Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

KHDAK (küçük hücre dışı akciğer kanseri) hastalarında düşük sağkalım oranı ilerlemiş hastalık ve kötü erken teşhis 1 tedavilerin sınırlı etkinliği kaynaklanmaktadır. NSCLC hasta alt grubunda keşfedilmiştir EGFR gen aktive eden mutasyonu, kinaz inhibitörleri (TKİ) tirozin hassasiyet kazandırdığı bilinmektedir. Ne yazık ki, EGFR mutasyona uğramış KHDAK hastalarının çoğunluğu TKİ direncini 2 gelişir. Özellikle, bu bağlamda, bir doğru tanı zorunludur. nedeniyle tümörlerin lokalizasyonu, için, genel olarak KHDAK biyopsi dokusu elde her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, çeşitli çalışmalar bu biyolojik veriler elde etmek non-invaziv yöntemler kullanan devam etmektedir. Eksozomlar non-invaziv tekniklerin 3 ile tanısal ve prognostik değerlerini elde etmek için incelenmiştir olabilir sıvı biyopsi bileşenler olarak tarif edilmiştir.

e - (100 nm çapında 40) eksozomlar nanovesicles vardırFizyolojik ve patolojik koşullar 4 hem de farklı hücre tipleri tarafından yayımlanan ndocytic kökenli. Onlar, protein, lipidler, mRNA ve microRNA taşıyabilir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda tümör hücreleri, anjiyogenez, stromal ve hücre dışı matriks yeniden ve ilaç direncinin 5 büyüme ve hayatta kalma etkileyebilir tümör kaynaklı Eksozomlann, bir pleiotropik rol oynadığını düşündürmektedir.

MikroRNA'lar (miRNA'ların) hedef mRNA 3'-UTR bağlanması ve bozunmaya karşı ya da olmayan bir çeviri 6 mRNA lider, transkripsiyon sonrası düzenleme katılan kısa kodlayıcı olmayan RNA bulunmaktadır. Eksozomlann içine miRNA'ların seçici sıralama tarif edilmiştir. Bu bağlamda, son zamanlarda, in vitro ve in vivo olarak, kurkumin tedavisi 7 sonrası kronik miyelojen lösemi hücre hatları tarafından yayımlanan eksozom Mir-21 (onkogenik etkiler ile iyi bilinen bir miRNA'nın) seçici bir ambalaj gösterilmiştir.

exosomal miRNA profil primer tümörün miRNA profiline benzer ve bu özellik erken tanı ve prognoz 3 yararlanılabilir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı PCR ile, karakterize etmek için bir olasılık, hastalığın moleküler profili ile ilişkili seçilen miRNA'lar örn., Diğerlerinin 8 arasında EGFR mutasyonları.

Burada, NSCLC dekorele miRNA'ların 8-9 seçilmiş bir panelin analizi NSCLC hastaların kanında serbest eksozom izole edildi açıklanmaktadır. hastalardan onam raporu bilgilendirmek alındıktan sonra, 12 KHDAK hastalarında ve 6 sağlıklı kontrollerin plazma, analiz edildi. eksozom yalıtım üreticinin protokolüne göre, ticari kiti ile gerçekleştirildi. eksozom izolasyon önce plazma numuneleri kirletici dolaşım miRNA'lar indirgeme amacıyla, RNase ile muamele edilmiştir. Biz nedeniyle diğer Techni sınırlı standardizasyona ticari kit ile bu analizi gerçekleştirmek için kararklinik örneklerden çalışırken özellikle önemlidir ques (örn., Ultrasantrifügasyon). Bu kit RNAse aşağılamak ve böylece exosome Parçalama işleminden sonra exosomal miRNA'lar düşmeye riskini azaltır bir Proteinaz K tedavisi içerir. MikroRNA analizi duyarlı ve spesifik Real-Time PCR analizi ile yapıldı; mir 1228-3p, formül 2'ye uygun bir endojen bir kontrol olarak kullanıldı ve veri normalleştirildi - ΔΔct. Kontrol değerleri temel olarak kullanılır ve Sonuçlar bir logaritmik skalada gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Exosome İzolasyonu

Not: Plazma örneklerinden eksozomlann izole, üreticinin protokolüne uygun olarak ve ekleme RNAse işlenerek, ticari bir kit ile gerçekleştirildi: (bu adım biyolojik numunelerin manipülasyonu için özel yasal prosedür takip kişisel ve çevre koruma ekipmanları ile gerçekleştirilmelidir ).

  1. -80 ° C'de saklandı Her örneğin plazma 1 ml, alın ve buz üzerine yerleştirin.
  2. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüjleyin; Bu pasaj hücreleri ve enkaz kaldırmak için zorunludur.
  3. yeni bir 1.5 ml'lik tübe temiz plazma ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 20 dakika süre ile 10,000 x g 'de, yeni bir tüp santrifüjleyin.
  5. yeni bir 1.5 ml'lik tübe temiz plazma ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
  6. 10 dakika içinde 37 ° C 'de tüp süpernatana RNAse 100 ng / ml ilave edilir ve kuluçkayaSipariş RNA'ların dolaşan aşağılamak için.
  7. Yeni 2 ml tüp tüm tedavi plazma aktarın ve 1x PBS 0.5 hacim kazandırmak.
  8. çözümler karıştırmak için örnek vorteksleyin.
  9. Örnek Proteinaz K çözeltisi (kit içine) 0,05 hacimleri ekleyin.
  10. Girdap numune ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  11. örnek exosome yağış tamponu 0.2 hacim kazandırmak ve tersine çevirerek çözüm karıştırın.
  12. 30 dakika boyunca 8 ° C, 2 ° C 'de örnek inkübe ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin.
  13. Aspire ve supernatant atın. Pelet izole eksozomlar içerir.
  14. eksozomlar tekrar süspansiyon için, eksozom pelet seçili geçici bellek ekleyin. Tampon seçimi, bu durumda, planlanan alt analiz bağlıdır:
    1. TEM analizi gerçekleştirmek için 1x PBS 100 ul ekle.
    2. Spesifik liziz BUF 346.5 ul ekle(Ticari kit) RNA ekstraksiyonu (: kimyasal tehlike DİKKAT) için fer.
    3. ekstraksiyon için lizis tamponu 100 ul ekle (Tris-HCI 50 mM, pH 7.6 - NaCl 300 mM - Triton X-100% 0.5 - PMSF 1 mM - Löpeptin / Aprotinin 10 ug / ml) Western Blot analizi gerçekleştirmek için. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler).
  15. -20 ° C'de yeniden süspansiyon haline eksozomlar saklayın.

Western Blot analizi ile 2. Exosome Karakterizasyonu

Not: İzole nanovesicles karakterize etmek için, Alix ve TSG101 (iyi bilinen exosomal işaretleri) karşı antikorlar ile Western blot önerilir.

  1. Liziz tamponu eksozom pelet yeniden süspansiyon işleminden sonra, exosomal membran çözünmesi için 1 saat boyunca buz üzerine yerleştirin.
  2. 10 dakika için 12,000 g'da lizat santrifüj ile pelet bozmadan yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.
  3. toplam exosomal protein conten ölçmekBradford tahlili ya da başka yöntemler ile T ve yük Tris / glisin SDS içinde oyuk başına proteinlerin 50 ug -% 8 poliakrilamid jeli. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler).
  4. kimyasal: (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS), 1 saat boyunca 120 V'de 30 dakika (DİKKAT tamponu ile çalışan,% 8 SDS-PAGE jel elektroforezi proteinleri (ve uygun moleküler ağırlıklı işaretleyici) Ayrı ).
  5. (: Kimyasal tehlikeler DİKKAT) sabit bir 50 V de 1 saat boyunca 4 ° C soğuk transfer tampon maddesi (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 metanol) ile yapılan elektro bir nitroselüloz membran proteini aktarın.
  6. 1x TBS -Tween% 0.1 içinde% 5 yağsız kuru süt ile yavaş ajitasyon 1 st için membran engeller.
  7. Tween,% 0.1 - 1 x TBS ile hızlı bir çalkalama, 5 dakika boyunca zarın 4 kez yıkayın.
  8. Alix ve uygun tampon içinde TSG101 (membranı başına bir) karşı birincil antikor ekleyin (buna göre üreticiden antikor veri sayfasına) ve membran O / N inkübe; Yavaş ajitasyon.
  9. Aşırı antikorları ayıklamak için Tween,% 0.1 - 1 x membrana TBS ile hızlı bir çalkalama içinde 5 dakika için 5 kez yıkayın.
  10. Uygun tampon maddesi içinde (dolayısıyla bir üreticiden antikor veri sayfasına) uygun bir ikincil antikor ilave edin ve yavaş ajitasyon 1 st için membran inkübe edin.
  11. Aşırı antikorları ayıklamak için Tween,% 0.1 - 1 x membrana TBS ile hızlı bir çalkalama içinde 5 dakika için 5 kez yıkayın.
  12. Kemiluminesan analizi 11 tarafından seçilen protein algılar.

TEM Analizi ile 3. Exosome Karakterizasyonu

Not: İzole eksozomlar görselleştirmek için, TEM (Transmisyon Elektron Mikroskobu) analizi yapılmıştır.

  1. Talep ~ 10 ug, bir Parafilm 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi sağlam eksozomlann numunenin (daha önce Bradford tahlili ile nicelleştirilmiştir) ve örnek alınır, 1 saat boyunca bir formvar karbon kaplı nikel ızgara bırakın.
    2. <li> PBS damla 1x üç 40 ul üzerine konumlandırarak grid 3 kere yıkayın.
  2. Beş 30 ul ultra saf su damlaları üzerine konumlandırarak ızgara 5 kez yıkayın.
  3. 10 dakika:% 2.5 gluteraldehit (kimyasal tehlike DİKKAT) bir damla ekleyerek örnek sabitleyin.
  4. PBS damla 1x üç 40 ul üzerine konumlandırarak grid 3 kere yıkayın.
  5. % 2 uranil asetat bir damla ekleyin (DİKKAT: kimyasal tehlikeler) ve örnek kontrast için 15 dakika süreyle bunun üstüne ızgara koydu.
  6. % 0.13 metilselüloz damla örnek yerleştirme (DİKKAT: Kimyasal tehlikeleri) ve% 0.4 uranil asetat ve 10 dakika boyunca damla üstüne ızgara inkübe edilir.
  7. Yavaşça bir emici kağıt sıvı aşırı kaldırmak ve kaplamalı yüzü yukarı bakacak şekilde 5 dakika süreyle ızgara kurutun.
  8. Transmisyon elektron mikroskobu 12 tarafından ızgara inceleyin.

4. Exosomal RNA Ekstraksiyon ve miktarının belirlenmesi

Not: yönlü kullan kararüreticinin protokolüne göre, bir ticari kit kullanılarak exosomal örneklerinden total RNA ekstraksiyonu kapatýnýz: (DİKKAT: kimyasal tehlikeler, üreticinin protokolü ve yönergeleri gözden).

  1. lizis tamponu 346,5 ul exosome pelet tabanda sonra β-mercaptoethanol 3.5 ul ekleyin: kuvvetlice (DİKKAT kimyasal tehlikeler) ve vorteks; Bu pasaj, lipid membranlar yok etmek için zorunludur.
  2. 1 dakika boyunca 11.000 x g'de bir toplama tüpüne ve santrifüj yıkama kolonuna lizat ekleyin. Santrifüj işleminden sonra, kolon atın ve yeni bir 1.5 mL RNaz içermeyen tüp filtrat aktarın.
  3. % 70 Etanol 350 ul ekleyin (DİKKAT: kimyasal tehlikeler) ve 5 saniye boyunca vorteks karıştırın.
  4. 8000 x g'de 30 saniye boyunca çözme sütun ve santrifüj lizat yükleyin. Santrifüj işleminden sonra flowthrough atmak ve yeni bir toplama tüpüne sütun aktarın.
  5. tuzsuzlaştırma Buffe 350 ul yükleyin1 dakika boyunca 11.000 x g'de r ve santrifüj. Santrifüj işleminden sonra flowthrough atmak ve aynı toplama tüpüne sütun döndürür.
  6. sütun silis membranı üzerinde DNaz I, reaksiyon karışımı 95 ul (yeniden DNase 10 ul I her bir örnek için, DNase tamponu 90 ul +) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. (DİKKAT: kimyasal tehlike)
  7. 1 dakika boyunca 11.000 x g'de kolon ve santrifüj: (kimyasal tehlike DİKKAT) yıkama tamponu 200 ul ekleyin. Yeni bir toplama tüpüne sütun yerleştirin.
  8. 1 dakika süre ile 11,000 x g 'de kolon ve santrifüj yıkama tampon 600 ul ekle. Santrifüj işleminden sonra, flowthrough atmak ve aynı toplama tüpüne sütun yerleştirin.
  9. 2 dakika boyunca 11.000 x g'de kolon ve santrifüj yıkama tamponu 250 ul ekleyin. 1.5 ml RNAse ücretsiz tüp içine sütun yerleştirin.
  10. 11.000 RNaz içermeyen su 40 ul RNA ve santrifüj Zehir 5; için 1 dakika için G, bu küçük bir hacim içinde, yüksek bir RNA konsantrasyonu elde etmek için.
  11. Hemen -80 ° C 'de potansiyel degradasyonu veya mağaza önlemek için buz üzerinde elüt RNA yerleştirin.
  12. RNA içeriği ölçmek. Not: Burada, RNA nicemleme spektrofotometre ile numunenin 1 ul kullanılarak yapıldı.

Exosomal miRNA'lar 5. Retrotrascription

Not: eksozom bölgesindeki miRNA'ların içeriği açıklanan sınırlı miktarına, her miRNA için ayrı bir deney kullanılarak ticari bir kit ile seçilen miRNA'ların ters transkripsiyon yapılmasına karar edildi nedeniyle, imalatçının protokolüne göre yöntem. Her bir örnek için, NSCLC durumuna ilişkili 8 miRNA'ların (miR-30b seçilmiştir; miR-103;, miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222 ve miR-1228- miR-30 3p), endojen kontrol olarak.

  1. Ters transkripsiyon ana karışımı (RT mix) hazırlayın. de tarif edildiği gibi, her bir reaksiyon için, RT karışımı 7 ul hazırlanmasıhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (indirmek için tıklayınız) (DİKKAT: kimyasal tehlike).
    Not: Bu deneyde, 9 farklı RT karışımı, her bir numune için hazırlanmıştır.
  2. İyice karıştırın ve buz üzerinde RT karışımı saklayın. Reaksiyon tüp başına RT karışımı 7 ul ekleyin.
  3. Reaksiyon tüp başına numune RNA (toplam RNA 10 ug) 5 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  4. İlgili reaksiyon tüpüne set her testte: (kimyasal tehlike DİKKAT) 5x ters transkripsiyon primerlerin 3 ul ekleyin.
  5. Yavaş karıştırın tüpü kapatmak ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  6. termal döngü halinde, reaksiyon tüpü yük ve 30 dakika boyunca 16 ° C 'de, aşağıdaki parametre değerleri (TUT ters transkripsiyon reaksiyonu başlatmak, 30 dakika boyunca 42 ° C'de tutuldu; 5 dakika için 85 ° C de sabit; TUT ∞ 4 ° C).

Exosomal miRNA'lar 6. Real Time PCR Analizi

Not: Bu analiz olduNumune başına üç biyolojik ve teknik çoğaltır ile Real Time PCR (qPCR) için bir ticari kit kullanılarak yapıldı.

  1. Her reaksiyon için, Real Time PCR karışımı 17.67 ul (PCR Master Mix + Nükleazlar içermeyen su 7.67 ul 10 ul) hazırlamak, karıştırın ve buz koymak. (DİKKAT: kimyasal tehlike)
  2. (: Kimyasal tehlike DİKKAT) 20x qPCR primerlerin, her PCR tüpü için, 1 ul ekleyin.
  3. Her iyi plakada qPCR karışımı 18.67 ul yerleştirin.
  4. muhabir iyi plaka içine ters transkripsiyon ürünü 1.33 ul ekleyin.
  5. plaka kapatın ve (300 gx 5 sn) dönerler.
  6. Gerçek Zamanlı PCR sisteminin plaka yerleştirin ve Aşağıdaki PCR koşulları kullanılarak Çalışan: 10 dakika boyunca 95 ° C 'de sabit; 95 ° C'de 15 saniye ve 60 ° C'de 60 saniye 40 döngü. ΔΔct 13 - işlem, formül 2'ye göre veri normalleştirmek ve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

KHDAK hastalarının 12 plazma ve 6 sağlıklı kontrol olmak üzere toplam plazmadan exosome izolasyonu için ticari kit ile işlendi. Her bir numune, exosomal belirteçleri alix (96 kDa) ve TSG101 (43 kDa) değerlendirmek için Western Blot analizi ile işlenmiştir. Bu sonuçların bir örneği, plazma örneklerinden eksozom izolasyonu bu protokol ile mümkün olduğunu gösteren, Şekil 1 'de 3 örnek için gösterilmiştir.

biyofiziksel exosomal örnekleri karakterize etmek amacıyla, TEM analizi yapıldı. 100 nm'de (Şekil 2) - TEM 40 arasında yer alan bu izolasyon protokolü ile elde edilen nanovesicles exosomal boyutu aralığı içinde bir ortalama boyutu olduğunu göstermiştir.

exosome izolasyonu ve karakterizasyonu sonra biz onların miRNA'lar içeriği araştırıldı. Bu deregulat bilinen 8 özel miRNA'lar seçilenNSCLC'de ed. Iç kontrol olarak, daha önce farklı tümör tiplerinin 10 istikrarlı ve verimli bir endojen bir kontrol olarak doğrulanmıştır miR-1228 kullanılmıştır. Bu sonuçlara göre miR-1228 güvenilir ve istikrarlı bir endojen kontrol edilmesidir. Sağlıklı vericilerden ve akciğer kanseri hastaları arasında MiRNA seçilen 8 ekspresyon seviyesi karşılaştırıldığında, bu miRNA'ların güçlü analiz klinik örneklerde deregüle olduğu bulunmuştur. Şekil 3'te 8 Seçilen miRNA'lar ifade deseni analiz 12 numuneler (PAD1-12) için bir logaritmik ölçekte gösterilir. Tüm miRNA'lar her numunede bulunduğunu nedeniyle örneklerin sınırlı miktarda biz istatistiksel analiz edemez.

Şekil 1
Şekil Alix ve TSG101 3 Exosomal Örnekleri 1. Western Blot Analizi. Western Blot mevcudiyetini göstermektedirtanınmış exosomal belirteçler, ALIX ve TSG-101, analiz edilen örnekler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Exosomal Örnekleri Şekil 2. TEM Analizi Bu sonuçlar 40 arasında, izole nanovesicles bir çap ortalamasına sahip olduğunu göstermektedir -.. 100 nm, exosomal aralığı içinde bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Exosomal Örneklerinde 8 seçilmiş miRNA'ların Şekil 3. ifade profili. Logaritma cetvelinde gösterilir bu veriler, bu throug göstermektedirh Bu protokol KHDAK exosomal biyobelirteçlerinin potansiyel keşfine yol yukarı bakın veya yük atma klinik KHDAK olgularında plazma (PAD1-12) seçilen exosomal miRNA'lar etmek mümkündür. Veri sağlıklı kontrollere göre ifadenin kat olarak gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu kombine protokolü sayesinde KHDAK hastalarının plazmadan bir exosomal miRNA analizi gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Bu veriler, bir hastalık durumu göstermektedir, ancak bu daha fazla çalışma ile teyit edilmesi gerekmektedir.

Bu yazıda kullanılan protokol, eksozom izolasyonu için ticari bir kit dayanıyordu. Sebebi bilinen diğer izolasyon prosedürleri (örneğin., Yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon) sınırlı bir standardizasyona lider, daha fazla manuel prosedürleri gerektiren oldu. Bununla birlikte bu protokolün sınırlamaları bir eksozom izolasyonu için yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile karşılaştırıldığında, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme (- 1.19 ug / ml 1.13 arasında) eksozom özgül yoğunluğa kullanan eksozom izolasyon çok faydalı bir teknik kalmasıdır. Potansiyel değişiklik bu alanda bir altın standart olabilir hem prosedürlerin, bir karışımıdır.

olasılığı klinik sampl işlemeRNaz tedavi ile es miRNA'lar dolaşan bir kirlenme olmadan bize saf örnekleri vermiştir. Bununla birlikte, RNaz varlığı eksozom lizizi sonrasında exosomal miRNA'nın miktarını etkileyebilir örneklerde enzim. Bu nedenle, biz sirkülasyon kirletici proteinleri ortadan kaldırmak için ve RNaz enzim indirgeme amacıyla, Proteinaz K, tedaviden bir kit seçtik.

tüm izolasyon prosedürlerinin standardizasyonu sonra, bu verilerin gelecekte karakterizasyonu ve miRNA analizi ilk tanıdan sırasında bir non-invaziv bir şekilde biyomarkerları tespit ve takibi için yararlı bir araç oluşturabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

Tags

Tıp Sayı 111 Eksozomlar miRNA'lar KHDAK Sıvı biyopsisi Kanser Biyomarker
qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giallombardo, M., Chacártegui… More

Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter