Introduction
Axon begeleiding is het proces waarbij nieuw gevormde neuronen sturen hun axonen Tijdens het ontwikkelen van het zenuwstelsel 1,2. Het ontwikkelen van axonen dragen een zeer beweeglijke structuur op hun tip genaamd de groei kegel. De groei kegel zintuigen extracellulaire signalen naar het pad van de axon te navigeren. Navigatie moleculen, zoals spleet semaphorines en ephrines kunnen aantrekken of afstoten axons afhankelijk van hun wisselwerking met geschikte receptoren en co-receptoren op het axon 1,3,4. De geactiveerde receptoren dragen signalen naar de groeikegel dat de organisatie van het cytoskelet en van axon groei-cone bewegingen beïnvloeden.
Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om de werking van aantrekkende en afstotende moleculen evalueren. Chemo-aantrekkende en insectenwerende middelen kunnen worden toegediend in de groei / cultuurmedium met een gradiënt concentratie (bv., Dunn's kamer of μ-dia) 5,6, in een zeer geconcentreerde spot door micro-pipette (bijv., draaien bepaling) 7 of op een homogene concentratie bad toepassing (bv., groeikegel ineenstorting test) 8,9.
Andere werkwijzen omvatten een streep assay of microcontactprinten (μCP), waarin een chemo-aantrekkende of afstotende wordt gecoat op het oppervlak van een plaat als substraat 10-12. Thestripe test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Bonhoeffer en collega's in 1987 tot topografische kaart brengen in het kuiken retino-tectal systeem 13 te analyseren. De oorspronkelijke methode vereist een vacuüm systeem om manteleiwitten op polycarbonaat nucleopore membranen met behulp van gestreepte en fijnmazige matrices. In latere versies werden de recombinante eiwitten direct gedrukt op het oppervlak van een kweekplaat in een gestreept patroon via smalle spleet silicium matrices 14,15. Onlangs hebben verschillende onderzoeksgroepen succes toegepast deze streep test om de analyse van axon begeleiding moleculen activiteiten 16-21.
21. Na 24 uur kweken werden zowel de axonen en cellichamen van de neuronen sterk afgestoten van de FLRT2 strepen. Kleuring met anti-Tau1 antilichaam bleek dat ~ 90% van de neuronen werden verspreid op-Fc beklede gebieden, tegenover ~ 10% op de FLRT2-Fc, wat aangeeft dat FLRT2 een sterke afstotendefunctie hippocampale neuronen 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd Hamamatsu University School of Medicine.
1. Bereiding van Matrices
- Kook 4-8 silicone matrices in de magnetron of op een hete plaat gedurende 5 minuten en laat ze goed drogen gedurende 1 uur onder laminaire stroming (gestreept kant naar boven).
Opmerking: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming. - Blaas perslucht of gebruik plakband om stof uit de gestreepte kant van de matrices te verwijderen. Houd de gestreepte kant schoon, dus het kan vast houden aan het plaatoppervlak.
- Plaats voorzichtig de matrices op 6-cm plastic schaaltjes door te drukken met een vinger (één matrix per gerecht; streep naar beneden). Zorg dat er geen luchtbellen tussen de matrix en het gerecht. Markeer de locatie van de strepen aan de onderzijde van de kweekschaal.
- Als de matrix niet te bevestigen, herhaal stap 1.2.
2. Stripe Generation en Laminin Coating voor Neuron Cultuur
- Bereid fluorescent gelabeld recombinant eiwit (25 pl elk voor injectie [stap 2,2] of 100 pl elk voor de plaatsingsmethode [stap 2.2.1]) door mengen van het Fc-gemerkt eiwit (10-50 ug / ml) en een fluorescente kleurstof- geconjugeerd anti-humaan Fc antilichaam (1-3 ratio: 30-150 gg / ml) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vervolgens incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van een 22-G spuit injecteren 25 ul van het recombinante eiwit bereid in de vorige stap (2,1) door de kleine opening aan de zijde van de matrix (pijl in figuur 1A, 1C en 1E).
- Of hang 100 gl van het recombinante eiwit in de bovenste gleuf van de matrix en zuig ongeveer de helft van de oplossing uit het kleine gat (pijlen in Figuur 1A, 1C en 1E), zodat het recombinante eiwit blijft de gestreepte gebieden.
- Incubeer de schotel voor 30 min bij 37 ° C in een celkweek incubator.
- Plaats 300 pl PBS in de bovenste gleuf (Figuur 1B) en zuig de kleine opening aan de zijkant van de matrix (pijl in figuur 1 A, C en E) voor losse recombinante eiwitten te verwijderen. Laat de PBS niet volledig te zuigen, omdat de eiwitten zal drogen. Herhaal deze stap twee keer. (3 keer in totaal)
- Verwijder voorzichtig de matrix en onmiddellijk plaats ~ 100 ul van controle-eiwit (10-50 ug / ml; Fc) om de hele gestreepte gebied bestrijken, het creëren van een alternatieve coating. Vervolgens incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de celkweek incubator.
- Na wassen van de schaaloppervlak driemaal met PBS, laag met ~ 100 ul van 20 ug / ml laminine in PBS.
Opmerking: laminine moet worden op ijs ontdooid om stolling te voorkomen. - Incubeer de schotel voor 1 uur bij 37 ° C in de celkweek incubator.
- Was de schaal oppervlak drie keer met PBS en voeg cultuur medium. Plaats de gecoate schaal kweekmedium in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C tot gebruik.
3. Het kweken hippocampus neuronen van E15.5 muizenembryo's
- Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie en te isoleren drie E15.5 embryo's.
- Snijd de huid en de schedel sagittally op de middellijn van het hoofd met een schaar en verwijder de hersenen met behulp van een kleine lepel. Breng de hersenen voorzichtig een 60 mm petrischaal met 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Met behulp van een scalpel, knip de hemisferen waaronder cortex, hippocampus en striatum (Figuur 2A). Vervolgens ontleden de hippocampusgebied door voorzichtig verwijderen van de hersenvliezen, en breng de ontleed hippocampale weefsels in een 15 ml centrifugebuis met 2 ml HBSS oplossing, op ijs (figuur 2B-C). Verzamel 6 hippocampus van 3 embryo in de buis, die voldoende is voor het kweken van neuronen in 8 gerechten.
- Vervang de HBSS oplossing met trypsine / EDTA-oplossing (2 ml) en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 15 min in een waterbad.
Opmerking: Zuig HBSS zonder centrifugeren en niet de HBSS oplossing decanteren door het kantelen van de buis. - Neutraliseer de trypsine activiteit door toevoeging van 500 ul foetaal runderserum (FBS).
- Centrifugeer het mengsel bij 100 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en was de pellet met 2 ml kweekmedium. Herhaal deze stap nog een keer.
- Pipet de hippocampus op en neer 10 keer in kweekmedium met behulp van een 1000-ul tip met een groot gat (cut-tip) om het weefsel te scheiden.
- Ga verder met een gewone (ongesneden) 1000-ul tip en pipet het gedissocieerde weefsel op en neer om een single-cell suspensie te verkrijgen.
- Scheid de afzonderlijke cellen door ze door een 80-100-um mesh cel zeef.
- Centrifugeer de gefilterde enkele celsuspensie bij 150 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof door opzuigen, en resuspendeer de Pellet (neuronen) in 2 ml kweekmedium.
- Tel de cellen met een hemocytometer met trypan blauw kleuring de dichtheid en levensvatbaarheid te bepalen. Dan plaat 10.000 neuronen in 150 ul kweekmedium voor elke set stripes.The schorsing zorgvuldig worden geplaatst om de hele streep regio te dekken.
4. Visualisatie van cellichamen en axonen door immunofluorescentiekleuring gebruik van een anti-Tau1 Antibody
- Na 24 uur cultuur, zuig het medium zonder de hechtende cellen, en bevestig de neuronen met voorverwarmde 4% paraformaldehyde (PFA) / 4% sucrose / PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Indien gewenst, gebruik maken van een waterafstotende pen om een cirkel rond de gestreepte regio te vestigen op de hoeveelheid antilichaam die nodig is te verminderen.
- Permeabilize de neuronen met 0,3% Triton X-100 / PBS gedurende 5 minuten.
- Incubeer de neuronen met blokkeeroplossing die 3% donkey serum en 0,1% Triton X-100 voor30 min gevolgd door incubatie met een anti-Tau1 antilichaam (1: 200) in 1% donkey serum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N bij 4 ° C.
- Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Incubeer de neuronen met een fluorofoor geconjugeerd anti-muis IgG antilichaam in 1% runderserumalbumine (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS gedurende 30 min.
- Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Bedek de gestreepte gebied met een 18 mm x 18 mm dekglas met behulp van 50 pi antifade oplossing. vermijd luchtbellen die interfereren met de beeldvorming.
- Verkrijgen fluorescerende beelden met een fluorescentiemicroscoop met de juiste systeem, bijvoorbeeld x10 objectieflens filter sets voor GFP en RFP en 1000 msec blootstellingstijd (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedissocieerde hippocampale neuronen van E15.5 muizen werden uitgeplaat en gedurende 24 uur op strepen van fluorescent gelabelde controle Fc (figuur 3A-C) of FLRT2-Fc (Figuur 3D-F) afwisselen met ongemerkte controle Fc. In beide gevallen, de neuronen werden samengevoegd en uitgebreid hun axonen als bundels. Op het controle Fc / Fc strepen, de neuronen werden gelijkmatig verdeeld over de fluorescent gelabelde en ongelabelde strepen en breidden ze hun axonen in willekeurige richtingen (figuur 3A-C). Wanneer daarentegen gekweekt op FLRT-2 fc / Fc strepen, de axonen vermeden groeien op de FLRT2-Fc-gebieden. Zo werden de axons uitstrekken hoofdzakelijk op de controle Fc (Figuur 3D-F). Met name zowel cellichamen en axonen werden afgestoten van de FLRT2-Fc. Dus de axonen verlengd in een richting parallel aan de stroken Figuur 3D '.' - F '' geeft aan dat de axonen groeide langsde grens tussen controle Fc en FLRT2-Fc, maar niet uit te breiden tot het grondgebied FLRT2.
Figuur 1. Silicium Matrix gebruikt om het eiwit gestreepte stempel te creëren. (A, B) Bovenaanzicht van het silicium matrix. De grootte van matrix 30 mm x 25 mm x 5 mm. Witte pijl in A geeft een klein gat waar het recombinante eiwit wordt geïnjecteerd (stap 2,2). Pijlpunt in B duidt een sleuf waarin het recombinante eiwit afwisselend wordt toegepast (stap 2.2.1). (C, D) Onderaanzicht van het silicium matrix. De grootte van het gestreepte gebied is 7 mm x 9 mm. De breedte van elke strook is 90 urn. Pijl geeft een klein kanaal waardoorheen het recombinante eiwit wordt geïnjecteerd. (E) Schematische weergave van het sagittaal beeld van de middellijn van de matrix die de verbinding tussen het kleine gat, de strepen en de spleet. Pijl geeft de i njection gat. Schaal bars zijn 500 urn in AC en 200 urn in D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Dissectie van de muis hippocampus. (A) Bovenaanzicht van muis embryonale hersenen die de snijpositie (stippellijn) op de geïsoleerde hemisferen inclusief de hippocampus, de cortex en het striatum. (B, C) De geïsoleerde hippocampus wordt opgevangen in HBSS na het verwijderen van de hersenvliezen. ( D) Neuronen zijn gekweekt op de strepen in een 6-cm schotel. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
Figuur 3. Streep testen met controle-Fc en FLRT2-Fc en een gedissocieerde cultuur van de hippocampus neuronen. Gescheiden hippocampus neuronen uit E15.5 muizen werden gekweekt gedurende 24 uur op strepen van controle Fc (AC) of FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D-F', D '' - V '') uitgebreide beelden van de omkaderde gebieden in (AC, DF en D-F., respectievelijk) (A, A ') Strepen gegenereerd gebruikmaking van fluorescent gemerkte Fc (grijs) en Fc (zwart) als een controle-experiment. (D, D ', D' ') fluorescent gemerkte FLRT2-Fc strepen (grijs) afgewisseld met Fc (zwart). (B, B', E , E ', E' ') anti-Tau1 antilichaam kleuring van de cellichamen en axonen van de hippocampale neuronen. (C, C', F, F ', F "') de beelden van de strepen en de anti-Tau1 kleuring samengevoegd. de neurons 'cellichamen en axonen waren sterk afgestoten van de FLRT2-Fc (F, F', F ''). Merk op dat axonen te zetten langs de grens en doen het grondgebied FLRT2-Fc (pijlpunten in F '') niet in .Scale bars zijn 100 urn in C, C ', F, F' en 25 urn in F ''. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een streep test die recombinant eiwit en gedissocieerde neuronen maakt gebruik van het E15.5 muis hippocampus. Deze test maakt het mogelijk efficiënte observatie van afstotelijk, aantrekkelijk, of neutraal reacties van neuronen om een recombinant eiwit van interesse in een gestreept patroon. Een groot voordeel van dit protocol is de eenvoudige methode voor het genereren van de stroken, waarbij het eiwit direct gedrukt op het oppervlak van een plastic schaaltje, in vergelijking met de traditionele methode, die speciaal matrices, een vacuümsysteem vereist en een Nucleopore membraan 20 , 21. Om het eiwit strepen maken, kan het gemerkte recombinante eiwit worden toegediend via een klein gat of een groter monster (~ 100 ul) kan in de gleuf bovenop de matrix geplaatst, gevolgd door de zorgvuldige aspiratie van overtollige buffer en ongebonden eiwitten door het gat.
Een ander voordeel van deze werkwijze is dat een groot aantal neuronen kan gevisualiseerd worden alsIngle experiment, en nog veel groei kegels kunnen gelijktijdig 21 worden geanalyseerd. In tegenstelling, in een conventioneel draaien assay slechts één neuron en één groeikegel gevisualiseerd. De afstotende molecuul FLRT2 wordt waargenomen door neuronen, die weg migreren van FLRT2-Fc strepen 21. Een reportermolecuul zoals groen fluorescent eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP) kan worden uitgedrukt in de neuronen te visualiseren tegen het tapijt kleur en laat real-time observatie zonder de noodzaak van immunokleuring. Andere markeringen zoals FLAG, Myc en His kan worden gebruikt in plaats van het Fc-tag, en geïdentificeerd met de juiste fluorescent gelabelde anti-merker antilichaam (stap 2,1). Sommige hoge hydrofobe eiwitten kunnen de juiste streep als gevolg van zelf-aggregatie niet te maken. Verder kan de relatieve werking van aantrekking en afstoting tussen twee verschillende doeleiwitten worden vergeleken door het vervangen van een tweede doeleiwit voor controle Fc streep 20.
naarverhoging van de levensvatbaarheid van de neuronen, kan het nodig zijn de enzymatische vertering tijd en trypsine remming vereist. Als het voortbestaan verhouding van neuronen laag is, verdunnen de concentratie van trypsine of in te korten de enzymatische vertering tijd. De vochtigheid van de incubator moet worden gehandhaafd om verdamping geïnduceerde osmotische druk in het volledige systeem gedurende de kweekperiode voorkomen.
De hechting van de matrix aan de schotel is een belangrijke factor voor het bereiden goede strepen. Onjuist vasthouden aan de schotel oppervlak resulteert in een ongeorganiseerd streeppatroon. De dichtheid van cellen en concentratie van substraat ook essentieel voor een succesvolle experiment. Een hogere eiwitconcentratie in de strook wordt aanbevolen voor het analyseren van een molecuul waarvan de afstotende of aantrekkelijk activiteit onbekend. Hoewel dit protocol via gedissocieerd primaire neuronen hebben aangetoond, is het ook voor organotypische explantkweken 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
