Introduction
非小细胞肺癌（非小细胞肺癌）患者生存率低的主要原因是在先进的疾病和不良的早期检测1治疗的疗效有限。在EGFR基因活化突变，已在非小细胞肺癌的患者的亚群被发现是已知赋予灵敏度酪氨酸激酶抑制剂（TKI中）。不幸的是，大多数EGFR突变的非小细胞肺癌患者的发展TKI阻力位2。特别是在这种情况下，正确的诊断是必需的。在一般情况下，由于肿瘤的定位，在非小细胞肺癌获得活检组织并不总是可行的。因此，一些研究是使用非侵入性的方法来获得这些生物数据正在进行。外来体被描述为可能，以获得与非侵入性技术3的诊断和预后值进行调查液体活检组件。
外来体是纳米囊泡 - 电子商务（40 100纳米直径）ndocytic原点由既在生理和病理条件4种不同类型的细胞释放。它们可以携带蛋白质，脂质，mRNA和微小RNA。此外，一些研究表明，肿瘤衍生的外来体，其可影响肿瘤细胞，血管生成，基质细胞和胞外基质重构和耐药5的生长和存活的多效性作用。
微RNA（miRNA）是所涉及的转录后调控，结合靶mRNA的3'-UTR以及导致mRNA的降解或到非翻译6短的非编码RNA。 miRNA的选择性排序成外来体已经描述。在这种情况下，最近证实， 在体外和体内中，miR-21（公知的miRNA用致癌效应）的姜黄素治疗7后由慢性髓性白血病细胞系释放外来的选择性包装。
该外来体miRNA谱是类似的原发肿瘤的miRNA谱和这个特征可在早期诊断和预后3被利用。具体地说，是表征，通过实时PCR一种可能性，与疾病的分子轮廓，相关选择的miRNA 例如 ，除其他8 EGFR突变。
这里，描述了非小细胞肺癌相关的miRNA 8-9的选定面板的分析，认为是从非小细胞肺癌患者的血液中释放的外来体分离。获得来自患者的知情同意报告后，12个NSCLC患者和6名健康对照的血浆，进行了分析。外来体分离按照生产商的方案用市售的试剂盒进行。外来体分离之前，血浆样品用RNA酶处理，以降低污染物循环的miRNA。我们决定来执行该分析用市售试剂盒，由于其他TECHNI有限标准化疑问句（ 例如 ，超离心）的临床样品时这是特别重要的。这种试剂盒包含一个蛋白酶K处理，这将降低RNA酶，并因此降低外来体裂解后降解外来体的miRNA的风险。被敏感，特异的实时PCR分析进行分析的microRNA;的mir-1228-3p用作内源的控制和数据进行标准化根据公式2 - ΔΔCT。控制值被用作基准和结果在对数标度示出。
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Protocol
1.外来体隔离
注意：从血浆样品外来体的分离，根据制造商的协议，并通过加入RNA酶处理与市售的试剂盒进行的，（所有这些步骤必须以个人和环境的保护设备及以下对生物样品的操纵特定的法律程序执行）。
- 取各1ml样品的血浆，保存于-80℃，并放置在冰上。
- 离心样品以2,000×g下在室温下20分钟;这段话是为了去除细胞和碎片强制性的。
- 传送包含清洁等离子体上清至新的1.5毫升管。
- 离心新管以10,000×g下在室温下20分钟。
- 传送包含清洁等离子体上清至新的1.5毫升管。
- 在37℃下为100ng / ml RNA酶的添加到上清液孵育管为在10分钟内为了降低循环的RNA。
- 传输所有处理的血浆，以新的2ml管中，加入0.5倍体积的1X PBS的。
- 涡样品以混合溶液。
- 添加0.05体积的蛋白酶K溶液（括在试剂盒中）到样品中。
- 涡旋样品，然后在37℃下进行10分钟。
- 添加0.2体积外来体沉淀缓冲液的样品，并通过倒置混合该溶液。
- 在2℃孵育样品8℃下进行30分钟，然后在10,000×g下离心样品在RT 5分钟。
- 吸弃上清。沉淀包含隔离外来体。
- 选择的缓冲液添加到外来体颗粒以悬浮外来体。缓冲区的选择取决于计划的下游分析，在这种情况下：
- 添加100μl的1×PBS中的为了进行TEM分析。
- 加入346.5微升裂解特定的BUFFER提取RNA（从商业套件）（注意：化学危险品）。
- 加入100微升用于蛋白提取的裂解缓冲液（Tris-盐酸50mM的pH值7.6 - 氯化钠300mM的 - 的Triton X-100 0.5％ - PMSF 1mM的 - 亮抑酶肽/抑肽酶10微克/毫升），以便执行Western印迹分析。 （注意：化学危险品）。
- 储存在-20℃的悬浮外来体。
2.外来体表征蛋白质印迹分析
注意：为了表征的分离的纳米囊泡，用抗ALIX和TSG101（公知的外来体标记）抗体western印迹建议。
- 在裂解缓冲液外来体颗粒再悬浮后，将其放置在冰上1小时，以溶解该外来体膜。
- 离心溶胞产物以12,000×g进行10分钟，将上清转移至新管，而不会干扰沉淀。
- 量化的总蛋白质外体conten通过Bradford法或其他方法T和负载于Tris /甘氨酸SDS每孔蛋白的50微克 - 8％聚丙烯酰胺凝胶。 （注意：化学危险品）。
- 分离在8％SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白（和适当的分子量标记）与运行缓冲液（25mM的Tris，192毫甘氨酸，0.1％SDS）中1小时，并在120伏。30分钟（注意：化学危害）。
- （：化学危险警告）通过用4℃下在恒定的50伏1小时Ç冷转移缓冲液（25mM的Tris，192毫甘氨酸，20％甲醇）电印迹转移的蛋白质到硝酸纤维素膜上。
- 在缓慢搅拌以在1×TBS中-Tween 0.1％5％无脂干牛奶1小时阻断膜。
- 洗膜4次，快速搅拌5分钟用1X TBS - 吐温0.1％。
- 添加抗ALIX和TSG101（每膜一个）在适当的缓冲液中的一抗（相应地从制造商的抗体数据表），并孵育膜O / N;缓慢搅拌。
- 洗膜在快速搅拌下用1×TBS 5分钟5次 - 吐温0.1％，以除去过量的抗体。
- 适当的第二抗体加入适当的缓冲液（相应地从制造商的抗体数据表），并孵育所述膜在缓慢搅拌1小时。
- 洗膜在快速搅拌下用1×TBS 5分钟5次 - 吐温0.1％，以除去过量的抗体。
- 检测化学发光分析11所选择的蛋白质。
3.外来体表征TEM分析
注意：为了形象化所述分离的外泌体，进行TEM（透射电子显微镜）分析。
- 广场〜10微克悬浮在1X PBS上的封口膜完整的外来的样品（以前由Bradford分析量化），并把在样品上滴聚乙烯醇缩甲醛碳包镍网格1小时。 <LI> 1倍PBS滴把它定位在三个40微升洗电网的3倍。
- 通过定位其在五个30微升超纯水滴洗网格5倍。
- 10分钟：通过添加2.5％戊二醛（化学危险小心）的下降修复样本。
- 1倍PBS滴把它定位在三个40微升洗电网的3倍。
- 添加2％醋酸铀下降（注意：化学危险品），并把它的顶部电网15分钟，以对比样本。
- 嵌入0.13％甲基纤维素的一滴样品（注意：化学危险）和0.4％乙酸双氧铀和孵化的下拉10分钟的顶部的网格。
- 轻轻取出液体过量的一吸收纸和干燥格5分钟与涂布的一面朝上。
- 审查通过透射型电子显微镜12内的网格。
4.外来体RNA提取和定量
注意：我们决定为PErFORM从使用商业试剂盒外来体的样品的总RNA提取，根据制造商的协议：（注意：化学危险，审查该制造商的协议和准则）。
- 在346.5微升裂解液的外来体颗粒再悬浮后，加入3.5微升β巯基乙醇（注意：化学危险品）和涡大力;这段话是为了破坏脂膜强制性的。
- 裂解物添加到在一个收集管和离心洗涤塔在11000×g的1分钟。离心后，弃去柱，将滤液转移到一个新的1.5毫升的无RNase的管。
- 添加350微升70％乙醇（小心：化学危险），并通过涡旋5秒混合。
- 加载在解决列，离心裂解液在8000×g下30秒。离心后，弃去流过液和柱转移至新的收集管。
- 加载350微升脱盐buffe的r和离心机在11000×g的1分钟。离心后，弃去流穿，并返回该列到同一个收集管。
- 上塔的二氧化硅膜中添加95微升DNA酶I反应混合物（10微升重组DNA酶I + 90微升DNA酶缓冲液中，对于每个样品），并在室温在室温下孵育15分钟。 （注意：化学危险品）
- 在11000×g下：（化学危险警告），以列和离心1分钟加入洗涤缓冲液200微升。放置柱到一个新的收集管。
- 在11000×g下添加600微升洗涤缓冲液对柱子和离心1分钟。离心后，弃去流过液和列放置到相同收集管。
- 在11000×g下加入250微升洗涤缓冲液对柱子和离心2分钟。将列到1.5毫升的无RNA酶管。
- 洗脱在11000在40微升RNA酶的水中的RNA和离心机 5;克1分钟，以便在这小体积高的RNA浓度。
- 立即置于冰上洗脱的RNA，以防止在-80℃下潜在的降解或存储。
- 量化RNA含量。注意：在此，将RNA量化用1微升样品的通过分光光度计进行。
5. Retrotrascription外来体miRNA的
注意：由于在外来体的miRNA内容所描述的有限数量，因此决定通过使用用于每个miRNA的个体测定商业试剂盒来执行选择的miRNA的反转录，根据制造商的协议。对于每个样品，8的miRNA相关的非小细胞肺癌的状态被选择（的miR-30b中;的miR-30c中;的miR-103;的miR-122;的miR-195;的miR-203;的miR-221;的miR-222;和miR-1228- 3P为内对照）。
- 准备反转录主混合物（RT混合物）。每个反应制备7微升RT混合物，正如所描述https://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1（点击此处下载）（注意：化学危险品）。
注意：在这个实验中，9个不同的RT混合物中每个样品制备。 - 轻轻混匀并储存在冰的RT混合物。新增7微升每个反应管RT混合。
- 加入5微升每个反应管中的样品RNA（总RNA的10微克），轻轻混匀。
- 从每个实验设定到相应的反应管：（化学危险小心）加入3微升的5倍逆转录引物。
- 混合慢，关闭该管，并在冰上孵育5分钟。
- 加载反应管进入热循环，并使用以下参数值（HOLD启动逆转录反应在16℃下30分钟;在42℃下保持30分钟;在85℃下保持5分钟; HOLD∞4 C）。
6.外来体miRNA的实时定量PCR分析
注意：此分析是使用实时定量PCR（qPCR的）市售的试剂盒，每个样品三次生物学和技术重复进行。
- 对于每一个反应，准备实时PCR混合物的17.67微升（10微升PCR预混+ 7.67μL无核酸酶水的），混合，并置于冰上。 （注意：化学危险品）
- 加入1μl，每个PCR管，20倍定量PCR引物（注意：化学危险品）。
- 放置18.67微升的qPCR混合物的各孔板。
- 添加1.33微升反转录产物进入相应孔板。
- 关闭板旋转它（300 GX 5秒）。
- 插入该板在一个实时定量PCR系统和使用以下PCR条件启动运行：HOLD在95℃下进行10分钟; 40个循环的95℃15秒，在60℃下60秒的。 ΔΔCT13 -根据公式2的过程和正常化的数据。
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Representative Results
共有NSCLC患者12血浆和6名健康对照的与从血浆中分离的外来体商业试剂盒进行了处理。每个样品用蛋白质印迹分析，以评估所述外来体标记ALIX（96 kDa的）和TSG101（43 kDa）的处理。这些结果的一个例子示出了用于在图1 3的样品，这表明从血浆样品外来体隔离与此协议是可行的。
为了表征生物物理的样品外体，进行TEM分析。 TEM显示，通过该隔离协议中得到的纳米囊泡具有在外来体尺寸的范围内的大小平均40之间- 100纳米（ 图2）。
外来体的分离和鉴定后，我们研究了它们的miRNA的内容。我们选择了8个具体的的miRNA，已知deregulat海关在非小细胞肺癌。作为内部对照，我们使用了先前已确认为在不同的肿瘤类型10稳定，高效的内源性对照的miR-1228。根据这些结果的miR-1228是可靠和稳定的内对照。当健康供体和肺癌患者之间选择的miRNA的8的表达水平进行了比较，结果发现这些miRNA是在分析临床样品中强烈失调。在图3中的8个选择的miRNA的表达模式上示出所分析的12个样品（PAD1-12）的对数刻度。并非所有的miRNA是每个样品中可检测的，并且由于样本的数量有限，我们不能执行统计分析。
图1：Western印迹分析3外体样品的ALIX和TSG101。印迹显示存在著名的外体标记，ALIX和TSG-101，所分析的样本中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.外来体样品的TEM分析这些结果表明，孤立纳米囊泡的直径平均，40间- 100纳米，外体范围之内，请点击此处查看该图的放大版本。
图3.表达的外体样品8中选择的miRNA档案。这些数据，在对数刻度显示，证明通过量h此协议是可行的，看看上调或下调临床NSCLC患者的血浆（PAD1-12）选择外体miRNA的，从而导致非小细胞肺癌的生物标志物外体潜在的发现。数据显示为表达相对于健康对照组折。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
用该组合协议是可能的从非小细胞肺癌患者血浆执行外来体miRNA的分析。这些数据可反映疾病的状态，但是这需要通过进一步研究加以证实。
在这篇文章中所使用的协议是基于切体隔离商业套件。其原因是，其它已知的分离方法（ 例如 ，密度梯度超速离心）需要更多的人工程序，从而导致有限的标准化。然而，该协议的局限性之一是，与用于外来体隔离密度梯度超速离心比较，密度梯度超速离心保持在外来体隔离一个非常有用的技术，它利用外来的比重（1.13之间 - 1.19克/毫升）中。潜在的改装是两个过程，这可能是该领域的黄金标准的混合。
的可能性来处理临床SAMPL用核糖核酸酶处理ES给了我们纯净的样品没有循环miRNA的污染。然而，RNA酶的存在下在样品中酶外来体裂解后可能影响外来体的miRNA的量。为此，我们选择了用蛋白酶K处理的试剂盒，以消除循环污染蛋白质和降解RNA酶的酶。
的所有隔离程序标准化后，将来对这些数据的表征和miRNA分析可以形成初步诊断期间检测在非侵入性的方式的生物标志物和后续的有用工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1 ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
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