Introduction
Guida Axon è il processo attraverso il quale i neuroni appena formati inviano assoni al loro obiettivo durante lo sviluppo del sistema nervoso 1,2. assoni in via di sviluppo portano una struttura altamente mobili al loro punta chiamato il cono di crescita. Il cono di crescita rileva segnali extracellulari per navigare il percorso del assone. Molecole di guida, come ad esempio a fessura, semaphorin, e efrine, possono attrarre o respingere gli assoni a seconda della loro interazione con i recettori idonei e co-recettori presenti sulla assone 1,3,4. I recettori attivati trasferire segnali al cono di crescita che riguardano l'organizzazione del citoscheletro per i movimenti degli assoni e la crescita-cono.
Vari metodi sono stati sviluppati per valutare l'azione di molecole attrattivi e repellenti. Chemio-attrattivi e repellenti possono essere somministrati nel mezzo di crescita / cultura con un gradiente di concentrazione (ad es., Camera di Dunn o μ-slides) 5,6, in una zona ad alta concentrazione da micro-pipette (ad es., test di tornitura) 7 o ad una concentrazione omogenea applicazione da bagno (ad es., test di caduta cono di crescita) 8,9.
Altri metodi includono un saggio banda o stampa microcontact (μCP), in cui un chemio-attrattivo o repellente è rivestito sulla superficie di una piastra come substrato 10-12. Thestripe saggio è stato originariamente sviluppato da Bonhoeffer e colleghi nel 1987 per analizzare la mappatura topografica del pulcino sistema di retino-tectal 13. Il metodo originale ha richiesto un sistema di vuoto a proteine di rivestimento su membrane Nucleopore policarbonato utilizzando righe e matrici maglie. Nelle versioni successive, le proteine ricombinanti sono stati stampati direttamente sulla superficie di una piastra di coltura in un modello a strisce utilizzando matrici di silicio stretta fessura 14,15. Recentemente, diversi gruppi di ricerca hanno applicato con successo questo test striscia per l'analisi delle attività di orientamento degli assoni molecola 16-21.
21 alternata. Dopo 24 ore di cultura, sia gli assoni e corpi cellulari dei neuroni sono stati fortemente respinti dalle strisce FLRT2. Colorazione con un anticorpo anti-Tau1 rivelato che ~ 90% dei neuroni sono stati distribuiti sulle regioni Fc rivestite, rispetto a ~ 10% sul FLRT2-Fc, indicando che FLRT2 ha una forte repulsivaFunzione per i neuroni dell'ippocampo 21.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso Hamamatsu University School of Medicine.
1. Preparazione di matrici
- Far bollire 4-8 matrici di silicone in un forno a microonde o su un piatto caldo per 5 minuti e permettere loro di asciugare completamente per 1 ora sotto flusso laminare (lato a strisce in alto).
Nota: Le seguenti procedure devono essere eseguite in condizioni di flusso laminare. - Soffiare aria compressa o usare nastro adesivo trasparente per rimuovere la polvere dal lato righe delle matrici. Mantenere il lato strisce pulito in modo che possa aderire saldamente alla superficie della piastra.
- Posizionare con cura le matrici sulle stoviglie di plastica 6 cm premendo con un dito (una matrice per ogni piatto; lato striscia verso il basso). Evitare che le bolle d'aria tra la matrice e il piatto. Segnare la posizione delle strisce sul lato inferiore del piatto cultura.
- Se la matrice non riesce a collegare, ripetere dal punto 1.2.
2. Stripe Generazione e laminina Coating per la Cultura Neuron
- Preparare fluorescente proteina ricombinante (25 ml ciascuno per iniezione [passo 2.2] o 100 ml ciascuno per il metodo di posizionamento [punto 2.2.1]) mescolando la proteina Fc-tag (10-50 mg / ml) e un dye fluorescente anticorpo coniugato anti-umano Fc (da 1 a 3 rapporto: 30-150 mcg / ml) in tampone fosfato (PBS). Poi, incubare la miscela per 30 minuti a RT.
- Utilizzando una siringa 22-G, iniettare 25 ml di proteina ricombinante preparato nel passaggio precedente (2.1) attraverso il piccolo foro sul lato della matrice (frecce in figura 1A, 1C e 1E).
- In alternativa, posizionare 100 microlitri della proteina ricombinante nella fessura superiore della matrice e aspirare circa metà della soluzione dal piccolo foro (frecce in figura 1A, 1C e 1E), in modo che la proteina ricombinante rimane nelle regioni strisce.
- Incubare il piatto per 30 min a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
- Mettere 300 ml di PBS nella feritoia superiore (Figura 1B) e aspirare dal piccolo foro situato sul lato della matrice (frecce in figura 1A, C ed E) per rimuovere le proteine ricombinanti separati. Non aspirare il PBS completamente, perché le proteine si asciugheranno. Ripetere questa operazione due volte. (3 volte totale)
- Rimuovere con attenzione la matrice e collocare immediatamente ~ 100 ml di proteina di controllo (10-50 mg / ml; Fc) per coprire l'intera area a righe, creando un rivestimento alternativo. Poi, incubare il piatto per 30 minuti a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare.
- Dopo aver lavato la superficie piatto tre volte con PBS, cappotto con ~ 100 ml di 20 mg / ml in PBS laminina.
Nota: laminina devono essere scongelati in ghiaccio per evitare la solidificazione. - Incubare il piatto per 1 ha 37 ° C in incubatore di coltura cellulare.
- Lavare la superficie piatto tre volte con PBS e aggiungere la cultura medium. Porre la capsula rivestita con mezzo di coltura in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C fino al momento dell'uso.
3. Coltura neuroni dell'ippocampo da E15.5 embrioni di topo
- Euthanize madre tramite dislocazione cervicale e isolare tre E15.5 embrioni.
- Tagliare la pelle e il cranio sagittalmente sulla linea mediana della testa con le forbici, e rimuovere il cervello utilizzando un cucchiaino. Trasferire il cervello attenzione ad un 60 mm Petri contenente 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
- Usando un bisturi, tagliare gli emisferi, tra cui corteccia, ippocampo e striato (Figura 2A). Poi, sezionare la regione dell'ippocampo rimuovendo accuratamente le meningi, e trasferire i tessuti ippocampali sezionato in un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 2 ml di soluzione HBSS, su ghiaccio (Figura 2B-C). Raccogliere 6 ippocampi da 3 embrioni nel tubo, che sono sufficienti per la coltura di neuroni in 8 piatti.
- Sostituire la Hsoluzione BSS con soluzione di tripsina / EDTA (2 ml) e incubare il tubo a 37 ° C per 15 minuti in un bagno d'acqua.
Nota: Aspirare HBSS senza centrifugazione e non decantare la soluzione HBSS inclinando il tubo. - Neutralizzare l'attività tripsina aggiungendo 500 ml di siero bovino fetale (FBS).
- Centrifugare la miscela a 100 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 2 ml di mezzo di coltura. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Preparare la ippocampi su e giù per 10 volte in terreno di coltura con una punta di 1.000 ml, con un grande foro (cut-punta) per dissociare il tessuto.
- Passare a un normale (non tagliato) punta da 1.000 ml e seminare il dissociato tessuto su e giù per ottenere una cella singola sospensione.
- Separare le singole cellule facendoli passare attraverso un colino cella di rete 80-100 micron.
- Centrifugare la sospensione cellulare singola filtrata a 150 xg per 5 min.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il Pellet (neuroni) in 2 ml di mezzo di coltura.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro con trypan colorazione blu per determinare la densità e la vitalità. Poi, piastra 10.000 neuroni in 150 ml di terreno di coltura per ogni insieme di sospensione stripes.The deve essere posizionato con attenzione per coprire l'intera regione della banda.
4. Visualizzazione di corpi cellulari e degli assoni mediante immunofluorescenza colorazione con un anticorpo anti-Tau1
- Dopo 24 h di coltura, aspirare il terreno senza disturbare le cellule aderenti, e fissare i neuroni con pre-riscaldato paraformaldeide 4% (PFA) / 4% di saccarosio / PBS a temperatura ambiente per 15 min.
- Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Se lo si desidera, utilizzare una penna idrorepellente per disegnare un cerchio intorno alla regione strisce per diminuire la quantità di anticorpo necessaria.
- Permeabilize i neuroni con 0.3% Triton X-100 / PBS per 5 min.
- Incubare le neuroni con soluzione bloccante contenente 3% di siero asino e 0,1% Triton X-100 per30 min seguita da incubazione con un anticorpo anti-Tau1 (1: 200) in 1% di siero asino / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C.
- Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Incubare i neuroni con un anticorpo anti-topo IgG fluoroforo coniugato in 1% di siero albumina bovina (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS per 30 min.
- Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Coprire la regione a righe con una x 18 mm vetro di copertura 18 millimetri con 50 ml di soluzione antifade. evitare bolle d'aria, che interferiscono con l'imaging.
- Ottenere immagini fluorescenti con un microscopio a fluorescenza utilizzando il sistema appropriato, ad esempio, x10 lente obiettivo, set di filtri per GFP e RFP, e tempo di esposizione 1.000 msec (Figura 3).
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Representative Results
Dissociati neuroni dell'ippocampo di topi E15.5 sono stati placcati e coltivate per 24 h su strisce di fluorescente controllo Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) in alternanza con Fc non etichettati controllo. In entrambi i casi, i neuroni sono stati aggregati e esteso le loro assoni come fasci. Sul controllo strisce Fc / Fc, i neuroni sono stati distribuiti in modo uniforme sulle strisce fluorescente e non etichettati, e hanno esteso i loro assoni in direzioni casuali (figura 3A-C). Al contrario, quando coltivati su strisce FLRT-2FC / Fc, gli assoni evitato che cresce sulle regioni FLRT2-Fc. Così, gli assoni si estendono erano situati principalmente sul Fc di controllo (Figura 3D-F). In particolare, entrambi i corpi cellulari e gli assoni sono stati respinti dal FLRT2-Fc. Così, gli assoni estesi in una direzione parallela alle strisce Figura 3D '.' - F '' mostra che gli assoni cresciuti insiemeil confine tra Fc controllo e FLRT2-Fc, ma non si estendeva nel territorio FLRT2.
Figura 1. Silicon Matrix utilizzato per creare il timbro proteina strisce. (A, B) Vista superiore della matrice di silicio. La dimensione della matrice è di 30 mm x 25 mm x 5 mm. freccia bianca in A indica un piccolo foro in cui viene iniettata la proteina ricombinante (passo 2.2). Arrowhead in B indica una fessura dove la proteina ricombinante viene applicata alternativamente (fase 2.2.1). (C, D) Vista inferiore della matrice di silicio. La dimensione della regione strisce è di 7 mm x 9 mm. La larghezza di ciascuna striscia è di 90 micron. La freccia indica un piccolo canale attraverso il quale viene iniettata la proteina ricombinante. (E) Schema Illustrazione della sagittale sulla linea mediana della matrice che mostra il collegamento tra il piccolo foro, le strisce, e la fessura. La freccia indica l'i buco njection. Barre di scala sono 500 micron di AC e 200 micron di D. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La dissezione dell'ippocampo di topo. (A) vista dall'alto di cervello di topo embrionale mostra la posizione di taglio (linea tratteggiata) sulle emisferi isolati tra cui l'ippocampo, la corteccia e lo striato. (B, C) L'ippocampo isolato viene raccolto in HBSS dopo aver rimosso le meningi. ( D) i neuroni sono coltivate sulle strisce in un piatto di 6 cm. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. saggi striscia con Fc controllo e FLRT2-Fc e una cultura dissociata di neuroni dell'ippocampo. Neuroni dell'ippocampo dissociato da topi E15.5 sono state coltivate per 24 ore su strisce di Fc di controllo (AC) o FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D'-F', D '' - F '') le immagini ingrandite delle regioni in scatola di (AC, DF, e D'-F '., rispettivamente) (a, a') Stripes generato utilizzando fluorescente Fc (grigio) e Fc (nero) come un esperimento di controllo. (D, D ', D' ') fluorescente strisce FLRT2-Fc (grigio) alternati a Fc (nero). (B, B', e , e ', e' ') Anti-Tau1 anticorpi colorazione dei corpi cellulari e gli assoni dei neuroni dell'ippocampo. (C, C', F, F ', F' ') le immagini delle strisce e l'anti Tau1-colorazione sono state fuse. il neurons 'corpi cellulari e gli assoni sono stati respinti con forza dalla FLRT2-Fc (F, F', F ''). Si noti che gli assoni girare lungo il confine e non entrano nel territorio FLRT2-Fc (punte di freccia in F '') .Scale bar sono 100 micron di C, C ', F, F' e 25 micron di F ''. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un test che utilizza la banda proteina ricombinante e neuroni dissociato dal ippocampo E15.5 mouse. Questo test permette l'osservazione efficiente delle risposte repulsive, attraenti, o neutri di neuroni ad una proteina ricombinante di interesse collocato in un motivo a righe. Un importante vantaggio di questo protocollo è il metodo semplice per generare le strisce, in cui la proteina è stampato direttamente sulla superficie di un piatto di plastica, rispetto al metodo tradizionale che richiede matrici speciali, un sistema di aspirazione, ed una membrana nucleopore 20 , 21. Per rendere le strisce proteina, la proteina ricombinante marcata può essere iniettato attraverso un piccolo foro, o un campione più ampio (~ 100 microlitri) può essere posizionato nella fessura sulla parte superiore della matrice, seguita dalla accurata aspirazione di tampone in eccesso e proteine non legate attraverso il foro.
Un altro vantaggio di questo metodo è che un gran numero di neuroni può essere visualizzato comeesperimento ingle, e molti coni di crescita possono essere analizzati simultaneamente 21. Al contrario, in un saggio di svolta convenzionale, solo un singolo neurone e cono di crescita singolo viene visualizzato. La molecola di FLRT2 ripugnante è percepita dai neuroni, che migrano da FLRT2-Fc strisce 21. Una molecola reporter di come la proteina fluorescente verde (GFP) o la proteina fluorescente rossa (RFP) può essere espressa nei neuroni visualizzarli contro il colore del tappeto e consentire l'osservazione in tempo reale senza la necessità di immunocolorazione. Altri tag come FLAG, Myc, e la sua può essere usato al posto del tag Fc, e identificato con l'anticorpo anti-tag fluorescente appropriato (passo 2,1). Alcune proteine idrofobiche elevati non possono fare una corretta striscia a causa di auto-aggregazione. Inoltre, l'azione relativa di attrazione e repulsione tra due diverse proteine bersaglio può essere paragonata sostituendo una seconda proteina bersaglio per il controllo Fc striscia di 20.
Aaumentare la vitalità dei neuroni, possono essere necessari aggiustamenti nel tempo di digestione enzimatica e l'inibizione tripsina. Se il rapporto di sopravvivenza dei neuroni è basso, diluire la concentrazione di tripsina o accorciare il tempo di digestione enzimatica. Il livello di umidità dell'incubatrice dovrebbe essere mantenuto per evitare l'evaporazione indotta pressione osmotica nel sistema completo tutto il periodo di coltura.
L'adesione della matrice al piatto è un fattore importante per la preparazione di buoni strisce. aderenza improprio ai risultati di superficie piatto in un motivo a strisce disorganizzato. Tuttavia, la densità delle cellule e la concentrazione di substrato sono anche critica per un esperimento riuscito. Una concentrazione proteico superiore nella striscia è raccomandato per analizzare una molecola la cui attività repellenti o attraenti è sconosciuto. Anche se abbiamo dimostrato questo protocollo utilizzando neuroni primari dissociate, è applicabile anche per le culture espianto organotipiche 15.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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