Introduction
Axon vägledning är den process genom vilken nybildade nervceller skickar axoner till sina mål under utvecklingen av nervsystemet 1,2. U-axoner bär en mycket motila struktur vid sin spets kallas tillväxten konen. Tillväxten konen känner extracellulära signaler att navigera axonet väg. Väglednings molekyler, såsom slitsen, semaforin och ephrins, kan attrahera eller repellera axoner beroende på deras interaktion med lämpliga receptorer och co-receptorer på axonet 1,3,4. De aktiverade receptorer överför signaler till tillväxten konen som påverkar dess cytoskelettala organisation för axon och tillväxt kon rörelser.
Olika metoder har utvecklats för att utvärdera verkan av lockmedel och repellerande molekyler. Kemo-attraherande och repellerande medel kan administreras i tillväxten / odlingsmedium med en gradient koncentration (eg., Dunn kammare eller | i-slides) 5,6, i en högkoncentrerad plats av mikro-pipette (eg., svarvning analys) 7 eller en homogen koncentration av bad ansökan (eg., tillväxten konen kollaps analys) 8,9.
Andra metoder inkluderar en rand analys eller mikrokontakttryckning (μCP), i vilken en kemo-attraherande eller bortstötande beläggs på ytan av en platta som ett substrat 10-12. Thestripe analys utvecklades ursprungligen av Bonhoeffer och kollegor i 1987 för att analysera topografisk kartläggning i chick Retino-tectal systemet 13. Den ursprungliga metoden krävs ett vakuumsystem för att belägga proteiner på polykarbonat Nucleopore membran med hjälp av randiga och nät med matriser. I senare versioner, var de rekombinanta proteinerna är direkt tryckt på ytan av en odlingsplatta i ett randigt mönster med hjälp av smala slitskiselmatriserna 14,15. Nyligen har olika forskargrupper framgångsrikt tillämpat denna rand analys till analys av Axon vägledning molekyl aktiviteter 16-21.
21. Efter 24 h odling, var både axoner och cellkropparna av nervceller kraftigt repelleras från FLRT2 ränder. Färgning med en anti-Tau1 antikropp avslöjade att ~ 90% av neuronerna var fördelade på Fc-belagda regioner, jämfört med ~ 10% på FLRT2-Fc, vilket indikerar att FLRT2 har en stark motbjudandefunktion för hippocampala neuroner 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Hamamatsu University School of Medicine.
1. Framställning av matriser
- Koka 4-8 silikon matriser i en mikrovågsugn eller på en värmeplatta i 5 minuter och låt dem torka helt för 1 h under laminärt flöde (randig uppåt).
Obs: Följande procedurer bör utföras under laminärt flöde. - Blås tryckluft eller använda genomskinlig tejp för att avlägsna damm från randiga sidan av matriserna. Håll randiga sidan ren så det kan säkert hålla sig till plattans yta.
- Placera försiktigt matriserna på 6 cm plastskålar genom att trycka med ett finger (en matris per fat, rand nedåt). Undvik att få luftbubblor mellan matrisen och skålen. Markera platsen av ränder på bottensidan av odlingsskålen.
- Om matrisen inte bifoga upprepa från steg 1,2.
2. Stripe Generation och laminin beläggning för Neuron kultur
- Förbereda fluorescensmärkt rekombinant protein (25 pl vardera för injektion [steg 2,2] eller 100 pl vardera för placeringen metod [steg 2.2.1]) genom blandning av den Fc-märkt protein (10-50 ^ g / ml) och en fluorescerande dye- konjugerad anti-human Fc-antikropp (1-3 förhållande: 30-150 ng / ml) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Därefter inkubera blandningen under 30 min vid RT.
- Med användning av en 22-G spruta, injicera 25 | il av det rekombinanta proteinet som framställts i föregående steg (2,1) genom det lilla hålet på den sida av matrisen (pilarna i figur 1 A, 1C, och 1E).
- Alternativt, placera 100 | il av det rekombinanta proteinet in i den övre slitsen av matrisen och aspirera ungefär hälften av lösningen från det lilla hålet (pilar i figur 1 A, 1C, och 1E), så att det rekombinanta proteinet förblir i de randiga områdena.
- Inkubera skålen i 30 min vid 37 ° C i en cellodlingsinkubator.
- Placera 300 ul av PBS i den övre slitsen (Figur 1B) och aspirera från det lilla hålet som sitter på sidan av matrisen (pilar i figur 1 A, C och E) för att avlägsna obundna rekombinanta proteiner. Behöver inte aspirera PBS helt, eftersom proteinerna kommer att torka. Upprepa detta steg två gånger. (3 gånger totalt)
- Försiktigt bort matrisen och omedelbart placera ~ 100 pl kontrollprotein (10-50 pg / ml; Fc) för att täcka hela randiga området, skapar en alternativ beläggning. Därefter inkubera skålen under 30 min vid 37 ° C i cellkultur inkubator.
- Efter tvättning av diskytan tre gånger med PBS, täcka den med ~ 100 | il av 20 | ig / ml laminin i PBS.
Obs: Laminin ska tinas på is för att förhindra stelning. - Inkubera skålen under 1 h vid 37 ° C i cellkultur inkubator.
- Tvätta diskytan tre gånger med PBS och till kultur medium. Placera den belagda skålen med odlingsmedium i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C fram till användning.
3. Odling hippocampus nervceller från E15.5 musembryon
- Avliva mor via cervikal dislokation och isolera tre E15.5 embryon.
- Skära in i huden och skalle sagittally vid mittlinjen av huvudet med en sax, och ta bort hjärnan med hjälp av en liten sked. Överföra hjärnan försiktigt till en 60-mm petriskål innehållande 3 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
- Med hjälp av en skalpell, skär ut halvkloten inklusive cortex, hippocampus och striatum (Figur 2A). Då, dissekera ut hippocampus region genom att försiktigt avlägsna hjärnhinnorna, och överför dissekerade hippocampus vävnader till ett 15-ml centrifugrör innehållande 2 ml HBSS-lösning, på is (Figur 2B-C). Samla 6 hippocampi från 3 embryon i röret, som är tillräcklig för odling av neuroner i 8 rätter.
- Byt HBSS-lösning med trypsin / EDTA-lösning (2 ml) och inkubera röret vid 37 ° C under 15 min i ett vattenbad.
Obs: Sug HBSS utan centrifugering och inte dekantera HBSS lösning genom att luta röret. - Neutralisera trypsin-aktivitet genom tillsats av 500 | il av fetalt bovint serum (FBS).
- Centrifugera blandningen vid 100 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 2 ml odlingsmedium. Upprepa detta steg en gång.
- Pipett de hippocampi upp och ned 10 gånger i odlingsmedium med hjälp av en 1000-il spets med ett stort hål (cut-tip) för att dissociera vävnaden.
- Ändra till en vanlig (uncut) 1000-il spets och pipettera den dissocierade vävnaden upp och ned för att erhålla en enkelcellsuspension.
- Separera enskilda celler genom att passera dem genom en 80-100-um maskcellen sil.
- Centrifugera den filtrerade enda cellsuspension vid 150 xg under 5 min.
- Avlägsna supernatanten genom aspiration och resuspendera Pellet (neuroner) i 2 ml odlingsmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer med trypan blå färgning för att bestämma densitet och livskraft. Sedan plattan 10.000 neuroner i 150 pl odlingsmedium för varje uppsättning stripes.The suspension bör noggrant placerade för att täcka hela rand regionen.
4. Visualisering av cellkroppar och Axoner genom immunofluorescens färgning med hjälp av en anti-Tau1 antikropp
- Efter 24 h odling, aspirera mediet utan att störa de vidhäftande cellerna, och fixera nervceller med förvärmda 4% paraformaldehyd (PFA) / 4% sackaros / PBS vid RT under 15 min.
- Tvätta plattan ytan 3 gånger med PBS. Om så önskas, använda en vattenavvisande penna för att rita en cirkel runt den randiga regionen för att minska mängden antikropp som behövs.
- Permeabilisera nervceller med 0,3% Triton X-100 / PBS under 5 min.
- Inkubera nervceller med blockeringslösning innehållande 3% donkey serum och 0,1% Triton X-100 för30 min följt av inkubation med en anti-Tau1 antikropp (1: 200) i 1% donkey serum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N vid 4 ° C.
- Tvätta plattan ytan 3 gånger med PBS. Inkubera nervceller med en fluorofor-konjugerad anti-mus-IgG-antikropp i 1% bovint serumalbumin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS under 30 min.
- Tvätta plattan ytan 3 gånger med PBS. Täck randiga region med en 18 mm x 18 mm täckglas med användning av 50 pl av antifade lösning. undvika luftbubblor, som stör bild.
- Skaffa fluorescerande bilder med ett fluorescensmikroskop med hjälp av lämpligt system, till exempel x10 objektiv, filtersatser för GFP och RFP, och 1000-ms exponeringstid (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissocierade hippocampus neuroner från E15.5 möss ströks och odlades under 24 h på ränder av fluorescerande kontroll Fc (Figur 3A-C) eller FLRT2-Fc (Figur 3D-F) omväxlande med icke-märkt kontroll Fc. I båda fallen, de nervceller var aggregerat och utökat sina axoner som buntar. På kontroll Fc / Fc band, var nervceller jämnt fördelad på de fluorescerande och icke-märkta band, och de utökade sina axoner i slumpmässiga riktningar (Figur 3A-C). I kontrast, när de odlas på FLRT-2fc / Fc band, axonerna undvikas växer på FLRT2-Fc-regioner. Således var de utskjutande axoner huvudsakligen på kontroll Fc (Figur 3D-F). Noterbart var både cellkroppar och axoner repelleras från FLRT2-Fc. Sålunda axonerna utsträckt i en riktning parallell med de ränder Figur 3D '.' - F '' visar att axoner växte längsgränsen mellan kontroll-Fc och FLRT2-Fc men inte sträcker sig in i FLRT2 territorium.
Figur 1. Silicon Matrix används för att skapa den randiga protein stämpel. (A, B) Uppifrån av kiselmatrisen. Storleken på matrisen är 30 mm x 25 mm x 5 mm. Vit pil i A indikerar ett litet hål där det rekombinanta proteinet injiceras (steg 2,2). Pilspets i B indikerar en slits där det rekombinanta proteinet alternativt appliceras (steg 2.2.1). (C, D) Undersidan av kiselmatrisen. Storleken på den randiga regionen är 7 mm x 9 mm. Bredden på varje remsa är 90 | im. Pilen indikerar en liten kanal genom vilken det rekombinanta proteinet injiceras. (E) Schematisk illustration av sagittalvy vid mittlinjen av matrisen som visar sambandet mellan det lilla hålet, ränderna, och slitsen. Pilen indikerar den i: njection hål. Skala barer är 500 mikrometer i AC och 200 nm i D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Dissektion av mus hippocampus. (A) Uppifrån av mus embryonala hjärnan visar skärläget (streckad linje) på isolerade halvkloten inklusive hippocampus, cortex och striatum. (B, C) Den isolerade hippocampus samlas i HBSS efter avlägsnande hjärnhinnorna. ( D) Neuroner odlas på ränderna i en 6 cm skål. klicka här för att se en större version av denna siffra.
ftp_upload / 54.096 / 54096fig3.jpg "/>
Figur 3. Stripe analyser med kontroll Fc och FLRT2-Fc och en dissocierade kultur av hippocampus neuroner. Dissocierade hippocampus neuroner från E15.5 möss odlades under 24 timmar på ränder av kontroll-Fc (AC) eller FLRT2-Fc (DF). ( A'-C, D-F ', D' '- F' ') förstorade bilder från inramade regionerna i (AC, DF, och D'-F ". respektive) (A, A') Stripes genereras med hjälp av fluorescerande Fc (grå) och Fc (svart) som ett kontrollexperiment. (D, D ', D' ') fluorescerande märkta FLRT2-Fc ränder (grå) alternerande med Fe (svart). (B, B', E , E ', E' ') anti~~POS=TRUNC Tau1 antikroppsfärgning av cellkroppar och axoner hos de hippocampusneuroner. (C, C', F, F ', F' ') bilderna av de ränder och den anti-Tau1 färgning slogs samman. den Neurons "cellkroppar och axoner var starkt stöts från FLRT2-Fc (F, F ', F'). Observera att axoner vända längs gränsen och inte in i FLRT2-Fc territorium (pilspetsar i F '') .Scale barer är 100 pm i C, C, F, F 'och 25 nm i F' '. Klicka här att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en rand analys som använder rekombinant protein och dissocierade neuroner från E15.5 mus hippocampus. Denna analys gör det möjligt att effektivt observation av motbjudande, attraktiva, eller neutrala svar av nervceller till ett rekombinant protein av intresse placeras i ett randigt mönster. En stor fördel med detta protokoll är den enkla metoden för att generera ränderna, där proteinet är direkt tryckta på ytan av en plastskål, jämfört med den traditionella metoden, som kräver speciella matriser, ett vakuumsystem, och en Nucleopore membran 20 , 21. För att göra protein ränder, kan det märkta rekombinanta proteinet injiceras genom ett litet hål, eller ett större prov (~ 100 | al) kan placeras i slitsen på toppen av matrisen, följt av försiktig aspiration av överskott av buffert och obundna proteiner genom hålet.
En annan fördel med detta förfarande är att ett stort antal nervceller kan visualiseras in somingle experiment, och många tillväxtkoner kan analyseras samtidigt 21. Däremot i en konventionell vänd analysen sätts endast en enda neuron och enkel tillväxten konen visualiseras. Den repulsiva molekylen FLRT2 avkänns av neuroner, som migrerar bort från FLRT2-Fc band 21. En reportermolekyl som grönt fluorescerande protein (GFP) eller röd fluorescerande protein (RFP) kan uttryckas i neuronerna att visualisera dem mot mattan färg och tillåta realtidsobservation utan behov av immunfärgning. Andra taggar som FLAG, Myc och His kan användas i stället för Fc-taggen, och identifieras med den lämpliga fluorescensmärkt anti-tag-antikropp (steg 2,1). Vissa höga hydrofoba proteiner kan inte göra ordentlig rand på grund av själv aggregering. Vidare kan den relativa verkan av attraktion och repulsion mellan två olika målproteiner jämföras genom att ersätta en andra målprotein för kontroll Fc rand 20.
Tillöka lönsamheten för nervceller, kan justeringar i den enzymatiska koktiden och trypsin hämning behövas. Om överlevnadsförhållandet av neuroner är låg, späda ut koncentrationen av trypsin eller förkorta den enzymatiska uppslutningstiden. bör bibehållas fukthalten i inkubatorn för att undvika avdunstning-inducerad osmotiska trycket i hela systemet under hela odlingsperioden.
Vidhäftningen av matrisen till skålen är en viktig faktor för framställning av goda ränder. Felaktig anslutning till diskytan resulterar i en oorganiserad randmönster. Emellertid tätheten av celler och koncentrationen av substrat är också kritiskt för ett lyckat experiment. En högre proteinkoncentration i rand rekommenderas för analysering av en molekyl vars repulsiv eller attraktiva aktivitet är okänd. Även om vi har visat detta protokoll med dissocierade primära nervceller, är det också för organotypic Explantation kulturer 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
