This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
תאי האנדותל המרפדים את הדופן הפנימי של כלי דם יש תפקיד חשוב בוויסות של טון וסקולרית, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה. תפקוד לקוי של תא האנדותל הוא מעורב בהתפתחות והתקדמות של מחלות לב וכלי דם רבים, כולל מחלת לב איסכמית. כדי לבחון את הפונקציה ואפיון של תאי אנדותל כליליים, בידוד תא הוא הצעד הראשון וזה דורש טוהר וכמות גבוהים לערוך ניסויים הבאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד תאי אנדותל כלילית עכבר בוגר. לב העכבר הוא גזור טחון לחתיכות קטנות. לאחר העיכול של הלב באמצעות dispase ו collagenase השנייה, התאים נשטפים וטופחו עם חרוזים מגנטיים אשר מצומדות עם נוגדנים נגד CD31. החרוזים עם תאי אנדותל נשטפים מספר פעמים והם מוכנים להשתמש ביישומים שונים, כולל הדמיה experime ביולוגית מולקולריתnts. בידוד יעיל בתשואה של כ 10 4 תאים לכל לב אחד עם מעל 90 טוהר%.
מודלי עכבר של מחלות לב וכלי דם שונות והפרעות מטבוליות לשאת שינויים פיסיולוגיים ומולקולריים דומים לאלה שנמצאו בחולים. יתר על כן, שינוי גנטי של עכברים הוא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לחקור את תפקיד פתוגניים של גנים ספציפיים בהתפתחות והתקדמות של מחלות. כיום, תאים מסוג הגן ספציפי-עקום או עכברים אאוט נוצרים בקלות במעבדות רבות ומדידת mRNA ורמות חלבון סוגי תאים מסוימים הוא הצעד הראשון בקביעה אם העכברים היו באמת מהונדסים גנטיים.
האנדותל היא שכבה דקה אחת של תאי האנדותל (EC) המרפד את קיר כלי הדם הפנימי. תאי האנדותל ממלאים תפקיד קריטי בויסות מתח כלי דם, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה 1,2. תפקוד לקוי של האנדותל היא סימן ההיכר של מצבים פתולוגיים רבים ושינויים בתפקוד האנדותל יכול להוביל רכב שונים3,4 מחלות diovascular. זהו אפוא משמעותיים ללמוד את הפונקציה של תאי אנדותל בתנאים פיסיולוגיים pathophysiological.
ישנן מספר דרכים כדי לבודד ECS 5-8 ואת שיטת הבידוד צריכה להיות מותאמת תלוי באיזה רקמות ומינים ישמשו. הסיבה לכך היא כי ECS מרקמות שונות להציג רמה גבוהה של ההטרוגניות ביחס סמני המשטח וביטוי חלבון שלהם 9. בידוד מוצלח של תאי אנדותל לעתים קרובות יכול להיות מאתגר ומחייבת מידה מסוימת של אימון ותרגול. לאחר שהושגה, שיטת הבידוד הציע בפרוטוקול זה מוכיח להיות יציב ויעיל.
המטרה הכללית של שיטה זו היא להשיג עכבר הכליליים ECS (MCECs) באיכות גבוהה ובכמות. למרות כמות התאים שנאספה לב היא פחות תאים שנאספו מרקמות אחרות תוך שימוש בטכניקות אחרות, שיטה זו עדיין מספקת הימוראיכות ter. טוהר תאי אנדותל באוכלוסייה שתתקבל יהיה גדול מ -90%. לפיכך, טכניקה זו תהיה אידיאלית עבור יישומים המסתמכים על תאי האנדותל מבודדים גרידא כגון הדמית תא.
לתאי אנדותל ביותר בשימוש נרחב במחקר הם לתאי אנדותל אנושיים הטבור וריד (HUVECs) בגלל הנוחות וקלות culturing שלהם. עם זאת, הרבה מחקר דורש הזמינות של מודל פיסיולוגי שהשיג הבידוד של בתאי האנדותל מאיברים ספציפיים אחרים 10. תאי האנדותל לפצות אוכלוסיית קטין מאוד של תאים ברקמת ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות (HL115578 א Makino).
BSA | Sigma | A3311-10G | |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
HBSS | Fisher | SH3026801 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
M199 | Fisher | MT10060-CV | |
Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
EGS | BD | 356006 | Corning |
Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |