Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

שיעור ההישרדות הנמוך ב NSCLC (non-small סרטן ריאות מסוג התאים) חולים הוא בעיקר בשל היעילות המוגבלת של טיפולים במחלה מתקדמת לגילוי מוקדם עניי 1. מוטציות הפעלה בגן EGFR, כי התגלו בתוך תת-אוכלוסייה של חולי NSCLC, ידועות להעניק רגישות טירוזין קינאז inhibitors (TKIs). למרבה הצער, רוב המטופלים NSCLC מוטציה ב- EGFR לפתח TKI התנגדות 2. במיוחד בהקשר זה, אבחנה נכונה היא חובה. באופן כללי, בשל לוקליזציה של גידולים, קבלת רקמות ביופסית NSCLC היא לא תמיד אפשרית. לכן, מספר מחקרים נמשכים המשתמשים בשיטות לא פולשני להשיג נתונים ביולוגיים אלה. Exosomes מתואר מרכיבים נוזלים ביופסיה שיכול להיחקר על מנת לקבל ערכי אבחון פרוגנוסטית עם טכניקות לא פולשנית 3.

Exosomes הם nanovesicles (40 - 100 קוטר ננומטר) של דוארהמוצא ndocytic שפורסמו על ידי תאים מסוגים שונים הן בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 4. הם יכולים לשאת חלבונים, שומנים, mRNA ו מיקרו-רנ"א. יתר על כן, מספר מחקרים מראים תפקיד pleiotropic של exosomes נגזר גידול, אשר יכול להשפיע על צמיחה והישרדות של תאים סרטניים, אנגיוגנזה, סטרומה שיפוץ תאי מטריקס סמי התנגדות 5.

מיקרו RNA (miRNAs) הם RNA קצר ללא קידוד המעורבים בתקנה שלאחר תעתיק, מחייב 3'-UTR של תעתיקי היעד והובלת mRNA השפלה או א-התרגום הלא 6. מיון סלקטיבי של miRNAs לתוך exosomes תואר. בהקשר זה, לאחרונה הודגם, במבחנת in vivo, באריזה סלקטיבית של miR-21 (מירנה ידועה עם אפקטים שבעור) ב exosomes שפורסם על ידי שורות תאים לוקמיה מיאלואידית כרוניות לאחר טיפול כורכומין 7.

הexosomal מירנה פרופיל דומה לפרופיל מירנה של הגידול הראשוני תכונה זו עשויה להיות מנוצלת על אבחון מוקדם הפרוגנוזה 3. באופן ספציפי, קיימת אפשרות לאפיין, על ידי PCR בזמן האמת, miRNAs שנבחר בקורלציה עם הפרופיל המולקולרי של מחלה, למשל., מוטציות EGFR בין היתר 8.

כאן, הניתוח של פאנל נבחרת של NSCLC בקורלציה miRNAs 8-9 מתואר כי בודדו exosomes שוחרר בדם של חולי NSCLC. לאחר הקבלה להודיע ​​דו"ח הסכמה מצד החולים, פלזמה של 12 חולי NSCLC ו -6 ביקורת בריאה, נותחה. בידוד exosome בוצע עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. לפני בידוד exosome, דגימות פלסמה טופלו RNase, כדי לבזות miRNAs במחזור המזהם. החלטנו לבצע ניתוח זה עם ערכה מסחרית בשל סטנדרטיזציה המוגבלת techni אחרבככפרו (למשל., ultracentrifugation) אשר חשוב במיוחד כשעובדים עם דגימות קליניות. ערכה זו כוללת טיפול proteinase K, אשר יהיה לבזות את RNAse, ובכך מקטין את הסיכון להשפיל miRNAs exosomal לאחר תמוגה exosome. ניתוח MicroRNA בוצע על ידי ניתוח רגיש וספציפי Real-Time PCR; mir-1228-3p שימש פקד אנדוגני ונתונים היו מנורמל לפי הנוסחה 2 - ΔΔct. ערכי בקרה משמשים בסיס והתוצאות מוצגות סולם לוגריתמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד Exosome

הערה: בידודו של exosomes ממדגמים פלזמה, בוצעה באמצעות ערכה מסחרית, על פי הפרוטוקול של היצרן ועל ידי טיפול RNase והוסיף: (כל הצעדים הללו חייבות להתבצע עם ציוד מגן אישי והסביבה ובעקבות הליך משפטי ספציפי עבור מניפולציה של דגימות ביולוגיות ).

  1. קח 1 מ"ל של פלזמה של כל דגימה, לאחסן ב -80 ° C, ומניחים אותו על קרח.
  2. צנטריפוגה מדגם ב 2000 g × במשך 20 דקות ב RT; הקטע הזה הוא חובה על מנת להסיר תאים ופסולת.
  3. מעביר את supernatant המכיל את הפלזמה הנקיה לצינור 1.5 מיליליטר חדש.
  4. צנטריפוגה הצינור החדש גרם 10,000 × במשך 20 דקות ב RT.
  5. מעביר את supernatant המכיל את הפלזמה הנקיה לצינור 1.5 מיליליטר חדש.
  6. הוספת 100 ng / ml של RNAse כדי supernatant ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בכדי לבזות במחזור RNAs.
  7. להעביר את כל הפלזמה שטופלה לצינור 2 מיליליטר חדש ולהוסיף 0.5 נפח של PBS 1x.
  8. וורטקס המדגם כדי לערבב את הפתרונות.
  9. הוסף 0.05 כרכים של פתרון proteinase K (הקף בערכה) המדגם.
  10. וורטקס המדגם ולאחר מכן לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  11. להוסיף 0.2 נפח של חיץ ממטרים exosome המדגם ומערבבים הפתרונות על ידי היפוך.
  12. דגירה מדגם ב 2 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן צנטריפוגות מדגם ב g 10,000 × 5 דקות ב RT.
  13. לשאוב וזורקים supernatant. הגלולה המכילה את exosomes המבודד.
  14. הוסף חוצץ שנבחרו גלולה exosome כדי resuspend את exosomes. הבחירה של חיץ תלוי בניתוח במורד הזרם המתוכנן, במקרה זה:
    1. הוספת 100 μl של 1x PBS על מנת לבצע ניתוח TEM.
    2. הוסף 346.5 μl של buf תמוגה ספציפיfer להפקת RNA (מתיק מסחרי) (זהירות: סכנה כימית).
    3. הוספת 100 μl של חיץ תמוגה עבור מיצוי חלבון (Tris-HCl 50 מ"מ pH 7.6 - NaCl 300 מ"מ - טריטון X-100 0.5% - PMSF 1 מ"מ - leupeptin / Aprotinin 10 מיקרוגרם / מ"ל) על מנת לבצע ניתוח המערבי סופג. (זהירות: סיכונים כימיים).
  15. אחסן את exosomes resuspended ב -20 ° C.

2. Exosome אפיון על ידי ניתוח כתם המערבי

הערה: על מנת לאפיין את nanovesicles המבודד, סופג מערבי עם נוגדנים נגד אליקס ו TSG101 (סמני exosomal ידועים) מומלץ.

  1. לאחר resuspension של גלולת exosome חיץ תמוגה, ומניח אותו על קרח למשך שעה 1 כדי לפזר את קרום exosomal.
  2. צנטריפוגה lysate ב 12,000 גרם במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש מבלי להפריע גלולה.
  3. לכמת את conten חלבון exosomal הכוללt על ידי ברדפורד Assay או שיטות אחרות והעומס 50 מיקרוגרם של חלבונים היטב לכל טריס / גליצין SDS - 8% ג'ל polyacrylamide. (זהירות: סיכונים כימיים).
  4. הפרד את החלבונים (ו סמן משקל מולקולרי המתאים) ב ג'ל אלקטרופורזה 8% SDS-PAGE עם הפעלת המאגר (25 מ"מ טריס, 192 גליצין מ"מ, 0.1% SDS) במשך שעה 1 ו 30 דקות ב 120 V. (זהירות: סיכונים כימיים ).
  5. מעבירים את החלבון אל קרום nitrocellulose ידי electroblotting עם 4 ° C חיץ קר ההעברה (25 מ"מ טריס, 192 גליצין מ"מ, 20% מתנול) עבור שעה 1 ב 50 V. מתמיד (זהירות: סיכונים כימיים).
  6. חסום את הממברנה עבור שעה 1 ב תסיסה איטית עם 5% דל שומן חלב יבש ב 0.1% 1x TBS -Tween.
  7. לשטוף את הממברנה 4 פעמים במשך 5 דקות תסיסה מהירה עם TBS 1x - Tween 0.1%.
  8. מוסיפים את נוגדנים ראשוניים נגד אליקס ו TSG101 (אחד לכל ממברנה) במאגר המתאים (בהתאם כדי גליון נוגדן מהיצרן) דגירה הממברנה O / N; ב תסיסה איטית.
  9. לשטוף את הממברנה 5 פעמים במשך 5 דקות תסיסה מהירה עם TBS 1x - Tween 0.1% על מנת להסיר נוגדן מוגזם.
  10. מוסיף את הנוגדנים משני מתאים המאגר מתאים (בהתאם כדי גיליון הנוגדן מהיצרן) דגירה הממברנה במשך שעה 1 ב תסיסה איטית.
  11. לשטוף את הממברנה 5 פעמים במשך 5 דקות תסיסה מהירה עם TBS 1x - Tween 0.1% על מנת להסיר נוגדן מוגזם.
  12. זיהוי החלבון שנבחר על ידי ניתוח chemiluminescence 11.

3. אפיון Exosome ידי TEM ניתוח

הערה: כדי להמחיש את exosomes המבודד, TEM (במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים) ניתוח בוצע.

  1. מקום ~ 10 מיקרוגרם (לכמת בעבר על ידי assay ברדפורד) של מדגם של exosomes שלמים resuspended ב 1x PBS על parafilm ולשים על מדגם טיפה רשת ניקל formvar מצופה פחמן עבור שעה 1.
    2. <li> שטפו את הרשת 3 פעמים על ידי מיקומה על שלושה 40 μl 1x PBS טיפות.
  2. שטפו את הרשת 5 פעמים על ידי מיקומה על חמישה 30 טיפות מים μl ultrapure.
  3. תקן את המדגם על ידי הוספת ירידה של 2.5% glutaraldehyde (זהירות: סכנה כימית) במשך 10 דקות.
  4. שטפו את הרשת 3 פעמים על ידי מיקומה על שלושה 40 μl 1x PBS טיפות.
  5. הוסף ירידה של 2% יצטטו uranyl (זהירות: סיכונים כימיים) ולשים את הרשת על גבי זה במשך 15 דקות כדי לעמת המדגם.
  6. הטמע את המדגם על ירידה של 0.13% methylcellulose (זהירות: סיכונים כימיים) אצטט uranyl 0.4% ו דגירה לרשת על גבי ירידה במשך 10 דקות.
  7. בעדינות להסיר עודפי נוזלים עם נייר סופג ומייבשים את הרשת במשך 5 דקות עם עד הצד המצופה.
  8. בדוק את הרשת על ידי מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים 12.

4. RNA Exosomal הפקה וכימות

הערה: החלטנו PerfORM חילוץ RNA הכולל דגימות exosomal באמצעות ערכה מסחרית, על פי הפרוטוקול של היצרן: (זהירות: סיכונים כימיים, לסקור את הפרוטוקול ואת הנחיות היצרן).

  1. לאחר resuspension של גלולה exosome ב 346.5 μl של חיץ תמוגה, להוסיף 3.5 μl של β-mercaptoethanol (זהירות: סיכונים כימיים) ו מערבולת במרץ; הקטע הזה הוא חובה על מנת להרוס את ממברנות שומנים בדם.
  2. מוסיפים את lysate לעמודה כביסה בצינור צנטריפוגות גבייה במוסד 11,000 × g דקות 1. לאחר צנטריפוגה, לבטל את הטור ולהעביר את התסנין אל צינור 1.5 מיליליטר RNase ללא חדשה.
  3. להוסיף 350 μl של 70 אתנול% (זהירות: סיכונים כימיים) ומערבבים ידי vortexing למשך 5 שניות.
  4. טען את lysate בעמודה צנטריפוגות בפתרון למשך 30 שניות ב 8000 g ×. לאחר צנטריפוגה, לבטל את flowthrough ולהעביר את העמודה צינור אוסף חדש.
  5. טען 350 μl של desalting buffer ו צנטריפוגות ב g 11,000 × 1 דקות. לאחר צנטריפוגה, לבטל את flowthrough ולהחזיר את העמודה לתוך הצינור אוסף אותו.
  6. להוסיף 95 μl של תערובת התגובה DNase אני (10 μl של DNase מחדש I + 90 μl של חיץ DNase, עבור כל דגימה) על הממברנה סיליקה הטור לדגור על RT במשך 15 דקות ב RT. (זהירות: סכנה כימית)
  7. הוסף 200 μl של חיץ כביסה (זהירות: סכנה כימית) לעמודה ו צנטריפוגות ב g 11,000 × 1 דקות. מניח את הטור לתוך צינור אוסף חדש.
  8. להוסיף 600 μl של חיץ כביסה לעמודה ו צנטריפוגות ב g 11,000 × 1 דקות. לאחר צנטריפוגה, לבטל flowthrough ומניחים בעמודה לתוך הצינור אוסף אותו.
  9. הוסף 250 μl של חיץ כביסה לעמודה ו צנטריפוגות ב g 11,000 × למשך 2 דקות. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל RNase חינם.
  10. Elute רנ"א 40 μl של מים צנטריפוגות RNAse חינם ב -11,000 5; גרם דקות 1, כדי שיהיה ריכוז RNA גבוהה בנפח קטן זה.
  11. מיד למקום RNA eluted על הקרח כדי למנוע השפלה או חנות פוטנציאל ב -80 מעלות צלזיוס.
  12. לכמת את תוכן RNA. הערה: כאן, קוונטיזציה RNA בוצעה באמצעות 1 μl של המדגם באמצעות ספקטרופוטומטר.

5. Retrotrascription של miRNAs Exosomal

הערה: בשל הכמות המוגבלת המתוארת של תוכן miRNAs ב exosomes, הוחלט לבצע את שעתוק לאחור של miRNAs שנבחר באמצעות ערכה מסחרית באמצעות assay בודד עבור כל מירנה, על פי הפרוטוקול של היצרן. עבור כל דגימה, 8 miRNAs בקורלציה למעמד NSCLC נבחרו (Mir-30b; miR-30C; miR-103; miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222; ומיר-1228- 3P כשליטה אנדוגני).

  1. מכינים את תערובת מאסטר שעתוק הפוך (תמהיל RT). עבור כל תגובה להכין 7 μl של תמהיל RT, כמתוארhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (לחץ כאן כדי להוריד) (זהירות: סכנה כימית).
    הערה: בניסוי זה, 9 תמהיל שונה RT הוכן עבור כל דגימה.
  2. מערבבים בעדינות ולאחסן תמהיל RT על הקרח. להוסיף 7 μl של תמהיל RT לכל צינור התגובה.
  3. הוסף 5 μl של רנ"א מדגם (10 מיקרוגרם של רנ"א הכל) לכל צינור התגובה ומערבבים בעדינות.
  4. הוסף 3 μl של פריימרים שעתוק לאחור 5x (זהירות: הסכנה כימית) מכל assay להגדיר לתוך צינור התגובה המתאים.
  5. מערבבים לאט, לסגור את הצינור דגירה על קרח למשך 5 דקות.
  6. טען את צינור התגובה לתוך Cycler התרמי להתחיל את תגובת השעתוק לאחור באמצעות ערכי הפרמטרים הבאים (HOLD על 16 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; HOLD על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; HOLD על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; HOLD ∞ 4 מעלות צלזיוס).

6. Real Time PCR ניתוח של Exosomal miRNAs

הערה: ניתוח זה היהמתבצע באמצעות ערכה מסחרית עבור Real Time PCR (QPCR), עם שלושה משכפל ביולוגי וטכני לדגימה.

  1. עבור כל תגובה, להכין 17.67 μl של תמהיל Real Time PCR (10 μl של ה- PCR מיקס מאסטר + 7.67 μl מים nuclease חינם), לערבב אותו ולשים על הקרח. (זהירות: סכנה כימית)
  2. הוסף 1 μl, עבור כל צינור PCR, של 20x פריימרים qPCR (זהירות: סכנה כימית).
  3. מניחים 18.67 μl של תמהיל qPCR בכל צלחת היטב.
  4. להוסיף 1.33 μl של מוצר השעתוק לאחור לתוך באר-צלחת הכתב.
  5. סגור את הצלחת ומסובב אותו (300 GX 5 שניות).
  6. הכנס את הצלחת מערכת Real Time PCR ולהתחיל בטווח באמצעות תנאי PCR הבאים: HOLD על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 40 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס ו -60 שניות על 60 מעלות צלזיוס. תהליך לנרמל נתונים לפי הנוסחה 2 - ΔΔct 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סך של 12 פלזמת מהחולים NSCLC ו -6 ביקורת בריאה עובד עם ערכה מסחרית לבידוד exosome מפלזמה. כל המדגם היה מעובד על ידי ניתוח כתם המערבי על מנת להעריך את אליקס סמנים exosomal (96 KDA) ו TSG101 (43 KDA). דוגמא לתוצאות אלה מוצגת עבור 3 דגימות באיור 1, המציין כי בידוד exosome ממדגמים פלזמה אינו ריאלי עם פרוטוקול זה.

כדי biophysically לאפיין דגימות exosomal, ניתוח TEM בוצע. TEM הראה כי nanovesicles מתקבל על ידי פרוטוקול הבידוד הזה יש ממוצע גודל בטווח של גודל exosomal, בין 40 - 100 ננומטר (איור 2).

לאחר בידוד exosome ואפיון, חקרנו תוכן miRNAs שלהם. בחרנו 8 miRNAs ספציפי, ידוע כי deregulatאד ב NSCLC. כפי בקרה פנימית, השתמשנו miR-1228 כי יאומת בעבר כביקורת אנדוגני יציבה ויעילה סוגי גידולים שונים 10. על פי תוצאות אלה miR-1228 הוא פקד אנדוגני אמין ויציב. כאשר רמת הביטוי של 8 שנבחרו מירנה בין תורמים בריאים וחולי סרטן הריאות הושוותה, נמצא כי miRNAs אלה מוסדרים מאוד בדגימות הקליניות המנותחות. באיור 3 את דפוס הביטוי של 8 miRNAs הנבחר מוצג על סולם לוגריתמי עבור 12 דגימות נותחו (PAD1-12). לא כל miRNAs היה ניתן להבחין בן בכל מדגם ובשל כמות הדגימות המוגבלת, ולכן איננו יכול לבצע ניתוח סטטיסטי.

איור 1
איור 1. ניתוח כתם המערבי 3 דוגמאות Exosomal עבור אליקס ו TSG101. כתם המערבי מראה נוכחות שלסמני exosomal הידועים, אליקס ו TSG-101, בדגימות המנותחות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
ניתוח TEM איור 2. דוגמאות Exosomal תוצאות אלו מראות כי nanovesicles המבודד יש ממוצע קוטר, בין 40 -.. 100 ננומטר, בתוך טווח exosomal אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. בפרופיל הביטוי של 8 miRNAs נבחרים דוגמאות Exosomal. נתונים אלה, המוצגים סולם לוגריתמי, להפגין throug כיפרוטוקול h זה אינו ריאלי לראות למעלה או למטה-רגולציה של miRNAs exosomal שנבחרו מחולים פלזמה NSCLC קליני (PAD1-12), מובילה לגילוי הפוטנציאל של סמנים ביולוגיים exosomal של NSCLC. הנתונים מוצגים לקפל ביטוי ביחס לנבדקים בריאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם פרוטוקול משולב זה ניתן היה לבצע ניתוח מירנה exosomal מפלזמה של חולי NSCLC. נתונים אלה עשויים לשקף את מצב המחלה, אך זו צריכה להיות מאושרת על ידי מחקר נוסף.

הפרוטוקול המשמש במאמר זה התבסס על ערכה מסחרית לבידוד exosome. הסיבה לכך הייתה כי נהלי בידוד ידוע האחרים (למשל., Ultracentrifugation שיפוע צפיפות) דורשים תהליכים ידניים יותר, מה שמוביל סטנדרטיזציה מוגבל. אף על פי כן, אחת המגבלות של פרוטוקול זה הוא כי בהשוואה עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות לבידוד exosome, ultracentrifugation שיפוע צפיפות נשאר טכניקה שימושית מאוד בבידוד exosome המנצלת את הצפיפות הספציפית של exosomes (בין 1.13 - 1.19 g / ml). שינוי פוטנציאל הוא שילוב של שני ההליכים, אשר עשוי להיות תקן זהב בתחום זה.

האפשרות לעבד sampl הקליניes עם טיפול RNase נתן לנו דגימות טהורות ללא זיהום של מחזורי miRNAs. עם זאת, הנוכחות של RNase אנזימים בדגימות יכול להשפיע על כמות מירנה exosomal לאחר תמוגה exosome. מסיבה זו בחרנו ערכת טיפול proteinase K, כדי לחסל חלבונים מזהמים במחזור להשפיל אנזימים RNase.

לאחר סטנדרטיזציה של כל הליכי הבידוד, האפיון בעתיד וניתוח מירנה של נתונים אלה יכולים להוות כלי שימושי כדי לזהות סמנים ביולוגיים בצורה לא פולשנית במהלך אבחון ראשוני ומעקב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

Tags

רפואה גיליון 111 Exosomes miRNAs NSCLC ביופסיה נוזלית סרטן ביומרקר
ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giallombardo, M., Chacártegui… More

Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter