Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के अलगाव

Published: July 3, 2016 doi: 10.3791/53985
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, University of Arizona, Tucson

Abstract

Endothelial कोशिकाओं से रक्त वाहिकाओं की भीतरी दीवार लाइन और संवहनी टोन, संवहनी पारगम्यता, और नए संवहनी गठन के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Endothelial सेल रोग के विकास और इस्कीमिक हृदय रोग सहित कई हृदय रोगों की प्रगति में फंसा है। समारोह और कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के लक्षण वर्णन की जांच करने के लिए, सेल अलगाव पहला कदम है और यह बाद के प्रयोगों का संचालन करने के लिए उच्च शुद्धता और मात्रा की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक कारगर तरीका बताता है। माउस दिल विच्छेदित और छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है। दिल Dispase और collagenase द्वितीय का उपयोग कर के पाचन के बाद, कोशिकाओं धोया और चुंबकीय मोती जो विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित हैं साथ incubated हैं। endothelial कोशिकाओं के साथ मोती धोया कई बार कर रहे हैं और इमेजिंग और आणविक जैविक experime सहित विभिन्न अनुप्रयोगों में उपयोग करने के लिए तैयार हैंएनटीएस। कुशल अलगाव 90% से अधिक शुद्धता के साथ एक दिल के अनुसार लगभग 10 4 कोशिकाओं पैदावार।

Introduction

विभिन्न हृदय रोगों और चयापचय विकारों के माउस मॉडल शारीरिक और आणविक परिवर्तन जो रोगियों में पाए जाने वाले के समान हैं सहन। इसके अलावा, चूहों के आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि हमें विकास और रोगों की प्रगति में विशिष्ट जीन की रोगजनक भूमिका की जांच करने की अनुमति देता है। आजकल, सेल प्रकार विशिष्ट जीन-दस्तक में या आउट चूहों को आसानी से कई प्रयोगशालाओं और mRNA की माप और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में प्रोटीन के स्तर में उत्पन्न कर रहे हैं कि क्या निर्धारित चूहों वास्तव में आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है में पहला कदम है।

अन्तःस्तर endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) है कि लाइनों भीतरी दीवार नाड़ी की एक पतली परत भी है। Endothelial कोशिकाओं नाड़ी तनाव, संवहनी पारगम्यता, और नए संवहनी गठन 1,2 विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Endothelial रोग कई रोग की स्थिति और endothelial समारोह में परिवर्तन की एक बानगी विभिन्न कार को जन्म दे सकता हैdiovascular रोगों 3,4। यह शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत endothelial कोशिकाओं के समारोह में अध्ययन करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है।

वहाँ ईसीएस 5-8 अलग-थलग करने के कई तरीके हैं और अलगाव विधि के आधार पर जो ऊतकों और प्रजातियों का इस्तेमाल किया जाएगा अनुकूलित किया जाना है। क्योंकि विभिन्न ऊतकों से ईसीएस उनकी सतह मार्करों के लिए सम्मान और प्रोटीन अभिव्यक्ति 9 के साथ विविधता के उच्च स्तर को प्रदर्शित यह वह जगह है। endothelial कोशिकाओं के सफल अलगाव अक्सर चुनौतीपूर्ण हो सकता है और प्रशिक्षण और अभ्यास के कुछ डिग्री की आवश्यकता है। एक बार हासिल की है, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित अलगाव की विधि स्थिर और कुशल साबित होता है।

इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए उच्च गुणवत्ता और मात्रा के प्राप्त करने के लिए माउस कोरोनरी ईसीएस (MCECs) है। हालांकि एक दिल से एकत्र कोशिकाओं की मात्रा अन्य तकनीकों का उपयोग अन्य ऊतकों से एकत्र कोशिकाओं की तुलना में कम है, इस तकनीक को अभी भी शर्त प्रदान करता हैआतंकवाद गुणवत्ता। जिसके परिणामस्वरूप जनसंख्या में endothelial कोशिकाओं की शुद्धता 90% से अधिक है। इस प्रकार, इस तकनीक अनुप्रयोगों है कि इस तरह के सेल इमेजिंग के रूप में विशुद्ध रूप से अलग-थलग endothelial कोशिकाओं पर भरोसा करने के लिए आदर्श होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

चूहों पर शोध संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) एरिजोना विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था।

नोट: धारा 1, 2 और 3 दिन बाहर सेटअप के रूप में प्रयोग से पहले किया जाना चाहिए।

1. तैयारी समाधान

  1. CD31 बफर (50 एमएल)
    1. 50 मिलीलीटर 1 × फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़े। वजन 0.05 ग्राम गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.037 जी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और 50 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने के बारे में और 1 घंटे पाउडर घुल तक के लिए बारी बारी से करने के लिए ट्यूब डाल दिया। , 7.4 पीएच को समायोजित एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, और उपयोग करें जब तक 4 सेल्सियस पर स्टोर।
  2. हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) HEPES के साथ (500 मिलीलीटर)
    1. HEPES की 1.1915 जी HBSS समाधान में 10 मिमी HEPES बनाने के लिए और अच्छी तरह से मिश्रण में जोड़ें। पीएच उपाय और 7.4 करने के लिए समायोजित करें। फिल्टर और दुकान 4 परसी।
  3. 1x क्रेब के समाधान (1 एल)
    1. 10 × क्रेब के समाधान [तालिका 1] की 100 मिलीलीटर एक 1 एल कुप्पी में आसुत जल दोगुना करने के लिए जोड़ें। वजन 2.1 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट और 2 जी डी ग्लूकोज और कुप्पी में जोड़ें। मिक्स और 1 एल के लिए कुल मात्रा को समायोजित
    2. हुड के अंदर 30 मिनट और फिल्टर समाधान के लिए के साथ 95% 2 हे / 5% सीओ 2 गैस बुलबुला समाधान। 4 सेल्सियस पर स्टोर और प्रयोग के दौरान बर्फ पर रहते हैं।

2. चुंबकीय मोती तैयारी

  1. प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (नमूना प्रति एक ट्यूब) में 1 मिलीलीटर CD31 बफर जोड़ें। भेड़ विरोधी चूहा आईजीजी मोती मिलाएं और प्रत्येक नमूना [तालिका 1] को उचित मात्रा में जोड़ने। सख्ती 30 बार नलियों हिला और झटकों के 1 मिनट के लिए चुंबकीय थाली में उन्हें जगह है। नलियों जबकि प्लेट पर खुला और एक बाल्टी में समाधान डंप।
  2. प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर CD31 बफर जोड़ें। 2 μl चूहा विरोधी माउस CD31 विरोधी जोड़ेप्रत्येक ट्यूब शरीर और 4 डिग्री सेल्सियस पर नलियों हे / एन घुमाएगी।

3. autoclaving

  1. सभी शल्य चिकित्सा उपकरण और विंदुक युक्तियाँ आटोक्लेव। विंदुक युक्तियाँ के सिरों में कटौती इतना है कि वहाँ 4 अलग व्यास के साथ सुझाव दिए गए हैं, व्यापक से संकीर्ण करने के लिए। खरीदारों के लिए अनुमानित व्यास 3 मिमी, 2.5 मिमी, 2 मिमी, 1.5 मिमी और क्रमशः रहे हैं। सुझावों के कट और 121 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर नसबंदी के 30 मिनट के साथ पहले दिन आटोक्लेव।
    नोट: धारा 4 - 11 प्रयोग के दिन पर बाहर किया जाना चाहिए।

4. तैयारी समाधान

  1. कपड़े धोने बफर M199 में 2% लौह दृढ़ बछड़ा सीरम (आईएफसी) से युक्त तैयार करें। इमेजिंग के लिए, 30 मिलीग्राम / माउस तैयार करते हैं।
  2. एंजाइम समाधान (10 मिलीग्राम / नमूना) तैयार करें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 0.6 यूनिट / Dispase की मिलीग्राम और 1 मिलीग्राम / कोलेजिनेस प्रकार द्वितीय मिलीलीटर वजन। M199 जोड़ें और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब बारी बारी से। insid एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टरई डाकू और उपयोग करें जब तक 4 सेल्सियस पर रहते हैं।
  3. हेपरिन के साथ HBSS / HEPES तैयार करें। 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिमी HEPES के साथ HBSS के 10 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब को हेपरिन के 100 μl जोड़ें और उपयोग करें जब तक 4 सेल्सियस पर रहते हैं।

5. धुलाई मोती

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेटर से मोतियों के साथ ट्यूबों के बाहर ले जाओ और हुड के लिए ले आओ। चुंबकीय थाली में ट्यूबों की जगह और 1 मिनट के लिए हिला। समाधान डंप और प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर CD31 बफर जोड़ें।
  2. चुंबकीय थाली से बाहर नलियों ले लो और सख्ती से हिला 30 बार। चुंबकीय थाली में ट्यूबों वापस रखो और 3 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ। पूरा होने के बाद, 4C को वापस नलियों डाल दिया है और उपयोग करें जब तक घूर्णन रहते हैं।

6. विच्छेदन

  1. रक्त जमावट को रोकने के लिए हेपरिन की 0.1 मिलीलीटर के साथ intraperitoneally चूहों इंजेक्षन। 10 मिनट रुको, तो Pentobarbital की 0.01 मिलीग्राम की intraperitoneal इंजेक्शन का प्रयोग चूहों anesthetize। अगर माउस महसूस कर रही है की जाँच करेंपैर pinching द्वारा दर्द।
  2. ऊपर सिर के साथ एक polystyrene बोर्ड पर माउस प्लेस और पिन के साथ हथियारों की पकड़ है। गले के ऊपरी वक्ष क्षेत्र में त्वचा में कटौती करने के लिए संदंश और कठिन कट-कैंची का प्रयोग करें।
  3. सिर्फ डायाफ्राम से ऊपर रिब पिंजरे के बीच में एक कटौती करें। बग़ल में और ऊपर की तरफ गले की ओर हड्डी कट एक त्रिकोण हृदय और फेफड़ों को उजागर करने के लिए। सिर्फ डायाफ्राम से ऊपर महाधमनी में कटौती।
  4. खींच के बिना संदंश के साथ थाइमस पकड़ो और कैंची का उपयोग एक साथ फेफड़े और दिल को दूर करने के लिए ध्यान से किसी भी संयोजी ऊतक में कटौती। 1 × क्रेब के साथ एक बीकर में रखें ऊतकों, संदंश के साथ मिलाने और 1 × क्रेब के साथ 6 सेमी डिश को हस्तांतरण।
  5. कैंची और संदंश का उपयोग फेफड़ों पालियों निकालें। महाधमनी में एक 20 जी बाँझ कैथेटर डालें। HBSS / हेपरिन के साथ कोरोनरी संचार प्रणाली में रक्त फ्लश। वेंट्रिकल में एक छोटे से कटौती करें, दिल हिला और M199 का एक नमूना ट्यूब को हस्तांतरण। बर्फ पर ट्यूबों रखें।
वर्ग = "jove_title"> 7। ऊतक पाचन

  1. एंजाइम समाधान के 10 मिलीलीटर से भरा एक 6 सेमी डिश के लिए दिल स्थानांतरण और कैंची का उपयोग छोटे टुकड़ों में कीमा। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में व्यंजन 15 मिनट के लिए रखें। ऊपर एक कट अंत के साथ एक टिप के माध्यम से नीचे 30 बार pipetting और ऊतक आसान माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए सामग्री से पचता आंदोलन।
  2. एक और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया। आंदोलन तीन बार दोहराएँ, हर बार सबसे बड़ी खुलने से पिपेट युक्तियों का उपयोग संकीर्ण और प्रत्येक के बीच 15 मिनट ऊष्मायन के लिए।
  3. पिछले 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, नमूने बाहर और हुड में ले। Pipet समाधान ऊपर और नीचे 30 बार संकीर्ण खोलने के साथ और एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पारित pipet टिप का उपयोग कर।
  4. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर 10 मिलीलीटर धोने बफर के साथ पकवान धोने और सेल झरनी पर स्थानांतरित। आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 ग्राम पर अपकेंद्रित्र और स्पिन में 50 मिलीलीटर ट्यूबों रखो।
itle "> 8। धोने और संयुग्मन मोती के साथ

  1. गोली बाधा पहुँचा के बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें। 5 मिलीलीटर धोने बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  2. पहले की एक समय में एक माला और काम के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार एक ट्यूब पर जाओ। चुंबकीय थाली में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब रखो, 3 बार मिलाने और यह खुला।
  3. पिछले सेंट्रीफ्यूज के बाद, गोली बाधा पहुँचा के बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। सख्ती flicking द्वारा सेल clumps अलग।
  4. 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर धोने बफर जोड़ें और 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ कोशिकाओं मिश्रण। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से समाधान डंप और मोती के लिए 50 मिलीलीटर ट्यूब से सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें। झाड़ नलियों 30 बार फिर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बारी बारी से।

9. सेल संस्कृति / इमेजिंग के लिए तैयारी

  1. चढ़ाना कोशिकाओं के लिए कक्षों की तैयारी। चैम्बर के लिए जिलेटिन समाधान (5% w / वी, 300 μl) अच्छी तरह से कोट करने के लिए सतह को जोड़े और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। ऊष्मायन, रेम के बादove जिलेटिन और शुष्क सतह।
  2. रोटेशन के 30 मिनट के बाद मोती / कोशिकाओं के साथ ट्यूबों के बाहर ले जाओ और हुड के अंदर चुंबकीय थाली में डाल दिया। 2 मिनट, डंप के लिए हिला और 1 मिलीलीटर धोने बफर जोड़ें।
  3. थाली से बाहर नलियों लो, सख्ती 30 बार तब झटका 30 बार हिला। चुंबकीय थाली में उन्हें वापस रखो और 1 मिनट के लिए हिला। 5 washes के एक कुल के लिए 4 बार दोहराएँ, लेकिन 1 मिनट प्लेट पर झटकों के साथ।
  4. पिछले धोने के बाद, एक ट्यूब बाहर ले और एक समय में प्रत्येक ट्यूब से एक पर काम करते हैं। हिला 30 बार फिर 30 बार झटका। चुंबकीय थाली पर डाल दिया और 1 मिनट के लिए हिला। डंप और (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म) जोड़ने के 1 मिलीलीटर 20% आईएफसी चुनाव आयोग मीडिया।
  5. हिला सख्ती 30 बार फिर 30 बार झटका। 500 μl के लिए pipet समायोजित करें और pipet और 10 गुना कम है। प्रत्येक कक्ष के लिए 500 μl स्थानांतरण।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखो और छोड़ हे / एन। अगले दिन, 10% FBS चुनाव आयोग मीडिया के साथ कोशिकाओं को धो लें।

10 वेस्टर्न ब्लाट (पश्चिम बंगाल) नमूने के लिए तैयारी

  1. Takबाहर ई रोटेशन के 1 घंटे के बाद मोती / कोशिकाओं के साथ ट्यूबों। उन्हें चुंबकीय थाली में रखो और 2 मिनट के लिए हिला। सतह पर तैरनेवाला डंप और 1 मिलीलीटर ठंड HBSS जोड़ें। हिला सख्ती 30 बार फिर 30 बार झटका। 3 washes के लिए दो बार दोहराएँ, लेकिन 1 मिनट प्लेट पर झटकों के साथ।
  2. पिछले धोने के बाद, चुंबकीय थाली पर ट्यूब डाल दिया है और 1 मिनट के लिए हिला। पिपेट का उपयोग बफर निकालें और एक विधि पहले से वर्णित 11,12 का उपयोग कर पश्चिम बंगाल के लिए कोशिकाओं lyse। एकत्र lysate आमतौर पर लगभग 30 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन का होता है।

11. इमेजिंग

  1. कोशिकाओं को एक कक्ष के लिए 250 μl के अंतिम मात्रा के साथ, मीडिया के साथ 3 बार धोएं। कोशिकाओं को दिल-acLDL के 1.5 μl जोड़ें। इस बिंदु से, अंधेरे में कोशिकाओं को रखने के लिए।
  2. 37 सी में 3.5 घंटे के लिए सेते हैं। Hoechst के 1.5 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और पीबीएस के साथ 37 ˚C.Wash कोशिकाओं पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ तय कर लो।
  3. 30 मील के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं और 5% के साथ ब्लॉक बीएसए पीबीएसआरटी पर एन। 1% बीएसए पीबीएस के साथ दो बार धोएं। 2 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए बीएस लेक्टिन-FITC 1% बीएसए पीबीएस का उपयोग पतला और प्रत्येक कक्ष के लिए 300 μl जोड़ें।
  4. 30 मिनट के लिए आरटी पर कक्षीय प्रकार के बरतन पर चैम्बर रखो। पीबीएस 3 बार से धो लें।
  5. FITC (Lectin धुंधला हो जाना, एक चुनाव आयोग मार्कर, / उत्तेजना उत्सर्जन 488 एनएम / 519 एनएम), DAPI (Hoechst, एक परमाणु धुंधला हो जाना, उत्तेजना / 358 एनएम पर उत्सर्जन / के लिए 30 मिसे के लिए 200 मिसे के जोखिम समय के साथ फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं कल्पना 461 एनएम), और 557 एनएम / 576 एनएम) में TRITC (acLDL धुंधला हो जाना, एक चुनाव आयोग मार्कर, उत्तेजना / उत्सर्जन के लिए 300 मिसे। एक 20x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर छवियों मोल।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक माउस दिल से कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के सफल अलगाव आम तौर पर एक पत्थर के आकार के साथ 90% से अधिक शुद्धता के साथ चारों ओर 10 4 कोशिकाओं पैदावार। endothelial कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के लिए, सावधानी किसी भी संक्रमण से मुक्त एक बाँझ वातावरण सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल भर में लिया जाना चाहिए। लम्बी कोशिकाओं या आबादी के भीतर बढ़े कोशिकाओं की उपस्थिति अन्य प्रकार की कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और fibroblasts के साथ प्रदूषण को इंगित करता है। Endothelial सेल शुद्धता परीक्षण एक endothelial कोशिका की सतह मार्कर, बीएस Lectin और acLDL (चित्रा 1) के साथ कोशिकाओं को धुंधला द्वारा किया जाता है। सकारात्मक कोशिकाओं जो दोनों रंग दिखा रहे हैं का प्रतिशत MCEC में 90% से अधिक था। इस तरह की एक परिणाम का संकेत है कि तकनीक का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था।

पीबीएस (10x) (1 एल) </ Td>
सामग्री मेगावॉट राशि (छ)
NaCl 58.44 80
KCl 74.55 2
ना 2 4 HPO 141.96 6.1
के.एच. 2 4 पीओ 136.08 2
क्रेब्स (10x) (1 एल)
सामग्री मेगावॉट सान्द्र (मिमी) राशि (छ)
NaCl 58.44 118 69
KCl 74.56 4.7 3.5
2 CaCl • 2H 2 ओ 147 1.8 2.6
MgSO 4 • 7H 2 ओ 246.5 1.2 2.96 </ Td>
नः 2 4 पीओ 120 1.2 1.44
चुनाव आयोग मीडिया (20%) (500 मिलीलीटर)
सामग्री रकम
M199 444.5 मिलीलीटर
10 - 20 यू / एमएल हेपरिन 500 μl
डी-Valine 25 मिलीग्राम
आईएफसी 100 मिलीलीटर
ईजीएस 10 मिलीग्राम
पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 मिलीलीटर
मोतियों की राशि एक माउस के लिए इस्तेमाल किया जाएगा
इमेजिंग के लिए 5 μl
एफया डब्ल्यू बी / पीसीआर 10 μl

तालिका 1. इस्तेमाल समाधान के रासायनिक रचनाओं।

आकृति 1
चित्रा 1. MCECs। प्रतिदीप्ति छवियों की छवियों प्रतिनिधि चलता है कि माउस कोरोनरी ईसीएस (MCEC) दिल से पृथक चुनाव आयोग आबादी के उच्च शुद्धता दिखा रहे हैं। पवित्रता लाल रंग (ए) और MCEC में हरे रंग (बी) में लेक्टिन धुंधला की दोनों acLDL तेज द्वारा परीक्षण किया गया था। नाभिक नीले रंग में Hoechst (सी) से सना हुआ था। सकारात्मक कोशिकाओं जो दोनों रंग दिखा रहे हैं का प्रतिशत MCEC में 90% से अधिक था। बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधि है। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के आयन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया endothelial कोशिकाओं को अपनी सुविधा और संवर्धन की आसानी के कारण मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कर रहे हैं। हालांकि, अनुसंधान के एक बहुत अन्य विशिष्ट अंगों 10 से endothelial कोशिकाओं के अलगाव के द्वारा प्राप्त एक शारीरिक मॉडल की उपलब्धता की आवश्यकता है। Endothelial कोशिकाओं हृदय के ऊतकों की कोशिकाओं में एक बहुत ही मामूली आबादी को बनाने के लिए; उनके अलगाव और संवर्धन साबित बहुत मुश्किल हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल के भीतर तीन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। पहले रक्त में अच्छी तरह से भरा है। यह जरूरी है कि रक्त के भीतर ल्यूकोसाइट्स भी एक कोशिका की सतह मार्कर के रूप में CD31 व्यक्त करते हैं, और CD31 एंटीबॉडी के बंधन के लिए ईसीएस के खिलाफ मुकाबला होगा। अन्य endothelial कोशिकाओं को भी रक्त में मौजूद, निस्तब्धता हो सकता है के रूप में इस तरह की कोशिकाओं द्वारा प्रदूषण को रोकने के लिए आवश्यक है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम अलगाव की प्रक्रिया में एक बाँझ वातावरण बनाए रखना है। किसी भी संक्रमण resuप्राप्त कोशिकाओं की संख्या में नाटकीय कमी में एलटीएस। अंत में, तीसरे महत्वपूर्ण कदम ऐसा करने के लिए अलगाव की दक्षता में कमी होगी विफलता के रूप में, CD31 बफर का पीएच को समायोजित करने के लिए है।

सेल गुणवत्ता इस अलगाव के दौरान सबसे अधिक महत्वपूर्ण है। चिकनी पेशी सेल के विकास संस्कृति मीडिया के लिए हेपरिन का एक उचित मात्रा के अलावा द्वारा हिचकते जा सकता है। Fibroblast प्रसार मीडिया के लिए डी-Valine जोड़कर धीमा किया जा सकता है। Endothelial कोशिकाओं आदेश जनसंख्या endothelial सेल phenotype की शुद्धता के लिए परीक्षण करने में Dil-AcLDL और बीएस Lectin के साथ सह-धुंधला की तेज द्वारा होती जा सकता अस्थिर है और अपने व्यवहार में बदलाव तेजी से एक बार मूल ऊतक से बाहर ले जाया जा सकता है और सुसंस्कृत। तकनीक की एक सीमा है कि कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए कि वे अभी भी अपने phenotype बनाए रखने के संवर्धन के 5 दिनों के बाद नहीं किया जाना चाहिए है। यह जोरदार कोशिकाओं पारित करने के लिए नहीं की सिफारिश की है। प्राथमिक कोशिकाओं एक सुसंगत resu प्रदान करेगाएलटी।

कुल मिलाकर, तकनीक बकाया पवित्रता की कोशिकाओं की एक अच्छी संख्या में परिणाम है। आवश्यक कौशल के साथ, अलगाव की प्रक्रिया 6 घंटा के भीतर पूरा किया जा सकता है। यह या तो सेल संस्कृति या आणविक जैविक प्रयोग के लिए माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक महान तरीका प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य (ए Makino को HL115578) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Sigma A3311-10G
EDTA Fisher BP120-500
HBSS Fisher SH3026801
Hepes Sigma-Aldrich H4034-500G
Sodium Bicarbonate  Sigma S5761
D-(+)-Glucose  Sigma G7021-1KG
DynaBeads pan mouse IgG beads  Thermo Fisher Scientific 11035
Rat anti-mouse CD31 Antibody BD Biosciences 550274
IFCS  Fisher SH30072.04
M199 Fisher MT10060-CV
Dispase (Neutral Protease) Worthington Biochemical Corp./Fisher LS02109
Collagenase Type II  Worthington Biochemical Corp./Fisher LS004176
Glycerol  Fisher BP381-1
Igepal Sigma I3021-50 ml
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma P0044-1ml
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340-1 ml
Heparin  Sigma H3149-100KU
FBS  Fisher/Mediatech MT35010CV
D-Valine Sigma V1255-5G
EGS Corning 356006
Penicillin/Streptomycin Fisher/Mediatech MT-30-002-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
  3. Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
  4. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
  5. Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
  6. Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
  7. Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
  8. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
  9. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
  10. Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
  11. Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
  12. Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 113 MCEC चुंबकीय मोती दिल विच्छेदन CD31 enzymatic पाचन
माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, S., Truong, A. H., Makino, A.… More

Luo, S., Truong, A. H., Makino, A. Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e53985, doi:10.3791/53985 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter