Introduction
L' orientation Axon est le processus par lequel les neurones nouvellement formés envoient des axones à leur cible au cours du développement du système nerveux 1,2. axones en développement portent une structure très mobiles à leur extrémité appelée cône de croissance. Le cône de croissance détecte les signaux extracellulaires pour naviguer le chemin de l'axone. Molécules d'orientation, telles que fente, sémaphorine et ephrines, peuvent attirer ou repousser les axones en fonction de leur interaction avec des récepteurs appropriés et co-récepteurs sur l'axone 1,3,4. Les récepteurs activés transfèrent des signaux au cône de croissance qui affectent son organisation du cytosquelette pour axone et la croissance cône mouvements.
Diverses méthodes ont été mises au point pour évaluer l'action des molécules répulsives et attractives. Chemo-attractants et insectifuges peuvent être administrés dans le milieu de croissance / culture avec une concentration de gradient (par exemple., La chambre de Dunn ou u-slides) 5,6, dans un endroit très concentré par des micro-pipette (par exemple., essai tournant) 7 ou à une concentration homogène par application de bain (par ex., le dosage de l' effondrement du cône de croissance) 8,9.
D' autres procédés comprennent un essai de rayure ou de l' impression par microcontact (uCP), dans lequel un chimio-attractant ou répulsive est appliquée sur la surface d'une plaque de substrat 10 à 12. Thestripe essai a été initialement développé par Bonhoeffer et ses collègues en 1987 pour analyser la cartographie topographique dans le poussin système rétino-tectal 13. La méthode originale nécessitait un système de vide pour des protéines d'enveloppe sur des membranes Nucleopore polycarbonate en utilisant des matrices et des rayures maillés. Dans les versions ultérieures, les protéines recombinantes ont été imprimées directement sur la surface d'une plaque de culture dans un motif rayé en utilisant fente étroite matrices de silicium 14,15. Récemment, divers groupes de recherche ont appliqué avec succès ce test de bande à l'analyse des activités de molécules de guidage axonal 16-21.
21 alternance. Après 24 h de la culture, à la fois les axones et les corps cellulaires des neurones ont été fortement repoussés par les bandes de FLRT2. Coloration avec un anticorps anti-Tau1 ~ a révélé que 90% des neurones ont été distribués sur les régions Fc revêtues, par rapport à environ 10% sur la FLRT2-Fc, ce qui indique que FLRT2 a une forte répulsionfonction pour les neurones hippocampiques 21.
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Protocol
Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'École de médecine de l'Université Hamamatsu.
1. Préparation des matrices
- Faire bouillir 4-8 matrices de silicone dans un micro-ondes ou sur une plaque chauffante pendant 5 minutes et laissez-les sécher complètement pendant 1 h sous flux laminaire (côté rayé vers le haut).
Remarque: Les procédures suivantes doivent être effectuées sous flux laminaire. - Souffler de l'air comprimé ou d'utiliser du ruban adhésif transparent pour enlever toute la poussière du côté rayé des matrices. Gardez le côté rayé propre afin qu'il puisse adhérer fermement à la surface de la plaque.
- Placez délicatement les matrices sur des boîtes en plastique de 6 cm en appuyant avec un doigt (une matrice par plat, côté bande vers le bas). Évitez les bulles d'air entre la matrice et le plat. Marquer la position des bandes sur le côté inférieur de la boîte de culture.
- Si la matrice ne parvient pas à joindre, répéter de l'étape 1.2.
2. Stripe Generation et laminine revêtement pour Neuron Culture
- Préparer une protéine recombinante marquée par fluorescence (25 pi chacun pour injection [étape 2.2] ou 100 ul chacun pour le procédé de mise en place [étape 2.2.1]) en mélangeant la protéine Fc-étiquetée (10 à 50 ug / ml) et une dye- fluorescente un anticorps anti-Fc humain conjugué (1 à 3, le rapport: 30 à 150 pg / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS). Ensuite, laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante.
- En utilisant une seringue de 22 G, l' injection de 25 ul de la protéine recombinante préparée dans l'étape précédente (2,1) à travers le petit trou sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E).
- En variante, placer 100 pi de la protéine recombinante dans la fente supérieure de la matrice et aspirer environ la moitié de la solution du petit trou (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E), de sorte que la protéine recombinante reste dans les régions rayées.
- Incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.
- Placer 300 ul de PBS dans la fente supérieure (figure 1B) et aspirer du petit trou situé sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, C et E) pour éliminer les protéines recombinantes seules. Ne pas aspirer le PBS complètement, parce que les protéines vont sécher. Répéter deux fois cette étape. (3 fois au total)
- Retirez délicatement la matrice et placer immédiatement ~ 100 ul de protéine de contrôle (10-50 pg / ml; Fc) pour couvrir la zone rayée entier, créant un revêtement alternatif. Ensuite, laisser incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire.
- Après lavage de la surface de la boîte à trois reprises avec du PBS, enduire ~ 100 pi de 20 pg / ml de laminine dans du PBS.
Remarque: laminine doit être décongelé sur de la glace pour empêcher la solidification. - Laisser incuber le plat pendant 1 h à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire.
- Laver la surface de la boîte à trois reprises avec PBS et ajouter la culture medium. Placer le récipient revêtu de milieu de culture dans un incubateur à CO2 à 5% à 37 ° C jusqu'à utilisation.
3. La culture hippocampique Neurones de E15.5 embryons de souris
- Euthanasier mère par dislocation cervicale et d'isoler trois E15.5 embryons.
- Couper la peau et le crâne sagittale sur la ligne médiane de la tête avec des ciseaux, et retirer le cerveau à l'aide d'une petite cuillère. Transférer le cerveau soigneusement dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
- L' utilisation d' un scalpel, découper les hémisphères , y compris le cortex, l' hippocampe et le striatum (figure 2A). Puis, disséquer la région hippocampique en retirant soigneusement les méninges, et transférer les tissus hippocampiques disséqués à un tube centrifuge de 15 ml contenant 2 ml de solution HBSS, sur la glace (figure 2B-C). Collecter 6 hippocampes de 3 embryons dans le tube, qui sont suffisantes pour la culture de neurones dans 8 plats.
- Remplacer le Hla solution BSS avec une solution de trypsine / EDTA (2 ml) et on incube le tube à 37 ° C pendant 15 min dans un bain d'eau.
Remarque: Aspirer HBSS sans centrifugation et ne décante la solution HBSS en inclinant le tube. - Neutraliser l'activité de la trypsine en ajoutant 500 pi de sérum de fœtus bovin (FBS).
- Centrifuger le mélange à 100 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant et on lave le culot avec 2 ml de milieu de culture. Répétez cette étape une fois de plus.
- Pipet les hippocampes de haut en bas 10 fois dans un milieu de culture à l'aide d'une pointe de 1000 pi avec un grand trou (coupe-tip) de dissocier le tissu.
- Passez à une base régulière (uncut) pointe de 1000 pi et pipeter le tissu dissocié de haut en bas pour obtenir une suspension à cellule unique.
- Séparer les cellules individuelles en les faisant passer à travers un tamis à mailles cellule-80-100 pm.
- Centrifuger la suspension cellulaire unique filtré à 150 g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le pellet (neurones) dans 2 ml de milieu de culture.
- Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre avec une coloration au bleu trypan pour déterminer la densité et la viabilité. Ensuite, la plaque de 10.000 neurones dans 150 ul de milieu de culture pour chaque ensemble de stripes.The suspension doit être soigneusement placé pour couvrir la région de bande entière.
4. Visualisation des organes et des axones par immunofluorescence cellulaires en utilisant un anticorps anti-Tau1
- Après 24 h de culture, aspirer le milieu sans perturber les cellules adhérentes, et fixer les neurones avec pré-chauffé 4% de paraformaldehyde (PFA) / 4% de saccharose / PBS à température ambiante pendant 15 min.
- Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Si vous le souhaitez, utiliser un stylo hydrofuge pour dessiner un cercle autour de la région rayée pour diminuer la quantité d'anticorps nécessaire.
- Perméabiliser les neurones avec 0,3% de Triton X-100 / PBS pendant 5 min.
- Incuber les neurones avec une solution de blocage contenant 3% de sérum d'âne et 0,1% de Triton X-10030 min suivi d'une incubation avec un anticorps anti-Tau1 (1: 200) dans le sérum d'âne à 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N à 4 ° C.
- Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Incuber les neurones avec un anticorps IgG anti-souris conjugué à un fluorophore dans 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS pendant 30 min.
- Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Couvrir la région rayée avec un 18 mm verre de couverture x 18 mm en utilisant 50 pl de antifade solution. éviter les bulles d'air, qui interfèrent avec la formation d'image.
- Obtenir des images fluorescentes avec un microscope à fluorescence en utilisant le système approprié, par exemple, x10 objectif, jeux de filtres pour la GFP et RFP, et le temps d'exposition de 1000 msec (Figure 3).
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Representative Results
Neurones hippocampiques dissociées de souris E15.5 ont été étalées et cultivées pendant 24 h sur des bandes de contrôle marquées par fluorescence Fc (figure 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figure 3D-F) en alternance avec Fc non marqué contrôle. Dans les deux cas, les neurones ont été agrégées et ont étendu leurs axones sous forme de faisceaux. Sur le contrôle des bandes Fc / Fc, les neurones ont été distribués uniformément sur les bandes marquées par fluorescence et non étiquetés, et ils ont étendu leurs axones dans des directions aléatoires (figure 3A-C). En revanche, lorsqu'elle est cultivée sur des bandes FLRT-2k / Fc, les axones en croissance évitée sur les régions FLRT2-Fc. Ainsi, les axones étendant sont principalement situés sur le Fc témoin (figure 3D-F). Notamment, aussi bien les corps cellulaires et des axones ont été repoussés à partir de la FLRT2-Fc. Ainsi, les axones étendues dans une direction parallèle aux bandes figure 3D '.' - F '' montre que les axones ont augmenté le long dela frontière entre le Fc de contrôle et FLRT2-Fc, mais n'a pas étendu sur le territoire FLRT2.
Figure 1. Matrice de silicium utilisé pour créer le timbre de la protéine à rayures. (A, B) Vue de dessus de la matrice de silicium. La taille de la matrice est de 30 mm x 25 mm x 5 mm. flèche blanche dans A indique un petit trou où la protéine recombinante est injectée (étape 2.2). Arrowhead en B indique une fente où la protéine recombinante est alternativement appliquée (étape 2.2.1). (C, D) Vue de dessous de la matrice de silicium. La taille de la région à rayures est de 7 mm x 9 mm. La largeur de chaque bande est de 90 um. La flèche indique un petit canal à travers lequel la protéine recombinante est injectée. (E) Illustration schématique de la vue sagittale sur la ligne médiane de la matrice montrant la liaison entre le petit trou, les rayures, et la fente. La flèche indique la i trou njection. Les barres d'échelle sont de 500 um AC et 200 um D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Dissection de l' hippocampe de souris. (A) Vue du haut de la souris cerveau embryonnaire montrant la position de coupe (ligne pointillée) sur les hémisphères isolés , y compris l'hippocampe, le cortex et le striatum. (B, C) L'hippocampe isolée est recueillie dans HBSS après avoir enlevé les méninges. ( D) neurones sont cultivées sur les bandes dans un plat de 6 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. essais de rayure avec Fc de contrôle et FLRT2-Fc et une culture dissociée des neurones de l' hippocampe. Neurones hippocampiques dissociées de souris E15.5 ont été cultivées pendant 24 h sur des bandes de contrôle Fc (AC) ou FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D'-F', D '' - F '') images agrandies des régions encadrées dans (AC, DF, et D'-F '., respectivement) (A, A') Stripes généré en utilisant marqué par fluorescence Fc (gris) et Fc (noir) comme une expérience de contrôle. (D, D ', D' ') marqué par fluorescence des bandes FLRT2-Fc (gris) en alternance avec Fc (noir). (B, B', E , E ', E' ') anti-Tau1 anticorps coloration des corps cellulaires et des axones des neurones hippocampiques. (C, C', F, F ', F' ') , les images des rayures et anti-Tau1 coloration ont été fusionnés. Le neurons de corps et des axones cellulaires ont été fortement repoussés du FLRT2-Fc (F, F ', F' '). Notez que les axones tournent le long de la frontière et ne pénètrent pas dans le territoire FLRT2-Fc (pointes de flèches en F '') des barres .scale sont 100 um en C, C ', F, F' et 25 um F ''. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit un test de bande qui utilise une protéine recombinante et les neurones dissociés de l'hippocampe de souris E15.5. Ce dosage permet d'observer l'efficacité des réactions de répulsion, attirant ou neutre de neurones à une protéine recombinante d'intérêt placé dans un motif rayé. Un avantage majeur de ce protocole est le procédé simple pour produire des bandes, dans lequel la protéine est directement imprimée sur la surface d'une boîte en matière plastique, par rapport à la méthode traditionnelle, ce qui nécessite des matrices spéciales, un système à vide, et une membrane de nucléopore 20 21. Pour rendre les bandes de protéine, la protéine recombinante marquée peut être injecté à travers un petit trou ou un plus grand échantillon (~ 100 ul) peut être placé dans la fente au-dessus de la matrice, suivie de l'aspiration minutieuse de l'excès de tampon et les protéines non liées à travers le trou.
Un autre avantage de ce procédé est qu'un grand nombre de neurones peut être visualisé en tant queexpérience Ingle, et de nombreux cônes de croissance peuvent être analysés simultanément 21. En revanche, dans un essai tournant classique, un seul neurone et le cône de croissance unique est visualisée. La molécule FLRT2 répulsive est détectée par les neurones qui migrent loin de rayures FLRT2-Fc 21. Une molécule rapporteur comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou de la protéine fluorescente rouge (RFP) peut être exprimée dans les neurones de les visualiser sur la couleur du tapis et permettre l'observation en temps réel sans avoir besoin d'immunocoloration. Autres tags comme FLAG, Myc, et son peuvent être utilisés à la place de la balise Fc, et identifié avec l'anticorps approprié marqué par fluorescence anti-tag (étape 2.1). Certaines protéines hydrophobes élevées ne peuvent pas faire une bonne bande en raison de l'auto-agrégation. En outre, l'action relative de l' attraction et la répulsion entre les deux protéines cibles différentes peuvent être comparés en substituant une seconde protéine cible pour le Fc témoin bande 20.
Àaugmenter la viabilité des neurones, des ajustements dans le temps de la digestion enzymatique et l'inhibition de la trypsine peuvent être nécessaires. Si le taux de survie des neurones est faible, diluer la concentration de la trypsine ou de raccourcir le temps de digestion enzymatique. Le niveau de l'incubateur d'humidité doit être maintenue pour éviter une pression osmotique induite par l'évaporation dans le système complet pendant toute la période de culture.
L'adhérence de la matrice sur le plat est un facteur important pour la préparation de bonnes rayures. Une mauvaise adhésion aux résultats de surface plat dans un motif de bande désorganisée. Cependant, la densité de cellules et la concentration du substrat sont également essentiels pour une expérience réussie. Une concentration plus élevée en protéines dans la bande est recommandée pour l'analyse d'une molécule dont l'activité répulsive ou attractive est inconnue. Bien que nous avons démontré ce protocole en utilisant les neurones primaires dissociées, il est également applicable pour les cultures d' explants organotypiques 15.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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