (от коммерческого набора) (ВНИМАНИЕ: химической опасности).
- Добавьте 100 мкл буфера для лизиса для экстракции белка (Трис-HCl, 50 мМ рН 7,6 - NaCl, 300 мМ - Тритона Х-100 0,5% - ФМСФ 1 мМ - лейпептина / Апротинин 10 мкг / мл) для того, чтобы выполнить анализ Вестерн-блоттинга. (ВНИМАНИЕ: опасные химические вещества).
- Храните ресуспензированной экзосомы при -20 ° С.
2. Характеристика экзосома с помощью Вестерн-блот-анализ
Примечание: Для того чтобы охарактеризовать выделенные nanovesicles, вестерн-блоттинга с антителами против Аликс и TSG101 (хорошо известные маркеры exosomal) рекомендуется.
- После того, как рефиксацией экзосома окатышей в буфере для лизиса, поместить его на льду в течение 1 часа для того, чтобы растворить exosomal мембрану.
- Центрифуга лизат при 12000 г в течение 10 мин и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку, не нарушая гранул.
- Количественно общий белок exosomal contenт путем Бредфорда или другими способами, и нагрузка 50 мкг белков на лунку в Трис / глицин SDS - 8% -ном полиакриламидном геле. (ВНИМАНИЕ: опасные химические вещества).
- Отделить белки (и соответствующий маркер молекулярного веса) в 8% электрофореза в SDS-PAGE гель с рабочим буфером (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1% SDS) в течение 1 ч и 30 мин при 120 В. (ВНИМАНИЕ: химические опасности ).
- Передача белка на нитроцеллюлозную мембрану посредством электроблотинга с 4 ° C буфером холодного переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% метанола) в течение 1 ч при постоянном 50 В. (Внимание: химические опасности).
- Блок мембраны в течение 1 часа в медленном перемешивании с 5% обезжиренным сухим молоком в 1x TBS -Tween 0,1%.
- Промыть мембрану 4 раза в течение 5 мин в быстром перемешивании с 1x TBS - Tween 0,1%.
- Добавьте первичные антитела против Аликс и TSG101 (по одному на мембране) в соответствующем буфере (соответственно в таблице данных антител от производителя) и инкубировать мембрана O / N; В медленном перемешивании.
- Промыть мембрану 5 раз в течение 5 минут в быстром перемешивании с 1x TBS - 0,1% Tween, чтобы удалить излишнюю антитела.
- Добавьте соответствующее вторичное антитело в соответствующем буфере (соответственно в таблице данных антител от производителя) и инкубировать мембрану в течение 1 часа в медленном перемешивании.
- Промыть мембрану 5 раз в течение 5 минут в быстром перемешивании с 1x TBS - 0,1% Tween, чтобы удалить излишнюю антитела.
- Обнаружение выбранного белка путем анализа хемилюминесценции 11.
3. экзосома характеристика с помощью ПЭМ анализа
Примечание: Для того, чтобы визуализировать отдельные экзосомы, ТЕМ (просвечивающей электронной микроскопии) анализ был проведен.
- Место ~ 10 мкг (ранее количественно Бредфорда) образца интактных экзосомы ресуспендировали в 1х PBS на парафином и положить на образец падение формвар углерода никеля сетки с покрытием в течение 1 ч. <LI> Мыть сетки 3 раза, расположив его на три 40 мкл 1x PBS капли.
- Мыть сетки 5 раз, расположив его на пять 30 мкл капель воды сверхчистых.
- Закрепить образец путем добавления капли 2,5% глутарового альдегида (ОСТОРОЖНО: химическая опасность) в течение 10 мин.
- Мыть сетки 3 раза, расположив его на три 40 мкл 1x PBS капли.
- Добавить каплю 2% уранилацетате (ВНИМАНИЕ: химические опасности) и поставить сетку поверх него в течение 15 минут для того, чтобы противопоставить образца.
- Вставить образец по капле 0,13% метилцеллюлозы (ОСТОРОЖНО: химических факторов риска) и 0,4% ацетата уранила и инкубировать сетки на поверхность капли в течение 10 мин.
- Осторожно удалите жидкость избыток с абсорбирующей бумаги и высушить решетку в течение 5 мин с покрытой стороной вверх.
- Осмотрите сетку с помощью просвечивающего электронного микроскопа 12.
4. Exosomal Экстракция РНК и Количественная
Примечание: Мы решили перфорацияОРМ общее извлечение РНК из exosomal образцов с использованием коммерческого набора, в соответствии с протоколом производителя: (ВНИМАНИЕ: опасные химические вещества, протокола рассмотрения и рекомендации изготовителя).
- После того, как рефиксацией экзосома гранул в 346,5 мкл буфера для лизиса, добавьте 3,5 мкл бета-меркаптоэтанола (ВНИМАНИЕ: химические опасности) и вихрь энергично; этот отрывок является обязательным для того, чтобы уничтожить липидные мембраны.
- Добавьте лизата в колонну промывки в пробирку для сбора и центрифуге при 11000 & bull; g в течение 1 мин. После центрифугирования, удалите колонку и передать фильтрат на новый 1,5 мл РНКазы без трубки.
- Добавьте 350 мкл 70% этанола (ВНИМАНИЕ: химические опасности) и перемешивают встряхиванием в течение 5 сек.
- Загрузите лизата в разрешающего колонке и центрифуги в течение 30 сек при 8000 × г. После центрифугирования, отбросить flowthrough и перенести колонку в новую пробирку для сбора.
- Нагрузка 350 мкл обессоливания BuffeR и центрифуге при 11,000 х г в течение 1 мин. После центрифугирования, отбросить flowthrough и вернуть колонку в ту же пробирку для сбора.
- Добавьте 95 мкл реакционной смеси ДНКазы I (10 мкл разведенной ДНКазы I + 90 мкл буфера ДНКазы, для каждого образца) на кварцевом мембране колонны и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин при комнатной температуре. (ВНИМАНИЕ: химическая опасность)
- Добавить 200 мкл буфера для промывки (Внимание: химическая опасность) в колонку и центрифуге при 11000 х г в течение 1 мин. Поместите колонку в новую пробирку для сбора.
- Добавьте 600 мкл буфера для промывки в колонну и центрифуге при 11000 х г в течение 1 мин. После центрифугирования, отбросить flowthrough и поместите колонку в ту же пробирку для сбора.
- Добавить 250 мкл буфера для промывки в колонну и центрифуге при 11000 х г в течение 2 мин. Поместите колонку в РНКазы пробирку объемом 1,5 мл.
- Элюции РНК в 40 мкл РНКазы воды и центрифуге при 11,000 5; г в течение 1 мин, для того, чтобы иметь высокую концентрацию РНК в этом малом объеме.
- Сразу же место элюированной РНК на льду, чтобы предотвратить возможное ухудшение или хранить при температуре -80 ° С.
- Количественное содержание РНК. Примечание: В данном случае РНК-квантование проводили с использованием 1 мкл образца через спектрофотометра.
5. Retrotrascription из Exosomal микроРНК
Примечание: В связи с описанным ограниченным количеством содержания микроРНК в экзосомы, было решено выполнить обратную транскрипцию выбранных микроРНК через коммерческого набора с использованием индивидуального анализа для каждого микроРНК, в соответствии с протоколом производителя. Для каждого образца 8 микроРНК коррелируют со статусом НМРЛ были выбраны (MIR-30Б; MIR-30с; микроРНК-103, микроРНК-122, микроРНК-195, микроРНК-203, микроРНК-221, микроРНК-222 и микроРНК-1228- 3p в качестве эндогенного контроля).
- Подготовка обратной транскрипции мастер-микс (RT mix). Для каждой реакции готовят 7 мкл смеси RT, как описано в разделеhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (нажмите здесь , чтобы скачать) (ВНИМАНИЕ: химическая опасность).
Примечание: В этом эксперименте 9 различные сочетания РТ были подготовлены для каждого образца. - Осторожно перемешать и хранить смесь RT на льду. Добавить 7 мкл RT смеси в реакционной трубке.
- Добавьте 5 мкл пробы РНК (10 мкг общей РНК) в реакционную пробирку и осторожно перемешать.
- Добавьте 3 мкл 5-кратного обратной транскрипции праймеров (ВНИМАНИЕ: химической опасности) из каждого анализа, установленного в соответствующей реакционной трубы.
- Смешать медленно, закройте пробирку и инкубировать на льду в течение 5 мин.
- Нагрузка реакционной трубки в термоциклеру и начать реакции обратной транскрипции с использованием следующих значений параметров (выдержка при 16 ° С в течение 30 мин; выдержка при 42 ° С в течение 30 мин; выдержка при 85 ° С в течение 5 мин; УДЕРЖИВАЙТЕ ∞ 4 ° С).
6. ПЦР в реальном времени Анализ Exosomal микроРНК
Примечание: Этот анализ былосуществляется с использованием коммерческого набора для ПЦР в реальном времени (КПЦР), с тремя биологическими и техническими повторностей на образец.
- Для каждой реакции, подготовить 17.67 мкл ПЦР в реальном времени смеси (10 мкл ПЦР Master Mix + 7,67 мкл нуклеазы без воды), смешать его и поставить на лед. (ВНИМАНИЕ: химическая опасность)
- Добавьте 1 мкл, для каждой ПЦР-пробирку, из 20х КПЦР праймеров (ВНИМАНИЕ: Химическая опасность).
- Поместите 18,67 мкл смеси КПЦР в каждую лунку пластины.
- Добавить 1,33 мкл обратной транскрипции продукта в корреспонденте луночного планшета.
- Закройте пластины и вращать его (300 5 сек GX).
- Вставьте пластину в системе ПЦР в реальном времени и начать бег с использованием следующих условий ПЦР: ДЕРЖАТЬ при температуре 95 ° С в течение 10 мин; 40 циклов 15 с при 95 ° С и 60 с при 60 ° С. Процесс и нормализовать данные в соответствии с формулой 2 - ΔΔct 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности 12 плазмы больных НМРЛ и 6 здоровых обрабатывались коммерческого набора для выделения экзосома из плазмы. Каждый образец был обработан вестерн-блот анализа с целью оценки маркеров exosomal ALIX (96 кДа) и TSG101 (43 кДа). Примером этих результатов показан на 3 -х образцах на рисунке 1, что указывает , что экзосом изоляция из образцов плазмы выполнимо с этим протоколом.
Для того, чтобы биофизически охарактеризовать образцы exosomal, анализ ТЭМ проводили. ТЭМ, показали , что nanovesicles , полученные этим протоколом изоляции имеют средний размер в диапазоне от размера exosomal, в пределах от 40 - 100 нм (рисунок 2).
После выделения экзосома и характеристики, мы исследовали их содержание микроРНК. Мы выбрали 8 конкретных микроРНК, как известно, deregulatред в НМРЛ. Как внутреннего контроля, мы использовали MIR-1228 , который был предварительно проверенную в качестве стабильного и эффективного эндогенного контроля в различных типах опухолей 10. Согласно этим результатам микроРНК-1228 является надежным и стабильным эндогенного контроля. При сравнении уровня экспрессии микроРНК 8 отобранных у здоровых доноров и больных раком легких, было обнаружено, что эти микроРНК сильно дерегулированы в анализируемых клинических образцах. На рисунке 3 паттерн экспрессии из 8 отобранных микроРНК показан на логарифмической шкале для 12 проанализированных образцов (PAD1-12). Не все микроРНК были обнаружены в каждом образце, и из-за ограниченного количества образцов, мы не можем выполнить статистический анализ.
Рисунок 1. Вестерн - блот - анализ в 3 Exosomal Образцы для Аликс и TSG101. Вестерн - блот показывает наличиехорошо известные маркеры exosomal, Аликс и TSG-101, в анализируемых пробах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. ПЭМ Анализ образцов Exosomal Эти результаты показывают , что выделенные nanovesicles имеют средний диаметр между 40 -.. 100 нм, в диапазоне exosomal Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Выражение профиля 8 выбранных микроРНК в Exosomal образцах. Эти данные, представленные в логарифмическом масштабе, показывают , что через вч этот протокол представляется возможным, чтобы увидеть вверх или вниз регулирования выбранных exosomal микроРНК из клинических НМРЛ плазмы пациентов (PAD1-12), что приводит к потенциальному открытию exosomal биомаркеров НМРЛ. Данные представлены в виде складки выражения относительно здоровых людей . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью этого комбинированного протокола можно было выполнить анализ exosomal микроРНК из плазмы пациентов с немелкоклеточным раком легких. Эти данные могут отражать состояние заболевания, но это должно быть подтверждено дальнейшего изучения.
Протокол, используемый в данной статье, была основана на коммерческом наборе для изоляции экзосома. Причина в том , что другие процедуры , известные изолирующие (например., В градиенте плотности ультрацентрифугирования) требуют более ручных операций, что приводит к ограниченной области стандартизации. Тем не менее, одним из недостатков этого протокола является то, что по сравнению с градиентом плотности ультрацентрифугирования для выделения экзосома, градиент плотности ультрацентрифугирования остается очень полезным методом в изоляции экзосома, который использует определенную плотность экзосомы (между 1,13 - 1,19 г / мл). Потенциальный модификация представляет собой сочетание обеих процедур, которые могли бы быть золотым стандартом в этой области.
Возможность обрабатывать клиническую SAMPLэс с обработкой РНКазой дал нам чистые образцы без загрязнения циркулирующих микроРНК. Тем не менее, наличие РНКазы ферментов в образцах могут повлиять на количество exosomal микроРНК после экзосома лизиса. По этой причине мы выбрали комплект с обработкой протеиназой К, с тем чтобы устранить циркулирующие примесей белков и разлагать РНКазы ферментов.
После стандартизации всех процедур выделения, будущая характеристика и анализ микроРНК этих данных может сформировать полезный инструмент для выявления биомаркеров в неинвазивным способом во время первоначального диагноза и принятия последующих мер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
Anti-Mouse HRP 1 ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).