Introduction
Axon veiledning er prosessen der nydannede nerveceller sender aksoner til deres mål under utviklingen av nervesystemet 1,2. Utvikling aksoner bære en svært bevegelige struktur på sine tips kalt vekst kjegle. Veksten kjegle sanser ekstracellulære signaler for å navigere i axon bane. Veiledning molekyler, slik som slit, semaphorin og ephrins, kan tiltrekke eller frastøte axoner avhengig av deres interaksjon med egnede reseptorer og co-reseptorer på aksonet 1,3,4. De aktiverte reseptorene overfører signaler til veksten kjegle som påvirker dens cytoskeletal organisasjon for axon og vekst-membran bevegelser.
Forskjellige fremgangsmåter har blitt utviklet for å evaluere virkningen av tiltrekkende og avstøtende molekyler. Chemo-lokkemidler kan bli administrert til vekst / kulturmedium med en gradient konsentrasjon (f.eks., Dunn kammer eller u-sklier) 5,6, i en meget konsentrert flekk ved mikro-pipette (f.eks., snu assay) 7 eller ved en homogen konsentrasjon av bad program (f.eks., vekst kjegle kollaps analyse) 8,9.
Andre fremgangsmåter innbefatter en stripe assay eller mikrokontakttrykking (μCP), i hvilken en chemo-tiltrekkende eller frastøtende belegges på overflaten av en plate som et substrat 10-12. Thestripe analysen ble opprinnelig utviklet av Bonhoeffer og kolleger i 1987 for å analysere topografisk kartlegging i dama Retino-tectal system 13. Den opprinnelige metode kreves et vakuumsystem for å kappeproteiner på polykarbonatmembraner ved hjelp av Nucleopore stripet og stormasket matriser. I senere versjoner, ble de rekombinante proteinene direkte trykt på overflaten av en kulturplate i et stripet mønster ved hjelp av smal spalte silisium matriser 14,15. Nylig har ulike forskningsgrupper med hell brukt denne stripe analyse til analyse av axon veiledning molekyl aktiviteter 16-21.
21. Etter 24 timer med kultur, ble både axoner og celle likene av nevroner sterkt frastøtt fra FLRT2 striper. Farging med et anti-Tau1-antistoff viste at ~ 90% av nevronene ble fordelt på Fc-belagte områder, sammenlignet med ~ 10% på den FLRT2-Fc, noe som indikerer at FLRT2 har et sterkt frastøtendefunksjon for hippocampus nevroner 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Hamamatsu University School of Medicine.
1. Utarbeidelse av matriser
- Kok 4-8 silikon matriser i mikrobølgeovn eller på en varm plate for 5 min og la dem tørke helt i 1 time under laminær (stripete siden opp).
Merk: Følgende prosedyrer skal utføres under laminær. - Blås trykkluft eller bruke tapen for å fjerne støv fra den stripete siden av matriser. Hold stripete side ren, så det kan godt følge til platen overflaten.
- Plasser forsiktig matrisene bort på 6 cm plast retter ved å trykke med en finger (en matrise per tallerken; stripe siden ned). Unngå å få luftbobler mellom matrise og parabolen. Marker plasseringen av stripene på undersiden av kulturen fatet.
- Dersom matrisen ikke fester, gjenta fra trinn 1.2.
2. Stripe Generation og Laminin Coating for Neuron Kultur
- Forbered fluorescensmerkede rekombinant protein (25 ul hver for injeksjon [trinn 2.2] eller 100 pl hver for plassering metoden [trinn 2,2,1]) ved å blande den Fc-kodede protein (10-50 ug / ml) og et fluorescerende farve konjugert anti-humant Fc-antistoff (1 til 3 ratio: 30-150 mikrogram / ml) i fosfatbufret saltvann (PBS). Deretter inkuberes blandingen i 30 minutter ved romtemperatur.
- Ved hjelp av en 22-G sprøyte, injisere 25 pl av det rekombinante protein fremstilt i det foregående trinn (2,1) gjennom det lille hullet på den side av matrisen (pilene i figur 1A, 1C, og 1E).
- Alternativt kan plassere 100 pl av det rekombinante protein i den øverste spalten av matrisen og aspireres omtrent halvparten av oppløsningen fra det lille hullet (pilene på figur 1A, 1C, og 1E), slik at det rekombinante protein forblir i stripete regionene.
- Inkuber fatet i 30 min ved 37 ° C i en cellekulturinkubator.
- Plasser 300 ul PBS i den øverste spalten (figur 1B) og aspireres fra det lille hullet på den side av matrisen (pilene på figur 1 A, C og E) for å fjerne ufestede rekombinante proteiner. Ikke aspirer PBS helt, fordi proteinene vil tørke. Gjenta dette trinnet to ganger. (3 ganger totalt)
- Fjern forsiktig matrisen og umiddelbart plassere ~ 100 ul kontroll protein (10-50 ug / ml; Fc) for å dekke hele området stripet, og en alternativ belegg. Deretter inkuberes fatet i 30 minutter ved 37 ° C i cellekulturinkubator.
- Etter vasking av skåloverflaten tre ganger med PBS, belegge den med ~ 100 ul av 20 ug / ml laminin i PBS.
Merk: Laminin bør tines på is for å hindre størkning. - Inkuber fatet i 1 t ved 37 ° C i cellekulturinkubator.
- Vask den skåloverflaten tre ganger med PBS og legge til dyrkningsmediaum. Plasser den belagte fatet med kulturmedium i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C inntil bruk.
3. Dyrking hippocampus nevroner fra E15.5 mus embryoer
- Avlive moren via cervical forvridning og isolere tre E15.5 embryoer.
- Kutt i huden og hodeskallen sagittally ved midtlinjen av hodet med saks, og fjerne hjernen ved hjelp av en liten skje. Overfør hjernen forsiktig til en 60-mm petriskål inneholdende 3 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
- Ved hjelp av en skalpell, kuttet ut halvkulene inkludert cortex, hippocampus og striatum (figur 2A). Deretter dissekere ut hippocampus-området ved å forsiktig fjerne hjernehinnene, og overfører de dissekerte vev hippocampus til 15 ml sentrifugerør inneholdende 2 ml HBSS-oppløsning, på is (figur 2B-C). Samle 6 hippocampi fra 3 embryoer i røret, som er tilstrekkelig for dyrking av nevroner i 8 retter.
- Sett på HBSS løsning med trypsin / EDTA-løsning (2 ml) og inkuber i røret ved 37 ° C i 15 minutter i et vannbad.
Merk: Aspirer HBSS uten sentrifugering, og ikke dekanter HBSS løsningen ved å vippe røret. - Nøytralisere trypsin-aktivitet ved å tilsette 500 ul av føtalt bovint serum (FBS).
- Sentrifuger blandingen ved 100 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten og vask det pellet med 2 ml kulturmedium. Gjenta dette trinnet en gang.
- Pipet hippocampi opp og ned 10 ganger i dyrkingsmedium ved hjelp av en 1000-ul spiss med et stort hull (cut-tip) for å distansere vevet.
- Bytt til en vanlig (uncut) 1000-ul tips og pipettér det dissosierte vev opp og ned for å få en encellet suspensjon.
- Skill enkeltceller ved å føre dem gjennom et 80-100-pm sikt celle sil.
- Sentrifuger den filtrerte enkelt cellesuspensjon ved 150 xg i 5 minutter.
- Fjern supernatanten ved å aspirere, og resuspender pellet (neuroner) i 2 ml kulturmedium.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer med trypanblått-farving for å bestemme tettheten og levedyktighet. Deretter plate 10000 neuroner i 150 ul kulturmedium for hvert sett av stripes.The suspensjon bør være nøye plassert for å dekke hele stripe regionen.
4. Visualisering av celle organer og Axoner av immunfluorescens Farging hjelp av en anti-Tau1 antistoff
- Etter 24 timers dyrkning aspirere mediet uten å forstyrre de adherente cellene, og feste nervecellene med forvarmet 4% paraformaldehyd (PFA) / 4% sukrose / PBS ved romtemperatur i 15 min.
- Vask platen overflate 3 ganger med PBS. Om ønskelig, kan du bruke en vannavvisende penn til å tegne en sirkel rundt den stripete regionen for å redusere mengden av antistoff nødvendig.
- Permeabilize neuronene med 0,3% Triton X-100 / PBS i 5 min.
- Inkuber neuronene med blokkeringsløsning inneholdende 3% esel serum og 0,1% Triton X-100 for30 minutter etterfulgt av inkubasjon med et anti-Tau1-antistoff (1: 200) i 1% esel serum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N ved 4 ° C.
- Vask platen overflate 3 ganger med PBS. Inkuber neuronene med en fluorofor-konjugert anti-mus-IgG-antistoff i 1% bovint serumalbumin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS i 30 min.
- Vask platen overflate 3 ganger med PBS. Dekk stripete regionen med en 18 mm x 18 mm dekkglass ved hjelp av 50 ul antifade løsning. unngå luftbobler, som interfererer med bildebehandling.
- Skaff fluorescerende bilder med en fluorescens mikroskop ved hjelp av riktig system, f.eks x10 objektiv, filter sett for GFP og RFP, og 1000-ms eksponeringstid (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissosierte hippocampale nerveceller fra E15.5 mus ble sådd ut og dyrket i 24 timer på striper av fluorescensmerkede kontroll Fc (Figur 3A-C) eller FLRT2-Fc (Figur 3D-F) som alternerer med ikke-merket kontroll Fc. I begge tilfeller nervecellene var samlet og utvidet sine aksoner som bunter. På kontroll Fc / Fc striper, nervecellene ble fordelt jevnt på fluorescensmerkede og ikke-merkede striper, og de utvidet sine axoner i tilfeldige retninger (figur 3A-C). I kontrast, når dyrket på FLRT-2FC / Fc striper, aksonene unngått vokser på FLRT2-Fc regioner. Således, de utragende aksoner ble i hovedsak plassert på kontroll Fc (Figur 3D-F). Spesielt, ble begge cellelegemene og aksoner frastøtt fra FLRT2-Fc. Således aksonene forlenget i en retning parallelt med stripene figur 3D. '' - F '' viser at aksonene vokste langsgrensen mellom kontroll Fc og FLRT2-Fc men ikke strekker seg inn i FLRT2 territorium.
Figur 1. Silicon Matrix brukt til å lage den stripete protein stempel. (A, B) Top av silikonmatrise. Størrelsen på matrisen er 30 mm x 25 mm x 5 mm. Hvite pilen i A angir et lite hull hvor det rekombinante protein er injisert (trinn 2.2). Pilspiss i B indikerer en spalte hvor det rekombinante protein er alternativt anvendes (trinn 2.2.1). (C, D) fra undersiden av silikonmassen. Størrelsen av den stripete regionen er 7 mm x 9 mm. Bredden av hver stripe er 90 um. Pilen angir en liten kanal gjennom hvilken det rekombinante protein er injisert. (E) viser skjematisk sagittal visningen på midtlinjen av matrisen som viser forbindelsen mellom det lille hullet, stripene, og slissen. Pilen angir i njection hullet. Skala barer er 500 mikrometer i AC og 200 mikrometer i D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Disseksjon av mus hippocampus. (A) sett ovenfra av muse-embryonale hjerne som viser skjærestillingen (stiplet linje) på de isolerte halvkuler, inkludert hippocampus, cortex og striatum. (B, C) Det isolerte hippocampus oppsamles i HBSS etter fjerning hjernehinnene. ( D) Nerveceller er dyrket på stripene i en 6-cm tallerken. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
Figur 3. Stripe analyser med kontroll Fc og FLRT2-Fc og en dissosiert kultur av hippocampus nevroner. Dissosierte hippocampus nevroner fra E15.5 mus ble dyrket i 24 timer på striper av kontroll Fc (AC) eller FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D'-F', D '' - D '') forstørrede bilder fra de regioner i eske (AC, DF, og D'-F '., henholdsvis) (A, A') Striper som genereres ved hjelp av fluorescensmerkede Fc (grå) og Fc (svart) som en kontroll eksperiment. (D, D ', D' ') fluorescensmerkede FLRT2-Fc striper (grå) alternerer med Fc (svart). (B, B', E , E ', E' ') anti-Tau1 antistoff farging av cellelegemene og aksoner av hippokampale neuroner. (C, C', F, F ', F' ') bildene av stripene og den anti-Tau1 farging ble slått sammen. den Neuerons 'celle organer og aksoner var sterkt frastøtt fra FLRT2-Fc (F, F', F ''). Merk at aksoner slår langs grensen og ikke inn i FLRT2-Fc territorium (pilspisser i F '') .Scale barer er 100 mikrometer i C, C, F, F 'og 25 mikrometer i F' '. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en stripe analysen som bruker rekombinant protein og dissosiert nevroner fra E15.5 mus hippocampus. Denne analysen tillater effektiv observasjon av frastøtende, attraktive, eller nøytrale responsene til neuroner til et rekombinant protein av interesse plasseres i et stripet mønster. En stor fordel med denne protokollen er den enkle metode for generering av striper, hvori proteinet er direkte trykt på overflaten av en plastskål, sammenlignet med den tradisjonelle metode, som krever særskilte matriser, et vakuumsystem, og en Nucleopore membran 20 , 21. For å gjøre protein stripene, kan den merkede rekombinante protein bli injisert gjennom et lite hull eller en større prøve (~ 100 ul) kan plasseres i slissen på toppen av matrisen, etterfulgt av forsiktig aspirasjon av overskudd av buffer og ikke-bundne proteiner gjennom hullet.
En annen fordel med denne metoden er at et stort antall av neuroner kan visualiseres i såingle eksperiment, og mange vekst kjegler kan analyseres samtidig 21. I motsetning til dette, i en konvensjonell dreie analysen, er bare en enkelt neuron og enkelt vekst kjegle visualisert. Den frastøtende molekylet FLRT2 føles av nevroner, som vandrer bort fra FLRT2-Fc striper 21. En rapportørmolekyl som grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP) kan uttrykkes i neuronene for å visualisere dem mot teppet farge og tillate sanntids overvåkning uten behov for immunfarging. Andre koder som FLAG, Myc, og His kan anvendes i stedet for Fc-taggen, og identifisert med det passende fluoresceinmerket anti-tag antistoff (trinn 2.1). Noen høye hydrofobe proteiner kan ikke gjøre riktig stripe på grunn av selv aggregering. Videre kan den relative virkning av tiltrekning og frastøtning mellom to forskjellige målproteiner bli sammenlignet ved å substituere en annen målprotein for kontroll Fc stripe 20.
Tiløke levedyktigheten av nerveceller, kan justeringer i enzymatisk fordøyelse tid og trypsin hemming være nødvendig. Dersom forholdet overlevelse av neuroner er lav, fortynne konsentrasjonen av trypsin eller forkorte den enzymatiske fordøyelse tid. Fuktighetsnivået i kuvøse bør opprettholdes for å unngå fordampning-indusert osmotisk trykk i hele systemet gjennom hele dyrkningsperioden.
Adhesjonen av matrisen til fatet er en viktig faktor ved fremstilling av gode striper. Feilaktig tilslutning til tallerken overflaten resulterer i en uorganisert stripe mønster. Likevel er tettheten av celler og konsentrasjon av substrat er også avgjørende for en vellykket eksperiment. En høyere proteinkonsentrasjon i den stripe er anbefalt for å analysere et molekyl hvis frastøtende eller attraktiv aktivitet er ukjent. Selv om vi har vist denne protokollen med dissosierte primære nerveceller, er det også aktuelt for organotypiske eksplantering kulturer 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
