Introduction
軸索ガイダンスは、新たに形成された神経細胞は、神経系1,2の開発中に彼らのターゲットに軸索を送信するプロセスです。開発軸索は、成長円錐と呼ばれる彼らの先端で非常に運動性の構造を運びます。成長円錐は軸索のパスをナビゲートするために、細胞外の合図を感知します。ガイダンスのようなスリット、セマフォリンのような分子、およびエフリンは、誘致や軸索1,3,4上の適当な受容体及び共受容体との相互作用に応じて軸索を撃退することができます。活性化受容体は軸索と成長円錐の運動のために、その細胞骨格の組織に影響を与える成長円錐に信号を転送します。
様々な方法が誘引と忌避分子の作用を評価するために開発されてきました。化学誘引物質及び忌避剤は、濃度勾配と成長/培養液中に投与することができる（ 例えば 、ダンのチャンバまたはμ-スライド）マイクロpで高度に濃縮されたスポットで5,6、ipette（ 例えば 、旋回アッセイ）7またはバスのアプリケーション（ 例えば 、成長円錐崩壊アッセイ）8,9により均質な濃度で。
他の方法は、化学誘引または忌避剤は、基板10〜12のように板の表面に塗布されたストライプアッセイまたはマイクロコンタクト印刷（μCP）が挙げられます。 Thestripeアッセイは、もともとひよこレチノ-tectalシステム13内の地形図のマッピングを分析するために1987年にボンヘッファーらによって開発されました。元のメソッドは、ストライプと噛み合っ行列を使用して、ポリカーボネートのNucleoporeメンブレンにコートタンパク質への真空システムを必要としました。以降のバージョンでは、組換えタンパク質を直接狭いスリットシリコンマトリックス14,15を使用してストライプ状に培養プレートの表面に印刷しました。近年、様々な研究グループが成功した軸索ガイダンス分子の活動16-21の分析にこのストライプアッセイを適用しています。
21を制御する上で培養した解離しました。培養の24時間後に、軸索及びニューロンの細胞体の両方が強くFLRT2ストライプから反発しました。抗TAU1抗体で染色すること〜ニューロンの90％がFLRT2は強い反発があることを示す、FLRT2-Fc上の約10％と比較して、Fcをコーティングした領域上に分布していたことを明らかにしました海馬神経細胞21のための機能。
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Protocol
動物を対象とする手順は、浜松医科大学で施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
マトリックスの調製
- マイクロ波または5分間ホットプレート上で沸騰4-8シリコーンマトリックスおよびそれらの層流（ストライプサイドアップ）の下で1時間、完全に乾燥させます。
注：以下の手順は、層流の下で実行する必要があります。 - 圧縮空気を吹き付けるまたは行列のストライプ側からほこりを除去するために、透明粘着テープを使用します。きれいなストライプ側を保つので、しっかりとプレート表面に付着することができます。
- 指で押して、6 cmのプラスチック皿に（皿当たり1マトリックスを、ストライプ側を下に）行列を慎重に配置します。マトリックスと皿の間に気泡が入らないように注意してください。培養皿の底部側にストライプの位置をマーク。
- 行列がアタッチに失敗した場合は、ステップ1.2から繰り返します。
ニューロン文化2.ストライプ生成およびラミニンコーティング
- Fcタグ化タンパク質（10-50μgの/ ml）および蛍光染料を混合することにより、（配置方法のための注射[ステップ2.2]または100μlの各[ステップ2.2.1]のために25μlの各）蛍光標識された組換えタンパク質を準備します結合抗ヒトFc抗体（1比3：30〜150μgの/ ml）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）です。その後、RTで30分間混合物をインキュベートします。
- 22-Gの注射器を使用して、マトリックスの側の小さな穴を通って、前のステップ（2.1）で調製した組換えタンパク質を25μl注入する（ 図1A、1Cの矢印、および1E）。
- また、マトリックスの上部スリットへの組換えタンパク質の100μLを配置し、そのように小さな穴からの溶液の吸引約半分は（ 図1A、1C、および1Eの矢印）は、組換えタンパク質は、ストライプ領域に残ります。
- 30マイルのための一品をインキュベート細胞培養インキュベーター中で37℃でのn。
- 付着していない組換えタンパク質を除去するために、マトリックスの側に位置する小さな穴（ 図1A、CとEの矢印）から上部のスリット（ 図1B）および吸引に300μlのPBSを置きます。タンパク質が乾燥しますので、完全にPBSを吸引しないでください。二回、この手順を繰り返します。 （3回の合計）
- 慎重に行列を削除し、すぐに制御タンパク質（10-50 / mlの; Fc）のの〜100μLを置く代わりのコーティングを作成し、全体の縞模様のエリアをカバーします。その後、細胞培養インキュベーター中で37℃で30分間皿をインキュベートします。
- PBSで〜と皿表面に20 / mlのラミニン100μlのPBSで3回、コート、それを洗浄した後。
注：ラミニンは凝固を防ぐために、氷上で解凍する必要があります。 - 細胞培養インキュベーター中で37℃で1時間、皿をインキュベートします。
- PBSで皿表面を3回洗浄し、培養メディを追加ええと。使用するまで37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養液でコーティングされた皿を置きます。
E15.5マウス胚から3.培養海馬ニューロン
- 頸椎脱臼を経由して母を安楽死させると3 E15.5胚を隔離します。
- 矢状にはさみで頭の正中線に皮膚や頭蓋骨をカットし、小さなスプーンを使って脳を削除します。ハンクス平衡塩溶液（HBSS）の3ミリリットルを含む60 mmのペトリ皿に慎重に脳を転送します。
- メスを用いて、皮質、海馬および線条体（ 図2A）を含む半球を切り出します。その後、慎重に髄膜を除去することにより、海馬領域を解剖し、氷（ 図2B-C）に、HBSS溶液2mlを含む15 mlの遠心チューブに解剖海馬組織を移します。 8皿の中で神経細胞を培養するために十分であるチューブで3胚から6海馬を収集します。
- Hを交換してくださいトリプシン/ EDTA溶液を用いてBSS溶液（2mL）を、水浴中37℃で15分間チューブをインキュベートします。
遠心分離せずに吸引しHBSSとチューブを傾けることによって、HBSS溶液をデカントしません。注意してください。 - ウシ胎児血清（FBS）を500μlを添加することにより、トリプシン活性を中和します。
- 5分間、100×gで混合物を遠心分離します。上清を除去し、培養液の2mlでペレットを洗浄。もう一度この手順を繰り返します。
- ピペットは大きな穴で1,000μlのチップを用いて培養液中の上下海馬10回は、組織を解離するために（先端を切りました）。
- レギュラー（ノーカット）1,000μlの先端に変更し、単一細胞懸濁液を得るために、上下に解離した組織をピペット。
- 80-100ミクロンメッシュセルストレーナーに通して単一細胞を分離。
- 5分間150×gで濾過し、単一細胞懸濁液を遠心。
- 吸引により上清を除去し、そしてペルを再懸濁ら培地2ml中（ニューロン）。
- 密度及び生存率を決定するために、トリパンブルー染色と血球計数器を用いて細胞を数えます。その後、慎重にストライプ全体の領域を覆うように配置する必要がありstripes.Theサスペンションのセットごとに培地150μlの1万ニューロンをプレート。
アンチTAU1抗体を用いた免疫蛍光染色によって細胞体と軸索の4可視化
- 培養の24時間後、接着細胞を乱すことなく、培地を吸引し、予め温めておいた4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ 4％スクロースで15分間室温にて/ PBSでニューロンを固定します。
- PBSでプレート表面を3回洗浄。必要であれば、必要な抗体の量を減少させることが帯状領域の周りに円を描くように撥水性ペンを使用しています。
- 5分間、0.3％トリトンX-100 / PBSで神経細胞を透過性。
- 3％ロバ血清および0.1％トリトンX-100を含むブロッキング溶液を用いてニューロンをインキュベート1％ロバ血清/ 0.1％トリトンX-100 / PBS O / Nで4℃で：（200 1）30分間、抗TAU1抗体とインキュベートしました。
- PBSでプレート表面を3回洗浄。 30分間、1％ウシ血清アルブミン（BSA）/0.1%トリトンX-100 / PBSでフルオロフォアコンジュゲート抗マウスIgG抗体を用いて神経細胞をインキュベートします。
- PBSでプレート表面を3回洗浄。退色防止溶液50μlを用いて、18ミリメートル×18ミリメートルのカバーガラス付きストライプ領域を覆います。イメージングを妨害する気泡を、避けます。
- 適切なシステムを使用して蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得し、 例えば 、×10対物レンズ、GFPおよびRFP用フィルターセット、および1000ミリ秒の露光時間（ 図3）。
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Representative Results
E15.5マウスから解離海馬ニューロンは、メッキとの蛍光制御のFc（ 図3A-C）または非標識対照Fcで交互FLRT2-Fcを（ 図3D-F）ラベルされたストライプに24時間培養しました。どちらの場合も、ニューロンが集約されたとのバンドルとしての軸索を拡張しました。制御上のFc / Fcをストライプは、神経細胞を蛍光標識し、非標識のストライプ上に均一に分布していた、と彼らはランダムな方向（ 図3A-C）にその軸索を拡張しました。これとは対照的に、培養した場合FLRT-2FC / Fcをストライプに、軸索はFLRT2-Fc領域に成長して回避しました。このように、伸びる軸索は、主にコントロールのFc（ 図3D-F）に位置していました。特に、細胞体と軸索の両方がFLRT2-Fcとから反発しました。このように、軸索はストライプに平行な方向に延長図3D '。' - F ''軸索に沿って成長したことを示していますコントロールFcおよびFLRT2-Fcとの間の境界だがFLRT2の領土に延長されることはありませんでした。
図1.シリコンマトリックスは、ストライプタンパク質スタンプを作成するために使用されます。シリコン行列の（A、B）上から見た図。行列のサイズを30mm×25ミリメートルx 5mmのです。 A中の白矢印は、組換えタンパク質を注射された小孔（ステップ2.2）を示します。 Bでのアローヘッドは、組換えタンパク質が交互に印加されたスリット（ステップ2.2.1）。（C、D）シリコンマトリックスの底面図を示しています。ストライプ領域のサイズは、X 9から7mm mmです。各ストライプの幅は90μmです。矢印は、組換えタンパク質が注入される小運河を示す。（E）小孔、ストライプ、及びスリット間の接続を示す行列の正中線における矢状図の概略図。矢印がiを示しています njection穴。スケールバーは、ACで500ミクロンとDの200ミクロンであり、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウスの海馬の図2.解剖。 （A）、海馬、皮質、および線条体を含む単離された半球上の切断位置（破線）を示すマウス胚性脳のトップビュー。（B、C）を単離した海馬は、髄膜を除去した後、HBSS中に回収されます。（ D）ニューロンは6 cmディッシュでのストライプ上で培養される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
コントロールFcおよびFLRT2-Fcおよび海馬神経細胞の解離培養図3.ストライプアッセイ。解離海馬神経細胞E15.5マウスからは、コントロールのFc（AC）またはFLRT2-Fcの（DF）のストライプ上で24時間培養しました。（ A'-C '、D'-F'、D '' - F '発生した交流、DF、およびD'-F（中箱入りの地域から'）拡大画像」。それぞれ、）（A、A '）ストライプス蛍光使用すると、対照実験としてのFc（灰色）およびFc（黒）を標識した。（D、D '、D' '）のFc（黒）と交互に蛍光標識されたFLRT2-Fcのストライプ（グレー）。（B、B'、E海馬ニューロンの細胞体と軸索の、E '、E' '）抗TAU1抗体染色（C、C'、F、F '、F' '）の縞の画像および抗TAU1染色マージされました。 neurアドオン'（、F' '細胞体と軸索は強 くFLRT2-FcのF、F）から反発しました」。軸索は国境に沿って曲がり、（F中の矢頭''）FLRT2-Fcとの領土を入力しないことに注意してください.ScaleバーはCで100ミクロンである、C '、F、F'とFで25μmの''。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
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Discussion
このプロトコルは、E15.5マウス海馬から組換えタンパク質および解離ニューロンを使用してストライプアッセイを説明します。このアッセイは、ストライプ状に配置された目的の組換えタンパク質に対するニューロンの、反発魅力的、または中立的応答の効率的な観察を可能にします。このプロトコルの主な利点は、特別な行列、真空システムを必要とする従来の方法に比較して、タンパク質を直接プラスチック皿の表面上に印刷されたストライプを生成するための簡単な方法、およびのNucleopore膜である20 、21。タンパク質のストライプを作成するには、標識された組換えタンパク質は、小さな穴を介して注入することができ、またはより大きなサンプル（〜100μl）を、マトリックスの頂部にスリット内に配置することができ、余分なバッファーおよび非結合タンパク質を慎重に吸引が続きますスルーホール。
この方法の別の利点は、ニューロンの多数として視覚化することができるということですイングル実験、及び多くの成長円錐は、同時に21を分析することができます。対照的に、従来の転換アッセイにおいて、単一のニューロンと単一の成長円錐を可視化します。反発分子FLRT2はFLRT2-Fcのストライプ21から離れて移行するニューロン、によって感知されます。緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）のようなレポーター分子は、カーペットの色に対してそれらを可視化し、免疫染色を必要とせずにリアルタイム観察を可能にするために、神経細胞において発現させることができます。 FLAG、Mycのような他のタグ、およびHisの代わりのFcタグを使用し、適切な蛍光標識された抗タグ抗体（ステップ2.1）を用いて同定することができます。いくつかの高疎水性タンパク質が原因自己凝集の適切なストライプを作成することはできません。さらに、2つの異なる標的タンパク質との間の引力と斥力の相対的な動作は、制御のFcストライプ20のための第二の標的タンパク質を置換することによって比較することができます。
にニューロンの生存率を増加させる、酵素消化時間およびトリプシン阻害の調整が必要とされてもよいです。ニューロンの生存率が低い場合は、トリプシンの濃度を希釈または酵素消化の時間を短縮します。インキュベーターの湿度レベルは、培養期間を通じて完全なシステムにおける蒸発によって誘発される浸透圧を回避するために維持されるべきです。
皿にマトリックスの接着性が良好なストライプを製造するための重要な因子です。無秩序なストライプパターンで皿表面の結果に不適切な遵守。しかし、細胞および基質の濃度の濃度はまた、成功した実験のために重要です。ストライプ内のより高いタンパク質濃度は、その反発や魅力的な活動は不明である分子を分析するために推奨されています。我々は解離初代神経細胞を使用して、このプロトコルを実証しているが、それはまた、器官外植片培養液15に適用可能です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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