Abstract
תאי האנדותל המרפדים את הדופן הפנימי של כלי דם יש תפקיד חשוב בוויסות של טון וסקולרית, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה. תפקוד לקוי של תא האנדותל הוא מעורב בהתפתחות והתקדמות של מחלות לב וכלי דם רבים, כולל מחלת לב איסכמית. כדי לבחון את הפונקציה ואפיון של תאי אנדותל כליליים, בידוד תא הוא הצעד הראשון וזה דורש טוהר וכמות גבוהים לערוך ניסויים הבאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד תאי אנדותל כלילית עכבר בוגר. לב העכבר הוא גזור טחון לחתיכות קטנות. לאחר העיכול של הלב באמצעות dispase ו collagenase השנייה, התאים נשטפים וטופחו עם חרוזים מגנטיים אשר מצומדות עם נוגדנים נגד CD31. החרוזים עם תאי אנדותל נשטפים מספר פעמים והם מוכנים להשתמש ביישומים שונים, כולל הדמיה experime ביולוגית מולקולריתnts. בידוד יעיל בתשואה של כ 10 4 תאים לכל לב אחד עם מעל 90 טוהר%.
Introduction
מודלי עכבר של מחלות לב וכלי דם שונות והפרעות מטבוליות לשאת שינויים פיסיולוגיים ומולקולריים דומים לאלה שנמצאו בחולים. יתר על כן, שינוי גנטי של עכברים הוא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לחקור את תפקיד פתוגניים של גנים ספציפיים בהתפתחות והתקדמות של מחלות. כיום, תאים מסוג הגן ספציפי-עקום או עכברים אאוט נוצרים בקלות במעבדות רבות ומדידת mRNA ורמות חלבון סוגי תאים מסוימים הוא הצעד הראשון בקביעה אם העכברים היו באמת מהונדסים גנטיים.
האנדותל היא שכבה דקה אחת של תאי האנדותל (EC) המרפד את קיר כלי הדם הפנימי. תאי האנדותל ממלאים תפקיד קריטי בויסות מתח כלי דם, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה 1,2. תפקוד לקוי של האנדותל היא סימן ההיכר של מצבים פתולוגיים רבים ושינויים בתפקוד האנדותל יכול להוביל רכב שונים3,4 מחלות diovascular. זהו אפוא משמעותיים ללמוד את הפונקציה של תאי אנדותל בתנאים פיסיולוגיים pathophysiological.
ישנן מספר דרכים כדי לבודד ECS 5-8 ואת שיטת הבידוד צריכה להיות מותאמת תלוי באיזה רקמות ומינים ישמשו. הסיבה לכך היא כי ECS מרקמות שונות להציג רמה גבוהה של ההטרוגניות ביחס סמני המשטח וביטוי חלבון שלהם 9. בידוד מוצלח של תאי אנדותל לעתים קרובות יכול להיות מאתגר ומחייבת מידה מסוימת של אימון ותרגול. לאחר שהושגה, שיטת הבידוד הציע בפרוטוקול זה מוכיח להיות יציב ויעיל.
המטרה הכללית של שיטה זו היא להשיג עכבר הכליליים ECS (MCECs) באיכות גבוהה ובכמות. למרות כמות התאים שנאספה לב היא פחות תאים שנאספו מרקמות אחרות תוך שימוש בטכניקות אחרות, שיטה זו עדיין מספקת הימוראיכות ter. טוהר תאי אנדותל באוכלוסייה שתתקבל יהיה גדול מ -90%. לפיכך, טכניקה זו תהיה אידיאלית עבור יישומים המסתמכים על תאי האנדותל מבודדים גרידא כגון הדמית תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר על העכברים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת אריזונה בוצעה על פי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH) הנחיות.
הערה: סעיפים 1, 2 ו -3 צריכות להתבצע היום לפני הניסוי כפי התקנה.
1. פתרונות הכנה
- חיץ CD31 (50 מ"ל)
- הוסף 50 מ"ל 1 × חיץ מלוחים פוספט (PBS) כדי שפופרת 50 מ"ל. לשקול 0.05 גרם שור סרום אלבומין (BSA) ו 0.037 גרם חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהוסיף הצינור 50 מ"ל ולשים את הצינור כדי לסובב במשך כ 1 ח עד להמסת האבקה. התאם ל- pH 7.4, מסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ"ל, ולאחסן ב 4 C עד השימוש.
- תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם HEPES (500 מ"ל)
- להוסיף 1.1915 גרם של HEPES לעשות 10 מ"מ HEPES בתמיסה HBSS ומערבבים היטב. מדוד את pH ולהתאים ל -7.4. סנן ולאחסן ב 4ג.
- הפתרון של 1x Kreb (1 ליטר)
- הוספת 100 מ"ל של 10 × פתרון של Kreb [טבלה 1] להכפיל מים מזוקקים בבקבוק 1 ליטר. לשקול 2.1 גרם נתרן ביקרבונט ו -2 גרם D- גלוקוז ומוסיפים את הבקבוק. מערבבים ולהתאים את הנפח הכולל עד 1 ל
- פתרון בועה עם 95% O 2/5% CO 2 גז במשך 30 דקות פתרון ולסנן בתוך מכסה המנוע. חנות ב 4 C ולשמור על הקרח במהלך הניסוי.
2. הכנת החרוזים המגנטיים
- הוסף 1 מ"ל חיץ CD31 לתוך כל צינור 1.5 מ"ל (צינור אחד לדגימה). מערבבים את החרוזים IgG אנטי עכברוש כבשים ולהוסיף את הכמות המתאימה מדגם [טבלה 1]. לנער את הצינורות במרץ 30 פעמים ומניחים אותם בצלחת מגנטי דקות 1 של טלטול. פתח את הצינורות בעוד על הצלחת ולזרוק פתרונות לדליים.
- הוסף חוצץ CD31 1 מ"ל לתוך צינור אחד. מוסיפים 2 עכברוש μl אנטי עכבר אנטי CD31הגוף על צינור אחד ולסובב צינורות O / N ב 4 ºC.
3. מעוקר
- החיטוי כל כלי ניתוח וטיפים פיפטה. חותכים את הקצוות של טיפים פיפטה כך יש עצות עם 4 קטרים שונים, מן הרחב אל הצר. בקטרים משוערים על העצות הם 3 מ"מ, 2.5 מ"מ, 2 מ"מ, ו -1.5 מ"מ בהתאמה. חותך את טיפי חיטוי היום קודם לכן עם 30 דקות של עיקור בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.
הערה: סעיפים 4 - 11 צריך להתבצע ביום של הניסוי.
4. פתרונות הכנה
- הכן חיץ כביסה המכיל 2% משורינת עגל סרום (IFCS) ב M199. עבור הדמיה, להכין 30 מ"ל / עכבר.
- הכן פתרון אנזים (10 מ"ל / לדוגמה). לשקול 0.6 יחידה / מ"ל של Dispase ו 1 מ"ג / מ"ל של Collagenase Type II לתוך צינור 50 מ"ל. להוסיף M199 לסובב את הצינור ב 4 ºC במשך 15 דקות. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ"ל insidדואר למכסה המנוע ולשמור על 4 C עד השימוש.
- כן HBSS / HEPES עם הפרין. הוסף 10 מ"ל של HBSS עם 10 HEPES מ"מ ב 15 מ"ל צינור. הוספת 100 μl של הפרין אל הצינור ולשמור על 4 C עד השימוש.
5. שטיפת חרוזים
- להוציא את הצינורות עם החרוזים מן הכתף ב 4 ºC ומביאים את מכסה המנוע. מניח את הצינורות בצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ הפתרון ולהוסיף חיץ CD31 1 מ"ל לתוך צינור אחד.
- קח את הצינורות מתוך הצלחת המגנטית לנער במרץ 30 פעמים. שים את הצינורות בחזרה בצלחת המגנטית וחזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. לאחר השלמת, לשים את הצינורות בחזרה 4C ולשמור מסתובבת עד השימוש.
6. Dissection
- להזריק את העכברים intraperitoneally עם 0.1 מ"ל של הפרין כדי למנוע קרישת דם. המתן 10 דקות, ואז להרדים את העכברים באמצעות זריקה intraperitoneal של 0.01 מ"ל של Pentobarbital. בדוק אם העכבר הוא מרגיש כאב על ידי צובט את הרגל.
- מניח את העכבר על לוח קלקר עם ראש כלפי מעלה וחזק זרועות עם סיכות. שימוש במלקחיים ו-לגזור במספריים קשים לחתוך את העור באזור החזה העליון עד הגרון.
- ביצוע חתך במרכז כלוב הצלעות רק מעל הסרעפת. חותכים את העצם הצידה ולמעלה לכיוון הגרון כדי להפוך משולש לחשוף את הלב והריאות. חותכים את אבי העורקים בדיוק מעל הסרעפת.
- החזק את התימוס עם מלקחיים ללא משייכת ולהשתמש מספריים לחתוך את כל רקמת חיבור בקפידה כדי לסלק ריאות ולב יחד. רקמות מקום בכוס עם 1 × Kreb של, לנער עם מלקחיים ולהעביר עד 6 צלחת ס"מ עם 1 × Kreb של.
- הסר את האונה של הריאות באמצעות מספרי מלקחיים. הכנס קטטר סטרילי 20 G לתוך אבי העורקים. שטוף את הדם במערכת הדם הכליליים עם HBSS / הפרין. ביצוע חתך קטן החדר, לנער את הלב ולהעביר לצינור מדגם של M199. שמור צינורות על הקרח.
class = "jove_title"> 7. עיכול רקמות
- מעבירים את הלב אל צלחת 6 ס"מ מלא 10 מ"ל של תמיסת אנזים ופשטי- אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. מניחים את הכלים בחממה 37 ºC במשך 15 דקות. להתסיס חומרים מתעכל על ידי pipetting למעלה ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ עם הקצוות כדי לאפשר לרקמות לעבור קל.
- שים את זה בחזרה בחממת 37 ºC עבור 15 דקות אחרות. חזרו על תסיסה שלוש פעמים, בכל פעם באמצעות טיפים פיפטה מהפתחים גדולים ביותר צרה ביותר ו -15 דגירה דקה בין כל אחד.
- לאחר דגירה 15 דקות האחרונות, לקחת דגימות החוצה לתוך מכסה המנוע. פתרון עד Pipet ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ pipet עם פתיחת הצרה ביותר ולהעביר דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ"ל.
- לשטוף את המנה עם כביסה חיץ 10 מ"ל בעזרת פיפטה 10 מ"ל ולהעביר על מסננת התא. שים את 50 מ"ל צינורות בצנטריפוגה ספין ב 400 גרם במשך 10 דקות ב RT.
- הסר supernatant מבלי לשבש את הגלולה. שטפו תאים עם חיץ כביסה 5 מ"ל פעמיים.
- קבל אחד בעבר הכינו צינורות 1.5 מ"ל עם חרוזים ולעבוד על צינור אחד בכל פעם. שים צינור 1.5 מיליליטר אחד בצלחת המגנטית, לנער 3 פעמים ולפתוח אותו.
- לאחר צנטריפוגה האחרון, להסיר supernatant ככל האפשר מבלי לשבש את הגלולה. לנתק את גושי תאים על ידי מצליף במרץ.
- הוסף חוצץ כביסה 1 מ"ל צינור 50 מ"ל ו לערבב את התאים עם טפטפת 1 מ"ל. דאמפ הפתרון מהצינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של תרחיף תאים מהצינור 50 מ"ל של חרוזים. פליק הצינורות 30 פעמים ואז לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
9. הכנות לקראת תרבית תאים / דימות
- כן תאי עבור תאי ציפוי. הוסף פתרון ג'לטין (5% w / v, 300 μl) לתא היטב כדי לצפות את משטח דגירה במשך 30 דקות ב 37 ºC. לאחר דגירה, remג'לטין אובה ויבש לפני השטח.
- להוציא את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 30 דקות של סיבוב ולשים בצלחת המגנטית בתוך מכסה המנוע. Shake למשך 2 דקות, מזבלה ולהוסיף חיץ כביסה 1 מ"ל.
- קחו צינורות מתוך הצלחת, לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים אותם בחזרה צלחת מגנטית ולנער דקות 1. חזור 4 פעמים עבור סכום כולל של 5 שטיפות, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת.
- לאחר לשטוף האחרון, להוציא צינור אחד ולעבוד על כל אחד צינור בכל פעם. Shake 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים את זה על הצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ ולהוסיף 1 מ"ל 20% התקשורת IFCS EC (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס).
- לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. התאם pipet 500 μl ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העבר 500 μl לכל תא.
- שים בבית חממה 37 ºC ולהשאיר O / N. למחרת, לשטוף תאים עם 10% תקשורת FBS EC.
10. הכנות לקראת דוגמאות כתם המערבי (WB)
- טאקדואר את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 1 hr סיבוב. שים אותם בצלחת המגנטית ולנער למשך 2 דקות. דאמפ supernatant ולהוסיף 1 מ"ל HBSS קר. לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. חזור פעמים עבור 3 שוטף, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת.
- לאחר לשטוף האחרון, לשים צינורות בצלחת מגנטית ולנער דקות 1. הסר חוצץ באמצעות פיפטה lyse התאים עבור WB באמצעות שיטה שתוארה לעיל 11,12. lysate המצטבר בדרך כלל מכיל כ -30 מיקרוגרם של חלבון.
הדמיה 11.
- שוטפים את התאים 3 פעמים עם התקשורת, עם נפח סופי של 250 μl עבור תא. הוסף 1.5 μl של דיל-acLDL אל התאים. מנקודה זו, לשמור על התאים בחושך.
- דגירה של 3.5 שעות ב 37 ג. הוסף 1.5 μl של Hoechst, מערבבים היטב דגירה במשך 30 דקות ב 37 תאים ˚C.Wash עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT.
- שטפו פעמיים עם PBS ולחסום עם 5% BSA-PBS עבור 30 מילn ב RT. שטפו פעמיים עם 1% BSA-PBS. לדלל BS-לקטינים-FITC באמצעות 1% BSA-PBS לריכוז של 2 מיקרוגרם / מ"ל ולהוסיף 300 μl לכל תא.
- שים את התא על שייקר מסלולית ב RT במשך 30 דקות. לשטוף עם 3 פעמים PBS.
- דמיינו התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זמן חשיפה של 200 מילי-שניות עבור FITC (מכתים לקטינים, סמן EC, עירור / פליטה 488 ננומטר / 519 ננומטר), 30 msec עבור DAPI (Hoechst, עירור, מכתים גרעיני / פליטה ב 358 ננומטר / 461 ננומטר), ו -300 msec עבור TRITC (מכתים acLDL, סמן EC, עירור / פליטה ב 557 ננומטר / 576 ננומטר). לרכוש תמונות באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבידוד המוצלח של תאי אנדותל כליליים מלב עכבר בדרך כלל מניב כ -10 4 תאים עם מעל 90 טוהר% עם צורה מרוצפת. עבור אוכלוסייה טהורה של תאי אנדותל, יש לנקוט זהירות בכל הפרוטוקול כדי להבטיח סביבת סטרילית חופשית מכל זיהום. הופעת תאים מוארכים או תאים מוגדלים בתוך האוכלוסייה מציינת זיהום עם סוגי תאים אחרים, תאי שריר חלק פיברובלסטים. מבחן טוהר תא האנדותל מבוצע על ידי צביעת תאים עם סמן פני תא אנדותל, BS-לקטינים ו acLDL (איור 1). אחוז התאים החיוביים אשר התערוכה בשני הצבעים היה מעל 90% ב MCEC. תוצאה כזו עולה כי הטכניקה בוצעה בהצלחה.
| PBS (10x) (1 ליטר) | </ Td> | ||
| חוֹמֶר | MW | הסכום (ז) | |
| NaCl | 58.44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141.96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| קרבס (10x) (1 ליטר) | |||
| חוֹמֶר | MW | Conc (מ"מ) | הסכום (ז) |
| NaCl | 58.44 | 118 | 69 |
| KCl | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 246.5 | 1.2 | 2.96 </ Td> |
| לאא 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| EC Media (20%) (500 מ"ל) | |||
| חוֹמֶר | כמות | ||
| M199 | 444.5 מ"ל | ||
| 10 - 20 U / ml הפרין | 500 μl | ||
| D-Valine | 25 מ"ג | ||
| IFCS | 100 מ"ל | ||
| EGS | 10 מ"ג | ||
| פניצילין / סטרפטומיצין | 5 מ"ל | ||
| הסכום חרוז לשמש לעכבר אחד | |||
| עבור הדמיה | 5 μl | ||
| Fאו WB / PCR | 10 μl | ||
טבלה 1. כימית יצירות של פתרונות המשמשים.
נציג תמונות איור 1. MCECs. תמונות פלואורסצנטי מראים כי העכבר כלילית ECS (MCEC) מבודד לבבות להפגין טוהר גבוה מהאוכלוסייה EC. טוהר נבדק על ידי שני ספיגת acLDL של צבע אדום (א) ו מכתים לקטינים בצבע ירוק (B) ב MCEC. הגרעין הוכתם Hoechst בצבע כחול (C). אחוז התאים החיוביים אשר התערוכה בשני הצבעים היה מעל 90% ב MCEC. בר הוא נציג של 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות vers גדוליון של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לתאי אנדותל ביותר בשימוש נרחב במחקר הם לתאי אנדותל אנושיים הטבור וריד (HUVECs) בגלל הנוחות וקלות culturing שלהם. עם זאת, הרבה מחקר דורש הזמינות של מודל פיסיולוגי שהשיג הבידוד של בתאי האנדותל מאיברים ספציפיים אחרים 10. תאי האנדותל לפצות אוכלוסיית קטין מאוד של תאים ברקמת הלב; בידוד culturing שלהם יכולים להוכיח להיות מאוד קשה.
ישנם שלושה שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה. הראשונה היא כדי לשטוף היטב דם. זה הכרחי, כמו כדוריות דם לבנות בתוך הדם גם להביע CD31 כסמן פני התא, שיתחרו ECS עבור המחייב של נוגדן CD31. כמו בתאי האנדותל אחרים עשויים גם להיות נוכחים בדם, הסמקה הוא חיוני על מנת למנוע זיהום על ידי תאים כאלה. השלב הקריטי השני הוא לשמור על סביבה סטרילית לאורך כל תהליך הבידוד. כל resu זיהוםLTS לירידה דרמטית במספר של תאים שהושגו. לבסוף, השלב הקריטי השלישי הוא להתאים את ה- pH של למאגר CD31, כפי כשל לעשות זאת תקטין את היעילות של הבידוד.
איכות תא חשובה ביותר במהלך הבידוד הזה. צמיחת תאי שריר חלק יכולה להיות מעוכבת על ידי התוספת של כמות מתאימה של הפרין אל התקשורת והתרבות. התפשטות פיברובלסטים יכול להיות האטה על ידי הוספת D-Valine לתקשורת. תאי האנדותל ניתן לאפיין על ידי ספיגת של דיל-AcLDL ושיתוף מכתים עם BS-לקטינים כדי לבדוק את טוהר של פנוטיפ תא האנדותל population.The אינה יציבה והתנהגותם יכול להשתנות במהירות פעם נלקח מתוך הרקמה המקורית ותרבותי. הגבלה של הטכניקה היא כי תאים לא אמורים לשמש לאחר 5 ימים של culturing על מנת להבטיח כי הם עדיין שומרים הפנוטיפ שלהם. מומלץ מאוד לא לעבור את התאים. התאים הראשוניים יספקו resu עקביתLT.
בסך הכל, את הטכניקה התוצאה היא מספר לא מבוטל של תאים של טוהר מצטיינים. עם הכישורים הדרושים, את תהליך הבידוד עשוי להסתיים בתוך 6 שעות. הוא מספק שיטה מצוינת להשגת תאי אנדותל כליליות עכבר לתרבות או תא או ניסוי ביולוגי מולקולרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות (HL115578 א Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C.
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A.
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
