Introduction
Guía de axones es el proceso mediante el cual las neuronas recién formadas envían axones a su objetivo durante el desarrollo del sistema nervioso 1,2. axones en desarrollo tienen una estructura muy móviles en la punta denominado el cono de crecimiento. El cono de crecimiento detecta señales extracelulares para navegar el camino del axón. Moléculas de guía, como hendidura, semaforina, y efrinas, pueden atraer o repeler los axones en función de su interacción con los receptores adecuados y co-receptores en el axón 1,3,4. Los receptores activados transferir señales al cono de crecimiento que afectan a su organización del citoesqueleto de los movimientos de los axones y el crecimiento de cono.
Varios métodos han sido desarrollados para evaluar la acción de las moléculas de atrayentes y repelentes. Quimio-atrayentes y repelentes se pueden administrar en el medio de crecimiento / cultivo con una concentración de gradiente (por ejemplo., La cámara de Dunn o Mu diapositivas) 5,6, en un lugar muy concentrada por micro-pipette (por ejemplo., ensayo de torneado) 7 o a una concentración homogénea mediante la aplicación de baño (por ejemplo., el ensayo de colapso del cono de crecimiento) 8,9.
Otros métodos incluyen un ensayo de raya o impresión por microcontacto (μCP), en la que se recubre una quimio-atrayente o repelente en la superficie de una placa como sustrato 10-12. Thestripe ensayo fue desarrollado originalmente por Bonhoeffer y sus colegas en 1987 para analizar la cartografía topográfica en el sistema retino-chick tectal 13. El método original requiere un sistema de vacío para proteínas de la cubierta en las membranas de policarbonato Nucleopore utilizando matrices de rayas y malladas. En versiones posteriores, las proteínas recombinantes fueron impresos directamente sobre la superficie de una placa de cultivo en un patrón de rayas utilizando matrices de silicio estrecha rendija 14,15. Recientemente, varios grupos de investigación han aplicado con éxito este ensayo de franja en el análisis de las actividades de moléculas de orientación axón 16-21.
21 alterna. Después de 24 h de cultivo, tanto los axones y cuerpos celulares de las neuronas estaban fuertemente repelidos de las rayas FLRT2. La tinción con un anticuerpo anti-TAU1 reveló que ~ 90% de las neuronas se distribuyeron en las regiones Fc recubierto, en comparación con ~ 10% en el FLRT2-Fc, lo que indica que FLRT2 tiene una fuerte repulsiónfunción de las neuronas del hipocampo 21.
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Protocol
Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu.
1. Preparación de Matrices
- Hervir 4-8 matrices de silicona en el microondas o en una placa caliente durante 5 minutos y dejar que se sequen por completo durante 1 hora bajo flujo laminar (lado rayado).
Nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse bajo flujo laminar. - Golpe de aire comprimido o utilizar cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo de la parte rayada de las matrices. Mantenga el lado rayado limpia para que pueda adherirse firmemente a la superficie de la placa.
- Con cuidado, coloque las matrices en placas de plástico de 6 cm presionando con un dedo (una matriz por plato, con el lado de la raya hacia abajo). Evite que las burbujas de aire entre la matriz y el plato. Marque la ubicación de las rayas en el lado inferior de la placa de cultivo.
- Si la matriz no se acopla, repita desde el paso 1.2.
2. Generación de la raya y laminina Revestimiento de Neurona Cultura
- Preparar proteína recombinante marcada con fluorescencia (25 l cada uno por inyección [etapa 2.2] o 100 l cada uno para el método de colocación [etapa 2.2.1]) mediante la mezcla de la proteína Fc de etiquetado (10 a 50 mg / ml) y una de tinte fluorescente anticuerpo conjugado anti-Fc humano (1-3 ratio: 30-150 mg / ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se incuba la mezcla durante 30 min a TA.
- Usando una jeringa de 22-G, inyectar 25 l de la proteína recombinante preparado en la etapa anterior (2,1) a través del pequeño orificio en el lado de la matriz (las flechas en la Figura 1A, 1C y 1E).
- Alternativamente, colocar 100 l de la proteína recombinante en la ranura superior de la matriz y el aspirado aproximadamente la mitad de la solución desde el pequeño agujero (flechas en la Figura 1A, 1C y 1E), de modo que la proteína recombinante permanece en las regiones rayadas.
- Incubar la placa durante 30 millasn a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.
- Coloque 300 l de PBS en la ranura superior (Figura 1B) y aspirado desde el pequeño orificio situado en el lado de la matriz (flechas en la Figura 1A, C y E) para eliminar las proteínas no unidas recombinantes. No aspirar el PBS por completo, debido a que las proteínas se secarán. Repita este paso dos veces. (3 veces en total)
- Retire cuidadosamente la matriz e inmediatamente colocar ~ 100 l de proteína de control (10 a 50 g / ml; Fc) para cubrir toda el área de rayas, la creación de un revestimiento alternativo. A continuación, se incuba la placa durante 30 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular.
- Después de lavar la superficie del plato tres veces con PBS, capa con ~ 100 l de 20 mg / ml de laminina en PBS.
Nota: La laminina se debe descongelar en hielo para evitar la solidificación. - Incubar la placa durante 1 h a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular.
- Lavar la superficie del plato tres veces con PBS y añadir la cultura medium. Coloque el plato cubierto con medio de cultivo en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C hasta su uso.
3. El cultivo de las neuronas del hipocampo E15.5 embriones de ratón
- La eutanasia madre a través de la dislocación cervical y aislar tres embriones E15.5.
- Cortar la piel y el cráneo sagital en la línea media de la cabeza con unas tijeras, y retirar el cerebro usando una cuchara pequeña. Transferir el cerebro cuidadosamente a una placa de Petri de 60 mm que contiene 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS).
- El uso de un bisturí, cortar los hemisferios incluyendo la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado (Figura 2A). Entonces, diseccionar la región del hipocampo eliminando cuidadosamente las meninges, y transferir los tejidos de hipocampo disecados a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2 ml de solución de HBSS, en el hielo (Figura 2B-C). Recoger 6 hipocampos a partir de 3 embriones en el tubo, que son suficientes para el cultivo de las neuronas en 8 platos.
- Reemplazar el Hsolución BSS con solución de tripsina / EDTA (2 ml) y se incuba el tubo a 37 ° C durante 15 min en un baño de agua.
Nota: Aspirar HBSS sin centrifugación y no decantar la solución de HBSS por la inclinación del tubo. - Neutralizar la actividad de la tripsina mediante la adición de 500 l de suero bovino fetal (FBS).
- Centrifugar la mezcla a 100 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con 2 ml de medio de cultivo. Repita este paso una vez más.
- Pipetear los hipocampos arriba y hacia abajo 10 veces en medio de cultivo utilizando una punta de 1.000 l con un agujero grande (cut-punta) para disociar el tejido.
- Cambiar a una (sin cortar) de la punta de 1.000 l regular y pipetear el tejido disociado arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de una sola célula.
- Se separan las células individuales pasándolos a través de un filtro de células de malla de 80 a 100-m.
- Centrifugar la suspensión de células individuales filtrada a 150 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet (neuronas) en 2 ml de medio de cultivo.
- Contar las células usando un hemocitómetro con tinción con azul de tripano para determinar la densidad y viabilidad. A continuación, la placa de 10.000 neuronas en 150 ml de medio de cultivo para cada conjunto de suspensión stripes.The debe ser cuidadosamente colocada para cubrir toda la región de la raya.
4. Visualización de los cuerpos celulares y axones por la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-TAU1
- Después de 24 h de cultivo, aspirar el medio sin perturbar las células adherentes, y fijar las neuronas con pre-calentado paraformaldehído al 4% (PFA) / 4% de sacarosa / PBS a temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Si lo desea, utilice un bolígrafo de repelente al agua para dibujar un círculo alrededor de la región rayada para disminuir la cantidad de anticuerpo necesaria.
- Permeabilizar las neuronas con 0,3% Triton X-100 / PBS durante 5 min.
- Incubar las neuronas con solución de bloqueo que contiene 3% de suero de burro y 0,1% de Triton X-100 para30 min seguido de incubación con un anticuerpo anti-TAU1 (1: 200) en suero de burro 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C.
- Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Incubar las neuronas con un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con fluoróforo en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS durante 30 min.
- Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Cubrir la región rayada con una cubierta de vidrio de 18 mm x 18 mm con 50 l de solución antifade. evitar las burbujas de aire, que interfieren con la formación de imágenes.
- Obtener imágenes fluorescentes con un microscopio de fluorescencia utilizando el sistema apropiado, por ejemplo, la lente objetivo x10, conjuntos de filtros para GFP y RFP, y tiempo de exposición de 1.000 mseg (Figura 3).
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Representative Results
Las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se sembraron y cultivaron durante 24 h en rayas de la etiqueta fluorescente de control de Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando con Fc no marcado control. En ambos casos, las neuronas eran agregados y extendieron sus axones como paquetes. En el mando a rayas Fc / Fc, las neuronas se distribuyeron de manera uniforme en las rayas marcados con fluorescencia y no marcados, y se extendieron sus axones en direcciones al azar (Figura 3A-C). Por el contrario, cuando se cultivan en rayas FLRT-2FC / Fc, los axones evitarse que crece en las regiones FLRT2-Fc. Por lo tanto, los axones que se extienden se encuentran principalmente en el Fc de control (Figura 3D-F). Cabe destacar que tanto los cuerpos celulares y axones fueron repelidas de la FLRT2-Fc. Por lo tanto, los axones extendidos en una dirección paralela a las franjas Figura 3D '.' - F '' muestra que los axones crecieron a lo largola frontera entre Fc control y FLRT2-Fc pero no se extendió al territorio FLRT2.
Figura 1. Silicio matriz utilizada para crear el sello de la proteína de rayas. (A, B) Vista superior de la matriz de silicio. El tamaño de la matriz es de 30 mm x 25 mm x 5 mm. Una flecha blanca indica en un pequeño agujero en el que se inyecta la proteína recombinante (paso 2.2). Punta de flecha en B indica una ranura donde se aplica como alternativa la proteína recombinante (paso 2.2.1). (C, D) Vista inferior de la matriz de silicio. El tamaño de la región rayada es de 7 mm x 9 mm. La anchura de cada banda es 90 micras. La flecha indica un pequeño canal a través del cual se inyecta la proteína recombinante. (E) Ilustración esquemática de la vista sagital en la línea media de la matriz que muestra la conexión entre el agujero pequeño, las rayas, y la hendidura. La flecha indica la i njection agujero. Las barras de escala son 500 micras de CA y 200 micras de D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Disección del hipocampo del ratón. (A) Vista superior del ratón embrionario del cerebro que muestra la posición de corte (línea discontinua) en los hemisferios aislados que incluyen el hipocampo, la corteza y el cuerpo estriado. (B, C) El hipocampo aisladas se recoge en HBSS después de la eliminación de las meninges. ( D) las neuronas son cultivadas en las bandas de un recipiente de 6 cm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Los ensayos de bandas con Fc control y FLRT2-Fc y una cultura disociada de las neuronas del hipocampo. Neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se cultivaron durante 24 h en rayas de control de Fc (CA) o FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D-M', D '' - F '') de imágenes ampliadas de las regiones encuadradas en (AC, DF, y D'-F '., respectivamente) (A, A') genera rayas utilizando la etiqueta fluorescente Fc (gris) y Fc (negro) como un experimento de control. (D, D ', D' ') marcadas fluorescentemente rayas FLRT2-Fc (gris) alternando con Fc (negro). (B, B', e , e ', e' ') tinción de anticuerpos anti-TAU1 de los cuerpos celulares y axones de las neuronas del hipocampo. (C, C', F, F ', F' ') las imágenes de las rayas y los anti-TAU1 tinción se fusionaron. el neurons 'cuerpos y axones de las células estaban fuertemente repelidos desde el FLRT2-Fc (F, F', F ''). Tenga en cuenta que los axones se convierten a lo largo de la frontera y no entran en el territorio FLRT2-Fc (puntas de flecha en F '') .Scale bares son 100 micras en C, C ', F, F' y 25 micras de F ''. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un ensayo de banda que utiliza la proteína recombinante y neuronas disociadas del hipocampo de ratones E15.5. Este ensayo permite la observación eficiente de respuestas de repulsión, atractivo, o neutrales de las neuronas a una proteína recombinante de interés colocado en un patrón de rayas. Una ventaja principal de este protocolo es el método simple para la generación de las rayas, en la que la proteína se imprime directamente sobre la superficie de un plato de plástico, en comparación con el método tradicional, que requiere matrices especiales, un sistema de vacío, y una membrana Nucleopore 20 , 21. Para hacer las rayas de la proteína, la proteína recombinante marcado se puede inyectar a través de un pequeño agujero, o una muestra más grande (~ 100 l) se puede colocar en la ranura en la parte superior de la matriz, seguido de la aspiración cuidadosa del exceso de tampón y las proteínas no unidas a través del agujero.
Otra ventaja de este método es que un gran número de neuronas puede ser visualizado en comoexperimento de la ingle, y muchos conos de crecimiento se pueden analizar simultáneamente 21. Por el contrario, en un ensayo de torneado convencional, sólo una única neurona y cono de crecimiento solo se visualiza. La repulsiva FLRT2 molécula es detectado por las neuronas que migran lejos de rayas FLRT2-Fc 21. Una molécula indicadora como la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína fluorescente roja (RFP) se puede expresar en las neuronas de visualizar contra el color de la alfombra y permitir la observación en tiempo real sin necesidad de inmunotinción. Otras etiquetas como FLAG, Myc, y Su se pueden utilizar en lugar de la etiqueta Fc, e identificados con el anticuerpo anti-etiqueta marcada con fluorescencia apropiado (paso 2.1). Algunas proteínas hidrofóbicas altos no pueden hacer la raya adecuada debido a la auto-agregación. Además, la acción relativa de atracción y repulsión entre dos proteínas diana diferentes se puede comparar mediante la sustitución de una segunda proteína diana para el control Fc raya 20.
Aaumentar la viabilidad de las neuronas, pueden ser necesarios ajustes en el tiempo de digestión enzimática y la inhibición de la tripsina. Si la relación de supervivencia de las neuronas es baja, diluir la concentración de tripsina o acortar el tiempo de digestión enzimática. El nivel de humedad de la incubadora se debe mantener para evitar la presión osmótica evaporación inducida en el sistema completo durante todo el período de cultivo.
La adhesión de la matriz a la placa es un factor importante para la preparación de buenas rayas. la adherencia inadecuada a los resultados superficie del plato en un patrón de rayas desorganizado. Sin embargo, la densidad de células y la concentración de sustrato también son críticos para un experimento exitoso. Una concentración de proteína más alto en la franja se recomienda para el análisis de una molécula cuya actividad repulsiva o atractiva es desconocido. Aunque hemos demostrado este protocolo usando neuronas primarias disociadas, sino que también es aplicable para los cultivos de explantes organotípicos 15.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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