Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

شريط الفحص لدراسة آخر جذاب أو مثيرة للاشمئزاز من الركيزة البروتين عن طريق فصل الخلايا العصبية الحصين

Published: June 19, 2016 doi: 10.3791/54096
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Introduction

التوجيه محور عصبي هو العملية التي من خلالها الخلايا العصبية التي شكلت حديثا إرسال المحاور الى هدفهم خلال تطوير 1،2 الجهاز العصبي. محاور تطوير تحمل بنية متحركة غاية في غيض التي تسمى مخروط النمو. مخروط النمو الحواس العظة خارج الخلية للتنقل مسار محور عصبي و. جزيئات التوجيه، مثل شق، semaphorin، وephrins، يمكن أن تجتذب أو صد المحاور اعتمادا على تفاعلها مع مستقبلات مناسبة وشارك في المستقبلات على محور عصبي 1،3،4. المستقبلات تنشيط نقل إشارات إلى مخروط النمو التي تؤثر على تنظيم هيكل الخلية من أجل الحركات محور عصبي والنمو مخروط.

وقد وضعت أساليب مختلفة لتقييم عمل جاذبة وطاردة الجزيئات. الكيماوي جاذبة، طارد الحشرات يمكن أن تدار في المتوسط ​​نمو / الثقافة مع التركيز التدرج (على سبيل المثال، غرفة دان أو الشرائح ميكرون) 5،6، في بقعة عالية التركيز من قبل ف الصغير ipette (على سبيل المثال، تحول فحص) 7 أو بتركيز متجانسة من خلال تطبيق الحمام (على سبيل المثال، مخروط النمو انهيار فحص) 8،9.

وتشمل الأساليب الأخرى لفحص شريط أو microcontact الطباعة (μCP)، حيث يتم المغلفة لالكيماوي جاذبة أو طاردة على سطح لوحة باعتبارها الركيزة 10-12. وقد وضعت Thestripe فحص أصلا بونهوفر وزملاؤه في عام 1987 لتحليل رسم الخرائط الطوبوغرافية في فرخ نظام retino-سقفي 13. طريقة الأصلي يتطلب نظام فراغ للبروتينات معطف على الأغشية nucleopore البولي باستخدام مخطط والمصفوفات مزجها. في إصدارات لاحقة، وطبعت البروتينات المؤتلف مباشرة على سطح لوحة الثقافة في نمط شريطية باستخدام فتحة ضيقة المصفوفات السيليكون 14،15. في الآونة الأخيرة، وقد طبقت المجموعات البحثية المختلفة بنجاح هذا شريط الاختبار لتحليل الأنشطة جزيء التوجيه محور عصبي 16-21.

SS = "jove_content"> وهنا نقدم بروتوكول مفصل لفحص الشريط الذي يقيس جذب أو تنافر الجزيئات التوجيه محور عصبي للخلايا العصبية الحصين فصلها. والجدير بالذكر، يمكن تطبيق هذا الأسلوب في بيئة معملية مجهزة الحد الأدنى. لهذا الاختبار، يتم إنشاء المشارب بالتناوب من ركيزة fluorescently المسمى والبروتين السيطرة على طبق من البلاستيك باستخدام مصفوفة السيليكون مع الشقوق 90 ​​ميكرومتر والمغلفة مع laminin. في مظاهرة لدينا، نأت كانت الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران E15.5 مثقف على بالتناوب المشارب من ectodomain المؤتلف من فبرونيكتين ويسين الغنية بالبروتين 2 الغشاء (FLRT2) والسيطرة على البروتين التيسير 21. بعد 24 ساعة من الثقافة، كل من المحاور والهيئات خلية من الخلايا العصبية نفرت بشدة من المشارب FLRT2. تلطيخ مع الأجسام المضادة لمكافحة Tau1 كشفت أن ~ تم توزيع 90٪ من الخلايا العصبية في المناطق المغلفة التيسير، مقارنة ب ~ 10٪ على FLRT2-FC، مشيرا إلى أن FLRT2 ديه مثير للاشمئزاز قويوظيفة للعصبونات الحصين 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة هاماماتسو كلية الطب.

1. إعداد مصفوفات

  1. يغلي 4-8 مصفوفات سيليكون في الميكروويف أو على طبق ساخن لمدة 5 دقائق، والسماح لهم حتى يجف تماما لمدة 1 ساعة تحت تدفق الصفحي (الجانب مخطط متابعة).
    ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الإجراءات التالية في إطار تدفق الصفحي.
  2. ضربة الهواء المضغوط أو استخدام شريط لاصق شفاف لإزالة أي غبار من الجانب مخطط من المصفوفات. حافظ على الجانب مخطط نظيفة لذلك يمكن أن تتمسك بشدة على سطح اللوحة.
  3. وضع بعناية المصفوفات على أطباق البلاستيك 6 سم عن طريق الضغط بواسطة الإصبع (مصفوفة واحدة لكل طبق، الجانب شريط أسفل). تجنب الحصول على فقاعات الهواء بين المصفوفة والطبق. بمناسبة موقع المشارب على الجانب السفلي من الطبق الثقافة.
  4. إذا فشلت مصفوفة لنعلق، كرر من الخطوة 1.2.

2. الجيل الشريط و laminin طلاء الخلية العصبية الثقافة

  1. إعداد fluorescently المسمى البروتين المؤتلف (25 ميكرولتر كل لحقن [خطوة 2.2] أو 100 ميكرولتر كل لطريقة وضع [خطوة 2.2.1]) عن طريق خلط البروتين-FC الموسومة (10-50 ميكروغرام / مل)، وdye- الفلورسنت مترافق الأجسام المضادة التيسير مكافحة البشري (1-3 نسبة: 30-150 ميكروغرام / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ثم، احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. باستخدام حقنة 22-G، وضخ 25 ميكرولتر من البروتين المؤتلف أعدت في الخطوة السابقة (2.1) من خلال ثقب صغير على جانب المصفوفة (الأسهم في الشكل 1A، 1C، و1E).
    1. بدلا من ذلك، وضع 100 ميكرولتر من البروتين المؤتلف في الشق العلوي من المصفوفة ونضح ما يقرب من نصف الحل من ثقب صغير (الأسهم في الشكل 1A، 1C، و1E)، بحيث يظل البروتين المؤتلف في المناطق المخططة.
  3. احتضان الطبق لمدة 30 ميلن عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
  4. وضع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الشق العلوي (الشكل 1B) ونضح من ثقب صغير يقع على الجانب المصفوفة (الأسهم في الشكل 1A، C و E) لإزالة البروتينات المؤتلف غير مرتبط. لا نضح برنامج تلفزيوني تماما، لأن البروتينات سوف تجف. كرر هذه الخطوة مرتين. (3 مرات الكلية)
  5. إزالة بعناية المصفوفة وعلى الفور وضع ~ 100 ميكرولتر من البروتين التحكم (10-50 ميكروغرام / مل، بورتو) لتغطية منطقة مخطط كامل، وخلق طلاء بديل. ثم، واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
  6. بعد غسل سطح الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، انه مع معطف ~ 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يجب إذابة Laminin على الجليد لمنع التجمد.
  7. احتضان الطبق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
  8. غسل سطح الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة ميدي الثقافةأم. وضع طبق المغلفة مع مستنبت في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. التثقيف الحصين الخلايا العصبية من أجنة الفئران E15.5

  1. الموت ببطء الأم عن طريق خلع عنق الرحم وعزل ثلاثة E15.5 الأجنة.
  2. قطع الجلد والجمجمة sagittally في خط الوسط من الرأس مع مقص، وإزالة المخ باستخدام ملعقة صغيرة. نقل الدماغ بعناية إلى 60 ملم طبق بتري تحتوي على 3 مل من هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS).
  3. باستخدام مشرط، وقطع من نصفي الكرة الأرضية بما في ذلك القشرة، الحصين والمخطط (الشكل 2A). ثم، تشريح خارج منطقة قرن آمون عن طريق إزالة بعناية السحايا، ونقل الأنسجة الحصين تشريح لأنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 2 مل من محلول HBSS، على الجليد (الشكل 2B-C). جمع 6 الحصين من 3 أجنة في الأنبوب، والتي تكفي لزراعة الخلايا العصبية في 8 أطباق.
  4. استبدال Hحل BSS مع حل التربسين / EDTA (2 مل)، واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي.
    ملاحظة: نضح HBSS دون الطرد المركزي وليس صب حل HBSS عن طريق إمالة الأنبوب.
  5. تحييد النشاط التربسين وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من مصل بقري جنيني (FBS).
  6. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 100 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ويغسل بيليه مع 2 مل من مستنبت. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  7. الماصة الحصين صعودا وهبوطا 10 مرات في مستنبت باستخدام طرف 1،000 ميكرولتر مع وجود ثقب كبير (قطع طرف) لفصل الأنسجة.
  8. تغيير العادية (غير مختصر) طرف 1،000 ميكرولتر والماصة النسيج نأت صعودا وهبوطا للحصول على تعليق وحيد الخلية.
  9. فصل الخلايا واحد من قبل تمريرها من خلال 80-100 ميكرون خلية شبكة مصفاة.
  10. الطرد المركزي تعليق خلية واحدة تصفيتها في 150 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. إزالة طاف بواسطة الشفط، و resuspend بيلوآخرون (الخلايا العصبية) في 2 مل من مستنبت.
  12. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات مع تلطيخ التريبان الأزرق لتحديد الكثافة وقدرتها على البقاء. ثم، لوحة 10،000 الخلايا العصبية في 150 ميكرولتر من مستنبت لكل مجموعة من تعليق stripes.The يجب أن يوضع بعناية لتغطية منطقة شريط كامل.

4. التصور من أجسام الخلايا والمحاوير التي كتبها المناعي تلطيخ باستخدام-Tau1 مكافحة الأجسام المضادة

  1. بعد 24 ساعة من الثقافة، نضح في والمتوسطة من دون إزعاج الخلايا الملتصقة، وإصلاح الخلايا العصبية مع تسخينه مسبقا لامتصاص العرق 4٪ (PFA) / 4٪ سكروز / برنامج تلفزيوني في RT لمدة 15 دقيقة.
  2. غسل سطح لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إذا رغبت في ذلك، واستخدام القلم المياه طارد لرسم دائرة حول المنطقة المخططة لتقليل كمية من الأجسام المضادة اللازمة.
  3. Permeabilize الخلايا العصبية مع 0.3٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  4. احتضان الخلايا العصبية مع عرقلة الحل تحتوي على 3٪ المصل حمار و 0.1٪ تريتون X-100 ل30 دقيقة تليها الحضانة مع الأجسام المضادة لمكافحة Tau1 (1: 200) في 1٪ المصل حمار / 0.1٪ تريتون X-100 / PBS O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. غسل سطح لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا العصبية مع المضادة للماوس مفتش الأضداد-fluorophore مترافق في 1٪ زلال المصل البقري (BSA) /0.1٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
  6. غسل سطح لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تغطية منطقة شريطية مع 18 ملم × 18 ملم الغطاء الزجاجي باستخدام 50 ميكرولتر من antifade حل. تجنب فقاعات الهواء، والتي تتداخل مع التصوير.
  7. الحصول على صور الفلورسنت مع المجهر مضان باستخدام نظام ملائم، على سبيل المثال، X10 عدسة الهدف، مجموعات تصفية GFP وطلب تقديم العروض، وزمن التعرض 1،000 مللي ثانية (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت مطلية الخلايا العصبية قرن آمون فصلها من الفئران E15.5 وتربيتها لمدة 24 ساعة على خطوط fluorescently المسمى السيطرة التيسير (الشكل 3A-C) أو FLRT2-FC (الشكل 3D-F) بالتناوب مع نادي غير المسمى السيطرة. في كلتا الحالتين، كانت الخلايا العصبية مجمعة وامتدت محاور على النحو حزم. على جهاز التحكم المشارب FC / التيسير، تم توزيع الخلايا العصبية بشكل متساو على خطوط fluorescently المسمى وغير المسمى، وقدموه المحاور في اتجاهات عشوائية (الشكل 3A-C). في المقابل، عند المثقف على خطوط FLRT-2Fc / FC، المحاور تجنبها المتزايد على المناطق FLRT2-FC. وهكذا، كانت محاور توسيع تقع أساسا على التيسير التحكم (الشكل 3D-F). والجدير بالذكر، تم صد كل من أجسام الخلايا والمحاور من FLRT2-FC. وهكذا، فإن المحاور مدد في اتجاه مواز لخطوط الشكل 3D '.' - F '' يدل على أن المحاور نمت على طوللم الحدود بين التيسير السيطرة وFLRT2-FC لكن لا تمتد إلى الأراضي FLRT2.

شكل 1
الشكل 1. السيليكون مصفوفة المستخدمة لإنشاء ختم البروتين مخطط. (A، B) أعلى نظرا لمصفوفة السيليكون. حجم المصفوفة هو 30 مم × 25 مم × 5MM. السهم الأبيض في ويشير إلى وجود ثقب صغير حيث يتم حقن بروتين المؤتلف (الخطوة 2.2). رأس السهم في B يشير إلى وجود فتحة حيث يتم تطبيق البروتين المؤتلف بدلا من (الخطوة 2.2.1). (C، D) مشاهدة الجزء السفلي من المصفوفة السيليكون. حجم المنطقة المخططة هو 7 ملم × 9 ملم. عرض كل شريط 90 ميكرون. السهم يشير إلى وجود قناة صغيرة التي يتم من خلالها حقن البروتين المؤتلف. (E) توضيح تخطيطي لعرض سهمي في خط الوسط من مصفوفة تبين العلاقة بين حفرة صغيرة، والمشارب، والشق. السهم يشير إلى ط njection حفرة. الحانات هي مقياس 500 ميكرون في AC و 200 ميكرومتر في D. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تشريح الحصين الماوس. (أ) أعلى نظرا مخ الفأر الجنينية التي تبين موقف القطع (خط متقطع) في نصفي الكرة الأرضية معزولة بما في ذلك الحصين، القشرة، والمخطط. (B، C) والحصين معزولة التي يتم جمعها في HBSS بعد إزالة السحايا. ( D) الخلايا العصبية يتم تربيتها على المشارب في طبق 6 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
كانت الشكل 3. فحوصات الشريط مع نادي الرقابة وFLRT2-FC وثقافة فصلها من الخلايا العصبية قرن آمون. عصبونات الحصين تنفصل من الفئران E15.5 مثقف لمدة 24 ساعة على خطوط نادي التحكم (AC) أو FLRT2-FC (DF). ( A'-C "، D'-F، D '' - F '') صور مكبرة من المناطق محاصر في (AC، DF، وD'-F"، على التوالي) (أ، أ "ولدت) المشارب باستخدام fluorescently المسمى التيسير (الرمادي) والتيسير (أسود) كتجربة السيطرة. (D، D، D '') Fluorescently المسمى المشارب FLRT2-FC (الرمادي) بالتناوب مع نادي (أسود). (B، B، E ، E، E '') مكافحة Tau1 تلوين الأجسام المضادة من أجسام الخلايا والمحاور العصبية من الخلايا العصبية قرن آمون. (C، C، F، F، F '') الصور من المشارب و-Tau1 مكافحة تلطيخ تم دمج. وneur"نفرت أجسام الخلايا والمحاور بقوة من FLRT2-FC (F، F 'الإضافات، و' '). لاحظ أن محاور تتحول على طول الحدود ولا تدخل أراضي FLRT2-FC (النصال في F '') الحانات .Scale هي 100 ميكرون في C، C، F، F 'و 25 ميكرون في F' '. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول فحص شريط يستخدم البروتين المؤتلف والخلايا العصبية فصلها عن الحصين E15.5 الماوس. هذا الاختبار يسمح للمراقبة فعالة من ردود مثير للاشمئزاز، جذابة، أو محايدة من الخلايا العصبية إلى البروتين المؤتلف من الاهتمام وضعت في نمط شريطية. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي طريقة بسيطة لتوليد المشارب، والتي تتم طباعة البروتين مباشرة على سطح طبق من البلاستيك، مقارنة مع الطريقة التقليدية، الأمر الذي يتطلب مصفوفات خاصة، نظام فراغ، وغشاء nucleopore 20 21. لجعل خطوط البروتين، البروتين المؤتلف وصفت يمكن حقن من خلال ثقب صغير، أو عينة أكبر (~ 100 ميكرولتر) يمكن وضعها في فتحة على رأس المصفوفة، تليها تطلع حذرا من العازلة الزائدة والبروتينات غير منضم من خلال ثقب.

ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو أن عددا كبيرا من الخلايا العصبية يمكن تصور في مثلإنجل التجربة، والعديد من مخاريط النمو يمكن تحليلها في وقت واحد 21. في المقابل، في فحص تحول التقليدي، هو تصور فقط الخلايا العصبية واحدة ومخروط النمو واحد. لمست في FLRT2 جزيء مثير للاشمئزاز من قبل الخلايا العصبية، التي تهاجر بعيدا عن المشارب FLRT2-FC 21. جزيء مراسل مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو بروتين أحمر فلوري (RFP) يمكن التعبير في الخلايا العصبية لتصور لهم مقابل لون السجاد والسماح مراقبة الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى المناعية. علامات أخرى مثل FLAG، Myc على، وصاحب يمكن استخدامها بدلا من العلامة التيسير، والتي تم تحديدها مع المناسبة fluorescently المسمى معاداة العلامة الأجسام المضادة (الخطوة 2.1). بعض البروتينات مسعور عالية لا يمكن أن تجعل شريط السليم بسبب التجميع الذاتي. وعلاوة على ذلك، فإن العمل النسبي من التجاذب والتنافر بين اثنين من البروتينات المختلفة هدف يمكن مقارنته عن طريق استبدال بروتين الهدف الثاني لمراقبة التيسير شريط 20.

إلىزيادة قابلية الخلايا العصبية، قد تكون هناك حاجة إلى إجراء تعديلات في الوقت الهضم الأنزيمي وتثبيط التربسين. إذا كانت نسبة البقاء على قيد الحياة من الخلايا العصبية منخفضة، يخفف من تركيز التربسين أو تقصير الوقت الهضم الأنزيمي. ينبغي الحفاظ على مستوى الرطوبة في الحاضنة لتجنب الضغط الاسموزي الناتج عن التبخر في النظام الكامل طوال فترة الثقافة.

التصاق المصفوفة إلى الطبق هو عامل مهم لإعداد خطوط جيدة. التزام غير لائق لنتائج سطح الطبق في نمط شريطية غير منظم. ومع ذلك، فإن كثافة الخلايا وتركيز الركيزة حاسمة لتجربة ناجحة أيضا. ينصح تركيز البروتين العالي في شريط لتحليل جزيء نشاطها مثير للاشمئزاز أو جذابة غير معروف. على الرغم من أننا أثبتنا هذا البروتوكول باستخدام الخلايا العصبية الأولية فصلها، بل هو أيضا مناسبة لأن الثقافات يزدرع عضوي النمط 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

Tags

علم الأعصاب، العدد 112، الجزيئات التوجيه محور عصبي، التنافر، والجذب، FLRT، شريط فحص، الخلايا العصبية، الركيزة
شريط الفحص لدراسة آخر جذاب أو مثيرة للاشمئزاز من الركيزة البروتين عن طريق فصل الخلايا العصبية الحصين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G.,… More

Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter