Introduction
Аксонов это процесс , с помощью которого вновь образованные нейроны посылают аксоны к своей цели при разработке системы 1,2 нервной. Развивающиеся аксоны несут в себе высокую двигательная структуру на их кончике называется конус роста. Конус роста ощущает внеклеточные сигналы для навигации путь аксона в. Молекулы Наведение, такие как щели, Semaphorin и Ephrins, могут привлекать или отталкивать аксоны в зависимости от их взаимодействия с соответствующими рецепторами и корецепторами на аксона 1,3,4. Активированные рецепторы передачи сигналов к конусу роста, которые влияют на его организации цитоскелета для аксонов и ростового конуса движений.
Различные методы были разработаны, чтобы оценить действие аттрактанта и репеллента молекул. Химио-аттрактанты и репелленты могут быть введены в рост / культуральной среды с градиентом концентрации (например., Камера Данна или х-горок) 5,6, в сильно концентрированном месте с помощью микро-рipette (например., поворачиваясь анализ) 7 или в гомогенной концентрации путем применения ванны (например., коллапс анализа конус роста) 8,9.
Другие методы включают в тест - полосках или микроконтактной печати (μCP), в котором химио-аттрактант или репеллент наносят на поверхность пластины в качестве подложки 10-12. Thestripe анализ был первоначально разработан Бонхёффера и коллегами в 1987 году для анализа топографического картирования в системе куриных ретино-tectal 13. Оригинальный метод требует вакуумной системы для белков оболочки на поликарбонатных нуклеопорные мембран с использованием полосатых и сложных топологий матриц. В более поздних версиях, рекомбинантные белки были непосредственно напечатаны на поверхности пластины культуры в полосатый узор с использованием узкой щели матрицы кремниевых 14,15. В последнее время различные исследовательские группы успешно применили эту полоса анализа к анализу деятельности молекулы аксонов 16-21.
21. Через 24 ч культуры, как аксоны и клеточные тела нейронов были сильно отталкивается от FLRT2 полос. Окрашивание с антителом анти-TAU1 показали, что ~ 90% нейронов были распределены по регионам с Fc-покрытием, по сравнению с ~ 10% на FLRT2-Fc, что указывает, что FLRT2 имеет сильное отталкивающеефункция для нейронов гиппокампа 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием субъектов животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Хамамацу школы медицины университета.
1. Получение матриц
- Кипятить 4-8 силиконовых матриц в микроволновой печи или на горячей плите в течение 5 мин и дайте им полностью высохнуть в течение 1 ч при ламинарном потоке (полосатая стороной вверх).
Примечание: Следующие процедуры должны выполняться в соответствии с ламинарным потоком. - Продуть сжатым воздухом или использовать прозрачную липкую ленту, чтобы удалить пыль из полосатой стороны матриц. Держите полосатую сторону чистой, чтобы он мог прочно прилипают к поверхности пластины.
- Осторожно поместите матрицы на 6-см пластиковой посуды, нажимая пальцем (одной матрицы на чашку; полоса стороной вниз). Избегайте попадания пузырьков воздуха между матрицей и блюдо. Отметьте расположение полос на нижней стороне культуры блюдо.
- Если матрица не может приложить, повторите процедуру с шага 1.2.
2. Генерация и нашивки Laminin покрытие для Neuron культуры
- Готовят флуоресцентно меченого рекомбинантного белка (25 мкл каждого для инъекций [стадии 2,2] или 100 мкл каждого для способа размещения [этапе 2.2.1]) путем смешивания с Fc-меченый белок (10-50 мкг / мл) и флуоресцентного dye- конъюгированные антитела против человеческого Fc-антитела (от 1 до 3 соотношение: 30-150 мкг / мл) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS). Затем инкубирование смеси в течение 30 мин при комнатной температуре.
- С помощью 22-G шприца, вводят 25 мкл рекомбинантного белка , полученного на предыдущей стадии (2.1) через небольшое отверстие на стороне матрицы (стрелки на рисунке 1А, 1С и 1Е).
- В качестве альтернативы, поместите 100 мкл рекомбинантного белка в верхнюю щель матрицы и аспирата приблизительно половину раствора из небольшого отверстия (стрелки на рисунке 1А, 1С и 1Е), таким образом , что рекомбинантный белок остается в полосатой регионах.
- Выдержите блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
- Поместите 300 мкл PBS в верхнюю щель (рис 1б) и аспирата из небольшого отверстия , расположенного на стороне матрицы (стрелки на рисунке 1А, С и Е) для удаления неприкрепленные рекомбинантных белков. Не аспирация PBS полностью, потому что белки высохнет. Повторите этот шаг дважды. (3 раза всего)
- Осторожно снимите матрицу и немедленно поместить ~ 100 мкл контрольного белка (10-50 мкг / мл; Fc), чтобы покрыть всю полосатую область, создавая альтернативное покрытие. Затем, инкубировать блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
- После промывки поверхности посуды три раза PBS, пальто с ~ 100 мкл 20 мкг / мл ламинина в PBS.
Примечание: Laminin следует оттаивали на льду, чтобы предотвратить затвердевание. - Инкубируйте блюдо в течение 1 ч при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
- Промыть поверхности посуды три раза PBS и добавляют культуру Mediит. Поместите блюдо , покрытое культуральной среде в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С до использования.
3. Культивирование нейронах гиппокампа от E15.5 эмбрионов мыши
- Эвтаназии мать с помощью цервикальной дислокации и выделить три E15.5 эмбрионов.
- Разрежьте кожу и череп сагиттальной на средней линии головы с ножницами, и удалить мозг, используя маленькую ложку. Перенести мозг осторожно к 60-мм чашки Петри, содержащую 3 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS).
- Используя скальпель, вырезают полушарий включая кору головного мозга, гиппокампе и стриатуме (рис 2А). Затем, Рассеките из гиппокампа путем тщательного удаления оболочки мозга, и передать отсеченных гиппокампа ткани на 15-мл центрифужную пробирку , содержащую 2 мл раствора HBSS, на льду (рис 2B-C). Соберите 6 гиппокампа из 3-х эмбрионов в трубе, которые достаточны для культивирования нейронов в 8 блюд.
- Заменить HРешение ПБС с раствором трипсин / ЭДТА (2 мл) и инкубировать пробирку при 37 ° С в течение 15 мин на водяной бане.
Примечание: Аспирируйте HBSS без центрифугирования и не сливают раствор HBSS путем наклона трубки. - Нейтрализовать активность трипсина путем добавления 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Центрифуга смесь при 100 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и промыть осадок с 2 мл культуральной среды. Повторите этот шаг еще раз.
- Пипетируйте гиппокампы вверх и вниз 10 раз в культуральной среде с использованием 1000 мкл наконечник с большим отверстием (вырезать наконечник), чтобы отделить ткани.
- Изменение к обычному (неразрезанные) 1000 мкл кончика и пипеткой диссоциированной ткани вверх и вниз, чтобы получить одной клеточной суспензии.
- Отдельные единичные клетки, пропуская их через сетчатый клеточный фильтр 80-100 мкм.
- Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии при 150 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант аспирацией и ресуспендируют ПеллЕТ (нейронов) в 2 мл культуральной среды.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра с окрашивания трипановым синим, чтобы определить плотность и жизнеспособность. Затем пластины 10000 нейронов в 150 мкл культуральной среды для каждого набора stripes.The подвески должны быть тщательно помещены, чтобы покрыть всю область полосы.
4. Визуализация клеточных тел и аксонов с помощью иммунофлуоресценции Окрашивание с использованием анти-TAU1 антитело
- Через 24 ч культивирования, аспирата среду, не нарушая прилипшие клетки, и фиксируют нейроны с предварительно подогретой 4% параформальдегида (PFA) / 4% сахарозы / PBS при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. При желании, использовать водоотталкивающий ручку, чтобы нарисовать круг вокруг полосатой области, чтобы уменьшить количество антител, необходимое.
- Проницаемыми нейроны с 0,3% тритона Х-100 / PBS в течение 5 мин.
- Инкубируйте нейроны с блокирующим раствором, содержащим 3% ослиную сыворотку и 0,1% Тритон Х-100 для30 мин с последующей инкубацией с антителом анти-TAU1 (1: 200) в 1% ослиной сыворотки / 0,1% Тритон Х-100 / PBS / N O при температуре 4 ° С.
- Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. Инкубируйте нейроны с флуорофором-конъюгированные антитела против мышиного IgG антител в 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) /0.1% Тритона Х-100 / PBS в течение 30 мин.
- Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. Накройте полосатый область с крышкой х 18 мм стекла 18 мм с использованием 50 мкл antifade раствора. избежать воздушных пузырей, которые мешают визуализации.
- Получают флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием соответствующей системы, например, x10 объектива, наборы фильтров для GFP и RFP, и 1000 мс время экспозиции (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разъединенные нейроны гиппокампа мышей E15.5 высевали и культивировали в течение 24 ч на полосы флуоресцентно меченых управления Fc (рис 3A-C) или FLRT2-Fc (рис 3D-F) , чередующиеся с немеченого управления Fc. В обоих случаях, нейроны были агрегируются и расширили свои аксоны в виде пучков. Об управлении Fc / Fc полосы, нейроны были распределены равномерно по флуоресцентно меченных и не меченных полос, и они расширили свои аксоны в случайных направлениях (рис 3A-C). В отличие от этого, при культивировании на FLRT-2к / Fc полосы, аксоны избежать растущих на регионах FLRT2-Fc. Таким образом, расширяющиеся аксоны были в основном расположены на блоке управления Fc (рис 3D-F). Следует отметить, что обе клеточные тела и аксоны отталкиваются от FLRT2-Fc. Таким образом, аксоны распространяется в направлении , параллельном полос Рисунок 3D '.' - F '' показывает , что аксоны росли вдольграница между контрольной Fc и FLRT2-Fc, но не распространялась на территорию FLRT2.
Рисунок 1. Матрица кремния используется для создания полосатую штамп белка. (А, Б) Вид сверху кремниевой матрицы. Размер матрицы составляет 30 мм х 25 мм х 5 мм. Белая стрелка в указывает на небольшое отверстие, где впрыскивают рекомбинантный белок (этап 2.2). Эрроухед в B обозначает щель , где рекомбинантный белок в качестве альтернативы применяется (этап 2.2.1). (C, D) , вид снизу матрицы кремния. Размер полосатой области составляет 7 мм х 9 мм. Ширина каждой полосы составляет 90 мкм. Стрелка указывает на небольшой канал , через который рекомбинантный белок впрыскивается. (Е) Схематическая иллюстрация сагиттальной зрения на средней линии матрицы , показывающей связь между маленьким отверстием, полосы, и щелью. Стрелка указывает на I njection отверстие. Шкала баров 500 мкм переменного тока и 200 мкм в D. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Препарирование гиппокампа мыши. (А) вид сверху мышиных эмбриональных мозга , показывающий линию разреза (пунктирная линия) на изолированном полусфер включая гиппокамп, кору и полосатое тело. (В, С) Выделенный гиппокамп собирается в HBSS после удаления оболочки мозга. ( D) Нейроны культивируют на полосы в 6 см блюдо. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
Рисунок 3. нашивки пробы с контрольной Fc и FLRT2-Fc и диссоциированного культуры нейронов гиппокампа. Диссоциированные нейроны гиппокампа мышей E15.5 культивировали в течение 24 ч на полосках управления Fc (AC) или FLRT2-Fc (DF). ( А'-C ', D'-F', D '' - F '') Увеличенные изображения из коробочной регионов (AC, DF, и D'-F '., соответственно) (а, а') Stripes генерируется используя флуоресцентную метку Fc (серый) и Fc (черный) в качестве контрольного эксперимента. (D, D ', D' ') флуоресцентно меченных полосы FLRT2-Fc (серая) , чередующиеся с Fc (черный). (B, B', E , Е ', Е' ') анти-TAU1 антитела окрашивание клеточных тел и аксонов нейронов гиппокампа. (C, C', F, F ', F' ') изображения полос и анти-TAU1 окрашивание были объединены. NeurУНС клеточные тела и аксоны сильно отталкивается от FLRT2-Fc (F, F ', F' '). Обратите внимание , что аксоны повернуть вдоль границы и не входить на территорию FLRT2-Fc (Arrowheads в F '') .Scale бары 100 мкм в C, C ', F, F' и 25 мкм в F ''. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает тест-полосках, который использует рекомбинантный белок и разложенных нейроны из гиппокампа E15.5 мыши. Этот анализ позволяет эффективно наблюдать отталкивающих, привлекательных, или нейтральных ответов нейронов к рекомбинантного белка, представляющего интерес, помещенный в полосатый узор. Основным преимуществом этого протокола является простой способ для формирования полосы, в которых белок непосредственно напечатанным на поверхность пластиковой тарелки, по сравнению с традиционным методом, который требует специальных матриц, вакуумной системы, а нуклеопорные мембрана 20 , 21. Для того, чтобы белковые полосы, меченый рекомбинантный белок может быть введен через небольшое отверстие или большего образца (~ 100 мкл) может быть помещена в прорезь на верхней части матрицы, с последующим тщательным аспирации избыточного буфера и несвязанных белков через отверстие.
Еще одним преимуществом этого метода является то, что большое число нейронов могут быть визуализированы в качествеИнгл эксперимент, и многие конусы роста могут быть проанализированы одновременно 21. В противоположность этому, в обычном поворотном анализе, только один нейрон и одиночный конус роста визуализируется. Отталкивающим молекула FLRT2 воспринимается нейронов, которые мигрируют от FLRT2-Fc полосы 21. Репортерной молекулы, как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или красный флуоресцентный белок (RFP) могут быть выражены в нейронах, чтобы визуализировать их от цвета ковра и позволять наблюдение в реальном времени без необходимости иммунное окрашивание. Другие теги, как FLAG, Мус, и его можно использовать вместо тега Fc, и идентифицированы с соответствующим флуоресцентно меченого анти-таг антитела (этап 2.1). Некоторые высокие гидрофобные белки не могут сделать правильную полосу из-за самоагрегации. Кроме того, относительное действие притяжения и отталкивания между двумя различными белками - мишенями можно сравнить путем замены второй целевой белок для контроля Fc - полосой 20.
кповышения жизнеспособности нейронов, корректировки могут быть необходимы в ферментативной время переваривания и ингибирование трипсина. Если коэффициент выживаемости нейронов низка, разбавить концентрацию трипсина или сократить время ферментативного пищеварения. Уровень влажности инкубатора следует поддерживать, чтобы избежать испарения индуцированных осмотического давления в полной системе в течение всего периода культивирования.
Адгезия матрицы к блюду является важным фактором для подготовки хороших полос. Неправильное присоединение к результатам блюдо поверхности в неорганизованной рисунка полосы. Тем не менее, плотность клеток и концентрации субстрата также имеют важное значение для успешного проведения эксперимента. Более высокая концентрация белка в полосе рекомендуется для анализа молекулу, отталкивающей или привлекательной активности неизвестна. Несмотря на то, мы показали , этот протокол , используя диссоциированных первичные нейроны, он также применим для органотипических эксплантов культур 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
