Introduction
Axon vejledning er den proces, hvorved nydannede neuroner sender axoner til deres target under udviklingen af nervesystemet 1,2. Udviklingslande axoner bære en meget motile struktur på deres spids kaldes kegle vækst. Keglen vækst registrerer ekstracellulære stikord til at navigere Axon vej. Guidance molekyler, såsom slids, semaphorin og ephriner, kan tiltrække eller frastøde axoner afhængigt af deres interaktion med egnede receptorer og co-receptorer på Axon 1,3,4. De aktiverede receptorer overfører signaler til væksten kegle, der påvirker dets cytoskeletorganisation for Axon og vækst-kegle bevægelser.
Der er udviklet forskellige metoder til at vurdere virkningen af tiltrækkende og frastødende molekyler. Kemo-tiltrækkende og afskrækningsmidler kan administreres i vækst / dyrkningsmediet med en gradient koncentration (f.eks., Dunns kammer eller u--slides) 5,6, i en meget koncentreret stedet ved mikro-pipette (f.eks., drejning assay) 7 eller ved en homogen koncentration af bad program (f.eks., vækst kegle sammenbrud assay) 8,9.
Andre metoder omfatter en stribe assay eller mikrokontakt-printing (μCP), hvori en kemo-tiltrækningsstof eller frastødende coates på overfladen af en plade som substrat 10-12. Thestripe assay blev oprindeligt udviklet af Bonhoeffer og kolleger i 1987 for at analysere topografisk kortlægning i chick retino-tectal systemet 13. Den oprindelige metode krævede et vakuumsystem til kappeproteiner på polycarbonat Nucleopore membraner ved anvendelse stribede og i indgreb matricer. I senere versioner, blev de rekombinante proteiner er direkte trykt på overfladen af en agarplade i et stribet mønster under anvendelse smal spalte silicium matricer 14,15. For nylig har forskellige forskergrupper succes anvendt denne stribe assay til analysen af axon vejledning molekyle aktiviteter 16-21.
21. Efter 24 timers dyrkning blev både axoner og celle organer neuronerne stærkt frastødt fra FLRT2 striber. Farvning med et anti-Tau1 antistof viste, at ~ 90% af neuronerne blev fordelt på de Fc-belagte områder, sammenlignet med ~ 10% på FLRT2-Fc, hvilket viser, at FLRT2 har en stærk frastødendefunktion for hippocampale neuroner 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Hamamatsu University School of Medicine.
1. Fremstilling af matricer
- Kog 4-8 silikone matricer i en mikrobølgeovn eller på en varmeplade i 5 min, og lad dem tørre helt i 1 time under laminar strømning (stribet opad).
Bemærk: bør udføres De følgende procedurer under laminar strømning. - Blæs trykluft eller bruge transparent tape til at fjerne støv fra den stribede side af matricer. Hold den stribede side ren, så det kan fast holde sig til pladens overflade.
- Placer forsigtigt matricerne onto 6-cm plastskåle ved at trykke med en finger (en matrix per skål, stribe nedad). Undgå at få luftbobler mellem matrixen og skålen. Markere placeringen af striberne på undersiden af dyrkningsskålen.
- Hvis matricen ikke vedhæfte Gentag fra trin 1.2.
2. Stripe Generation og Laminin Coating for Neuron Kultur
- Forbered fluorescensmærket rekombinant protein (25 pi hver til injektion [trin 2.2] eller 100 pi hver til placeringsmetoden [trin 2.2.1]) ved blanding af de Fc-mærkede protein (10-50 ug / ml) og en fluorescerende farvestofbaseret konjugeret anti-humant Fc-antistof (1 til 3 ratio: 30-150 pg / ml) i phosphatpufret saltvand (PBS). Derefter inkuberes blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af en 22-G sprøjte injiceres 25 pi af rekombinant protein fremstillet i det foregående trin (2,1) gennem det lille hul på siden af matricen (pilene i figur 1A, 1C, og 1E).
- Alternativt placere 100 pi af rekombinant protein i den øverste spalte af matricen og aspireres cirka halvdelen af opløsningen fra det lille hul (pile i figur 1A, 1C og 1E), således at det rekombinante protein forbliver i de stribede regioner.
- Inkubér fadet i 30 min ved 37 ° C i en cellekultur inkubator.
- Placer 300 pi PBS i den øverste spalte (Figur 1B) og aspirat fra det lille hul placeret på siden af matricen (pile i figur 1A, C og E) til fjernelse ubundne rekombinante proteiner. Må ikke aspireres PBS fuldstændigt, fordi proteinerne vil tørre. Gentag dette trin to gange. (3 gange i alt)
- Fjern forsigtigt matrix og straks placere ~ 100 pi kontrol protein (10-50 mg / ml; Fc) til at dække hele stribede området, hvilket skaber en alternativ belægning. Derefter inkuberes skålen i 30 minutter ved 37 ° C i cellekultur inkubator.
- Efter vask af skålen overfladen tre gange med PBS, overtrække den med ~ 100 pi 20 pg / ml laminin i PBS.
Bemærk: Laminin skal optøs på is for at forhindre størkning. - Inkubér skålen i 1 time ved 37 ° C i cellekultur inkubator.
- Skålen skylles med overfladen tre gange med PBS og tilsæt kultur medium. Placer belagt skål med dyrkningsmedium i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C indtil anvendelse.
3. Dyrkning hippocampusneuroner fra E15.5 mus Embryoner
- Euthanize mor via cervikal dislokation og isolere tre E15.5 embryoer.
- Skære huden og kraniet sagittalt på midterlinjen af hovedet med en saks, og fjern hjernen med en lille ske. Overfør hjernen omhyggeligt til en 60-mm petriskål indeholdende 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Ved hjælp af en skalpel, skåret ud halvkugler herunder cortex, hippocampus og striatum (figur 2A). Derefter dissekere den hippocampale region ved omhyggeligt at fjerne meninges, og overføre de dissekerede hippocampus væv til en 15-ml centrifugerør indeholdende 2 ml HBSS opløsning, på is (figur 2B-C). Saml 6 hippocampi fra 3 embryoner i røret, som er tilstrækkelige til dyrkning af neuroner i 8 retter.
- Udskift HBSS opløsning med trypsin / EDTA-opløsning (2 ml) og inkuber røret ved 37 ° C i 15 minutter i et vandbad.
Bemærk: Aspirer HBSS uden centrifugering og ikke dekanteres HBSS løsning ved at vippe røret. - Neutralisere trypsin aktivitet ved tilsætning af 500 pi føtalt bovint serum (FBS).
- Centrifugeres blandingen ved 100 xg i 5 min. Fjern supernatanten og vask pellet med 2 ml kulturmedium. Gentag dette trin en gang mere.
- Pipetter hippocampusen op og ned 10 gange i dyrkningsmedium ved anvendelse af en 1.000-pi spids med et stort hul (cut-tip) at dissociere vævet.
- Skift til en regelmæssig (uncut) 1,000-pi spids og pipetteres den dissocierede væv op og ned for at opnå en enkelt-cellesuspension.
- Adskil de enkelte celler ved at passere dem gennem en 80-100-um mesh celle si.
- Centrifugeres den filtrerede enkelt cellesuspension ved 150 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten ved sugning, og resuspender hulterET (neuroner) i 2 ml dyrkningsmedium.
- Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer med trypan blue-farvning for at bestemme densiteten og levedygtighed. Derefter plade 10.000 neuroner i 150 pi dyrkningsmedium for hvert sæt stripes.The suspension bør nøje placeret til at dække hele stribe regionen.
4. Visualisering af Cell organer og Axoner ved immunfluorescensfarvning ved hjælp af et anti-Tau1 antistof
- Efter 24 timers kultur, aspireres mediet uden at forstyrre adhærente celler, og fastgør neuronerne med forvarmet 4% paraformaldehyd (PFA) / 4% saccharose / PBS ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask pladen overflade 3 gange med PBS. Anvend om en vandafvisende pen til at tegne en cirkel omkring den stribede region for at sænke mængden af antistof er nødvendigt.
- Permeabilisere de neuroner med 0,3% Triton X-100 / PBS i 5 minutter.
- Inkubér neuroner med blokerende opløsning indeholdende 3% donkey serum og 0,1% Triton X-100 for30 minutter, efterfulgt af inkubation med et anti-Tau1 antistof (1: 200) i 1% donkey serum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N ved 4 ° C.
- Vask pladen overflade 3 gange med PBS. Inkuber de neuroner med en fluorofor-konjugeret anti-muse-IgG-antistof i 1% bovint serumalbumin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS i 30 min.
- Vask pladen overflade 3 gange med PBS. Dæk stribede region med en 18 mm x 18 mm dækglas hjælp 50 ul antifade løsning. undgå luftbobler, som interfererer med billeddannelse.
- Opnå fluorescerende billeder med et fluorescensmikroskop ved anvendelse af passende system, f.eks x10 objektiv linse, filtersæt for GFP og RFP, og 1000-msek behandlingstid (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissocierede hippocampale neuroner fra E15.5 mus blev udpladet og dyrket i 24 timer på striber af fluorescensmærkede kontrol Fc (figur 3A-C) eller FLRT2-Fc (figur 3D-F) skiftevis med ikke-mærket kontrol Fc. I begge tilfælde, neuronerne var aggregeret og udvidet deres axoner som bundter. På kontrol Fc / Fc striber blev neuroner fordelt ligeligt på fluorescens-mærkede og ikke-mærkede striber, og de udvidede deres axoner i tilfældige retninger (figur 3A-C). I modsætning hertil når de dyrkes på FLRT-2fc / Fc striber, axonerne undgås vokser på FLRT2-Fc-regioner. Således blev der strækker axoner hovedsageligt placeret på kontrol Fc (figur 3D-F). Især blev både celle organer og axoner frastødt fra FLRT2-Fc. Således axonerne forlænget i en retning parallelt med striberne figur 3D «.« - F '' viser, at axoner voksede sammengrænsen mellem kontrol Fc og FLRT2-Fc, men ikke strækker sig ind i FLRT2 område.
Figur 1. Silicon Matrix bruges til at skabe den stribede protein stempel. (A, B) Ovenfra af silicium matrix. Størrelsen af matrix er 30 mm x 25 mm x 5 mm. Hvid pil i A angiver en lille hul, hvor det rekombinante protein injiceres (trin 2.2). Pilespids i B indikerer en slids, hvor det rekombinante protein er alternativt anvendes (trin 2.2.1). (C, D) nedefra af silicium matrix. Størrelsen af det stribede region er 7 mm x 9 mm. Bredden af hver stribe er 90 um. Pil angiver en lille kanalen, gennem hvilken det rekombinante protein injiceres. (E) Skematisk illustration af det sagittale visning på midterlinjen af matrix over forbindelsen mellem det lille hul, striberne, og slidsen. Pilen angiver i njection hul. Scale barer er 500 um i AC og 200 um i D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Dissektion af mus hippocampus. (A) set fra oven muse embryonale hjerne viser skærepositionen (stiplet linie) på den isolerede halvkugler herunder hippocampus, cortex og striatum. (B, C) Den isolerede hippocampus opsamles i HBSS efter fjernelse meninges. ( D) Neuroner dyrkes på striber i en 6-cm skål. klik her for at se en større version af dette tal.
ftp_upload / 54.096 / 54096fig3.jpg "/>
Figur 3. Stripe assays med kontrol Fc og FLRT2-Fc og en dissocieret kultur af hippocampale neuroner. Dissocierede hippocampale neuroner fra E15.5 mus blev dyrket i 24 timer på striber af kontrol Fc (AC) eller FLRT2-Fc (DF). ( A'-C, D'-F ', D' '- F' ') Forstørrede billeder fra boxed regioner i (AC, DF, og D'-F'., henholdsvis) (A, A 'genereret) Stripes ved hjælp af fluorescensmærket Fc (grå) og Fc (sort) som et kontrolforsøg. (D, D ', D' ') fluorescensmærkede FLRT2-Fc striber (grå) skiftevis med Fc (sort). (B, B', E , E ', E' ') anti-Tau1 antistof farvning af celle organer og axoner af hippocampus neuroner. (C, C', F, F ', F' ') billederne af de striber og den anti-Tau1 farvning blev lagt sammen. Den NEURons 'celle organer og axoner var stærkt frastødt fra FLRT2-Fc (F, F', F ''). Bemærk, at axoner tænder langs grænsen, og ikke ind i FLRT2-Fc område (pilespidser i F '') .Scale barer er 100 um i C, C ', F, F' og 25 um i F ''. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en stribe assay, der anvender rekombinant protein og dissocierede neuroner fra E15.5 musehippocampus. Dette assay muliggør effektiv observation af frastødende, attraktive, eller neutrale reaktioner af neuroner til et rekombinant protein af interesse anbringes i et stribet mønster. En stor fordel ved denne protokol er den enkle metode til generering striberne, hvor proteinet er direkte trykt på overfladen af en plastik skål, sammenlignet med den traditionelle metode, som kræver særlige matricer, et vakuumsystem og et Nucleopore membran 20 , 21. For at gøre protein striber, kan det mærkede rekombinante protein injiceres gennem et lille hul eller en større prøve (~ 100 pi) kan placeres i slidsen på toppen af matrixen, efterfulgt af omhyggelig aspiration af overskydende buffer og ubundne proteiner gennem hullet.
En anden fordel ved denne fremgangsmåde er, at et stort antal neuroner kan visualiseres ind somIngle eksperiment, og mange vækstkegler kan analyseres samtidigt 21. I modsætning hertil i en konventionel drejning assay kun en enkelt neuron og enkelt kegle vækst visualiseret. Den frastødende molekyle FLRT2 afføles af neuroner, der vandrer væk fra FLRT2-Fc striber 21. Et reportermolekyle som grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP) kan udtrykkes i neuronerne at visualisere dem mod gulvtæppet farve og muliggøre real-time observation uden behov for immunfarvning. Andre tags som FLAG, Myc, og Hans kan anvendes i stedet for Fc-tag, og identificeret med det passende fluorescensmærket anti-tag-antistof (trin 2.1). Nogle høje hydrofobe proteiner kan ikke gøre ordentlig stribe på grund af selvaggregering. Desuden kan den relative virkning af tiltrækning og frastødning mellem to forskellige målproteiner sammenlignes ved at substituere et andet target-protein for kontrol Fc stribe 20.
Tiløge levedygtigheden af de neuroner, kan være nødvendige justeringer i den enzymatiske fordøjelse tid og trypsin hæmning. Hvis overlevelse forholdet mellem neuroner er lavt, fortynde koncentrationen af trypsin eller forkorte enzymatisk fordøjelse tid. bør opretholdes luftfugtighed på inkubatoren for at undgå fordampning-induceret osmotiske tryk i det komplette system i hele dyrkningsperioden.
Adhæsionen af matrixen i skålen er en vigtig faktor til fremstilling gode striber. Forkert tilslutning til parabol overflade resulterer i en uorganiseret stribe mønster. Imidlertid densiteten af celler og koncentration af substrat er også afgørende for en vellykket eksperiment. En koncentration højere protein i stribe anbefales til analyse af en molekyle, hvis frastødende eller tiltrækkende aktivitet er ukendt. Selv om vi har demonstreret dette protokol ved at anvende dissocierede primære neuroner, er det også anvendes til organotypiske eksplantatkulturer 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
