Introduction
축삭지도는 새로 형성된 신경 세포는 신경계의 1, 2의 개발 기간 동안 자신의 목표에 축삭를 전송하는 과정입니다. 개발 축삭의 성장 원추라는 자신의 끝에 높은 운동성 구조를 실시하고 있습니다. 성장 콘 축삭의 경로를 탐색하는 세포 외 신호를 감지한다. 안내 등의 슬릿, semaphorin 같은 분자 및 ephrins는, 유치 또는 축삭 1,3,4에 적합한 수용체와 공동 수용체와의 상호 작용에 따라 축삭을 물리 칠 수 있습니다. 활성화 된 수용체는 축삭 성장 콘의 움직임에 대한 골격 조직에 영향을 미치는 성장 콘에 신호를 전송합니다.
다양한 방법이 유인 및 반발 성 분자의 작용을 평가하기 위해 개발되어왔다. 화학 - 유인 및 방충제는 그라데이션 농도 성장 / 문화 매체에 투여 될 수있다 (예., 던의 챔버 또는 μ-슬라이드) 마이크로-P에 의해 고농도의 자리에 5, 6,ipette (예., 전환 분석) 7 또는 목욕 응용 프로그램 (예., 성장 원뿔 붕괴 분석) 8,9에 의해 균일 한 농도.
다른 방법은 화학 - 유인 또는 반발은 기판 10-12으로서 판 표면에 도포되어있는 스트라이프 분석 또는 마이크로 콘택트 프린팅 (μCP)를 포함한다. Thestripe 분석은 원래 병아리 레티노 - tectal 시스템 (13)의 지형 매핑을 분석하기 위해 1987 년 본회퍼와 동료에 의해 개발되었다. 원래 방법은 스트라이프와 메쉬 행렬을 사용하여 폴리 카보네이트 nucleopore 막에 코트 단백질에 진공 시스템이 필요합니다. 이상에서, 재조합 단백질을 직접적으로 좁은 슬릿 실리콘 매트릭스 (14, 15)를 사용하여, 스트라이프 패턴으로 배양 용기의 표면에 인쇄했다. 최근 여러 연구 그룹이 성공적으로 축삭지도 분자 활동 16-21의 분석이 스트라이프 분석을 적용했습니다.
(21)를 제어의 재조합 ectodomain의 줄무늬 교대에 배양 하였다 해리. 배양 24 시간 후, 축삭 신경의 세포체는 모두 강하게 FLRT2 줄무늬에서 반발되었다. 항 Tau1 항체로 염색 FLRT2 반발이 강한 것을 나타내는 ~ 뉴런의 90 %가 FLRT2-FC에 ~ 10 %에 비해 된 Fc 피복 영역에 분포 된 것으로 나타났다해마의 뉴런 (21)에 대한 기능.
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Protocol
동물 주제와 관련된 절차는 의학의 하마 마츠 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
행렬의 1. 준비
- 전자 레인지에 5 분 동안 핫 플레이트에 4-8 실리콘 매트릭스를 삶아 그들을 층류 (줄무늬면이 위로)에서 1 시간 동안 완전히 건조 할 수 있습니다.
참고 : 다음 절차는 층류에서 수행되어야한다. - 압축 공기를 불어 또는 행렬의 스트라이프 측면에서 먼지를 제거하기 위해 투명 접착 테이프를 사용합니다. 깨끗한 스트라이프면을 유지 그래서 단단히 플레이트 표면에 부착 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 손가락 (; 스트라이프면이 아래 접시 당 하나의 매트릭스)으로 눌러 6 cm 플라스틱 요리 상에 매트릭스를 배치합니다. 매트릭스와 요리 사이에 기포가 들어 가지 않도록. 배양 접시의 바닥면에 줄무늬의 위치를 표시한다.
- 매트릭스 첨부 실패하면, 단계 1.2에서 반복합니다.
신경 문화 2. 스트라이프 생성 및 라미닌 코팅
- 형광 표지 된 재조합 단백질 준비은 FC-태그 단백질 (10 ~ 50 μg의 / ㎖) 및 형광 염료 -을 혼합하여 (25 μl를 주입 [단계 2.2] 100 ㎕의 배치 방법 [단계 2.2.1]에 대한 각 각) 공액 항 - 인간 항체의 Fc (1 비율 3 : 30-150 μg의 / ㎖) 인산염 완충 식염수 (PBS)이다. 그 후, RT에서 30 분 동안 혼합물을 배양한다.
- 22-G 주사기를 이용하여, 매트릭스의 측면에 작은 구멍을 통해 이전 단계 (2.1)에서 제조 한 재조합 단백질의 25 μl를 주입 (도 1A, 1C에서의 화살표 및 1E).
- 대안 적으로, 매트릭스의 상단 슬릿으로 재조합 단백질 100 μl를 넣고 있도록 작은 구멍으로부터 액의 흡 약 절반 (도 1A, 1C 및 1E의 화살표), 재조합 단백질은 스트라이프 영역에서 유지된다.
- 30 마일의 접시를 품어세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 N.
- 행렬의 측면에있는 작은 구멍에서 상단 슬릿 (그림 1B) 및 흡인에 PBS 300 μl를 놓습니다 (그림 1A, C 및 E의 화살표) 부착 재조합 단백질을 제거합니다. 단백질은 건조하기 때문에, 완전히 PBS를 대기음하지 마십시오. 두 번이 단계를 반복합니다. (총 3 회)
- 다른 코팅을 만드는 전체 스트라이프 영역을 덮도록, FC (10 내지 50 μg의 / ㎖)를 조심스럽게 조절 단백질 ~ 100 μL를 배치 즉시 매트릭스를 제거. 그 후, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 요리를 배양한다.
- PBS에서 ~로 접시면 20 μg의 / ㎖ 라미닌 100 μl를 PBS로 3 회 코트를 세척 한 후.
주 : 라미닌 응고를 방지하는 얼음에 해동되어야한다. - 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 접시를 부화.
- PBS와 함께 접시 표면을 세 번 씻고 문화 메디칼 추가음. 사용할 때까지 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 배양 배지와 코팅 접시를 놓습니다.
E15.5 마우스 배아 3. 배양 해마 신경 세포
- 자궁 경부 전위를 통해 어머니를 안락사 세 E15.5 배아를 분리.
- sagittally 가위로 머리의 중간 선에 피부와 두개골을 잘라 작은 스푼을 사용하여 뇌를 제거합니다. 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 3 ㎖를 포함하는 60 mm 페트리 접시에 조심스럽게 뇌를 전송합니다.
- 메스를 사용하여, 피질, 해마 및 선조체 (그림 2A)를 포함하여 반구를 잘라. 그리고, 신중 수막을 제거하여 해마 영역을 해부하고, 얼음 (도 2B-C)에서, HBSS 용액 2 ㎖를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 해부 해마 조직을 옮긴다. 8 요리 뉴런을 배양하기위한 충분한 튜브 3 배아에서 6 해마를 수집합니다.
- 수소를 교체트립신 / EDTA 용액 (2 mL) 및 수조에서 15 분 동안 37 ° C에서 튜브를 부화와 BSS 용액.
대기음 HBSS 원심 분리하지 않고 튜브를 기울여 HBSS 솔루션을 가만히 따르다하지 않습니다 있습니다. - 소 태아 혈청 (FBS) 500 μL를 첨가함으로써 트립신의 활성을 중화.
- 5 분 동안 100 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 배지 2 ㎖로 펠렛을 씻는다. 다시 한 번이 단계를 반복합니다.
- 피펫은 큰 구멍이 1,000 ㎕의 팁을 사용하여 배지에서 상하 해마 10 배 조직을 해리 (팁을 잘라).
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 아래 일반 (포경) 1,000 μL 팁으로 변경하고 해리 조직을 위로 피펫합니다.
- 80 ~ 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 전달하여 단일 세포를 분리합니다.
- 5 분 동안 150 XG에서 필터링 된 단일 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 흡입하여 상층 액을 제거하고 펠를 재현 탁등 배지 2 ㎖에 (뉴런).
- 밀도와 생존을 결정 트리 판 블루 염색에 혈구 세포를 사용하여 계산. stripes.The 현탁액의 각 세트는 신중 전체 스트라이프 영역을 커버하는 배치해야합니다 위해 다음, 배양액 150 ㎕를 10,000 신경 세포를 접시.
안티 Tau1 항체를 이용하여 세포 기관 및 면역 형광 염색법에 의한 축삭 4. 시각화
- 배양 24 시간 후, 부착 세포를 방해하지 않고 매체를 흡인하고, 예열 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / 4 % 슈 크로스에서 15 분 동안 RT에서 / PBS로 뉴런을 고정한다.
- PBS로 플레이트 표면을 3 회 반복한다. 원하는 경우, 필요한 항체의 양을 감소시키기 위해 스트라이프 영역 주위에 원을 그리 발수 펜을 사용한다.
- 5 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100 / PBS로 뉴런 Permeabilize 하시려면.
- 3 % 당나귀 혈청과 0.1 % 트리톤 X-100을 포함 차단 솔루션 뉴런을 품어4 ° C에서 1 % 당나귀 혈청 / 0.1 % 트리톤 X-100 / PBS O / N : 안티 Tau1 항체 (200 일)로 배양 한 다음 30 분.
- PBS로 플레이트 표면을 3 회 반복한다. 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) /0.1% 트리톤 X-100 / PBS 30 분에 형광 접합 된 항 - 마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션 뉴런.
- PBS로 플레이트 표면을 3 회 반복한다. antifade 용액 50 μl를 사용하여 18mm X 18mm 커버 유리와 스트라이프 영역을 커버. 이미징을 방해 공기 방울을 피하십시오.
- GFP 및 RFP, 1,000 밀리 초 노출 시간 (그림 3)에 대한 예를 들어, 해당 시스템을 사용하여 형광 현미경, 10 배 대물 렌즈, 필터 세트와 형광 이미지를 얻습니다.
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Representative Results
E15.5 마우스 해리 해마 뉴런 도금의 형광 제어을 FC (도 3A-C) 또는 비 - 표지 된 Fc 제어 교대 FLRT2-FC (도 3d-F) 라벨 줄무늬 24 시간 동안 배양 하였다. 두 경우 모두, 뉴런은 집계했고, 번들로 자신의 축삭을 확장했다. 컨트롤을 된 Fc / 된 Fc 줄무늬가 신경이 형광 표지하고 비 표지 된 줄무늬 균일하게 분포하고, 이들은 임의의 방향 (도 3A-C)에서 자신의 축삭을 연장. 반면에, 때 FLRT-2Fc /의 Fc 줄무늬 배양, 축삭은 FLRT2-의 Fc 영역에 성장 피했다. 따라서, 축삭 연장 주로 제어 된 Fc (도 3d-F)에 위치시켰다. 특히, 균체와 축삭 모두 FLRT2-FC에서 반발되었다. 따라서, 축삭의 스트라이프에 평행 한 방향으로 연장도 3d '.'- F '축삭을 따라 성장한 것을 보여준다제어 FC 및 FLRT2-FC하지만 사이의 경계는 FLRT2의 영역으로 확장되지 않았다.
그림 1. 실리콘 매트릭스는 스트라이프 단백질 스탬프를 생성하는 데 사용. 실리콘 매트릭스 (A, B) 상위 뷰입니다. 행렬의 크기는 30mm X 25mm의 X의 5mm이다. A의 흰색 화살표는 재조합 단백질이 주입 작은 구멍 (단계 2.2)을 나타냅니다. B의 화살촉은 재조합 단백질을 선택적으로 적용되는 슬릿 (단계 2.2.1). (C, D) 실리콘 매트릭스의 밑면을 나타냅니다. 스트라이프 영역의 크기는 X 9mm 7mm이다. 각 스트라이프의 폭은 90 μm의입니다. 화살표는 재조합 단백질이 주입되는 작은 도관을 나타낸다. (E)에 작은 구멍, 줄무늬, 슬릿 사이의 연결을 나타내는 행렬의 정중선의 시상의 개략도. 화살표는 난을 나타냅니다 njection 구멍. 스케일 바는 AC 500 μm의 D. 200 μm의있는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
마우스 해마의 그림 2. 해부. (A) 해마, 대뇌 피질과 선조체 포함하여 격리 반구의 절단 위치 (점선)를 보여주는 마우스 배아 뇌의 상위 뷰입니다. (B, C) 분리 된 해마는 수막을 제거한 후 HBSS에 수집된다. ( D) 뉴런은 6 cm 접시에 줄무늬 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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제어 FC 및 FLRT2-FC와 해마 신경 세포의 해리 문화 그림 3. 스트라이프 분석. 해리 해마 신경 세포 E15.5 마우스에서 제어 된 Fc (AC) 또는 FLRT2-FC (DF)의 줄무늬에 24 시간 동안 배양 하였다. ( A'-C ', D'-F', D ''- F '') (AC, DF, 및 D'-F의 박스 영역에서 확대 이미지 '. 각각) (A는 A') 줄무늬가 생성 형광 제어 실험으로 된 Fc (회색)과 된 Fc (검은 색)을 표시 사용. (D, D ', D' ') 형광 표지 FLRT2-FC 줄무늬 (회색)을 FC (검은 색). (B, B', E와 교류 , E ', E') 세포체 및 해마 신경 세포의 축삭 안티 Tau1 항체 염색. (C, C ', F, F', F ')이 스트라이프의 이미지 항 Tau1 염색 합병되었다. neur기능 '(F' '세포체와 축삭은 강하게 FLRT2-FC F, F)에서 격퇴 하였다'. 'F에서 25 μm의', F, F '.Scale 바는 C, C에서 100 μm의입니다 축삭은 국경을 따라 켜고 FLRT2-의 Fc 영역 ('F에서 화살촉)를 '입력하지 않습니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 E15.5 마우스의 해마에서 재조합 단백질과 해리 신경 세포를 사용하는 스트라이프 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 스트라이프 패턴으로 배치 관심 재조합 단백질에 신경 세포의 반발 매력, 또는 중립적 인 반응을 효율적으로 관찰 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 이점은 특별한 행렬 진공 장치를 필요로하는 기존의 방법에 비해 단백질이 직접 플라스틱 접시의 표면에 인쇄되는 줄무늬를 생성하기위한 간단한 방법 및 nucleopore 막 20 21. 단백질 줄무늬하려면 표지 재조합 단백질 과잉 버퍼와 결합되지 않은 단백질의주의 흡인 한 후, 작은 구멍 또는 큰 샘플 (~ 100 μL) 행렬 위에 슬릿에 배치 될 수 통해 주입 될 수있다 구멍을 통해.
이 방법의 또 다른 장점은 뉴런 다수 같이 시각화 될 수 있다는화롯불 실험 많은 성장 원뿔 21을 동시에 분석 할 수있다. 대조적으로, 종래의 회전 분석에서, 단지 하나의 뉴런 및 단일 성장 원뿔 가시화된다. 반발 분자 FLRT2는 FLRT2-FC 줄무늬 (21)로부터 멀리 마이그레이션 신경 세포에 의해 감지된다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)와 같은 리포터 분자는 카펫 색에 대하여 그들을 시각화 면역의 필요없이 실시간 관찰을 허용하는 뉴런에서 발현 될 수있다. FLAG 같은 다른 태그, Myc와, 그의 적절한 형광 표지 된 항 - 태그 항체 (단계 2.1)로 대신 된 Fc 태그의 사용, 및 식별 될 수있다. 일부 높은 소수성 단백질 때문에 자기 집단의 적절한 스트라이프를 할 수 없습니다. 또, 명소 및 두 가지 목적 단백질 사이의 척력의 상대적인 동작은 제어 된 Fc 스트라이프 20 번째 표적 단백질을 치환함으로써 비교 될 수있다.
에뉴런의 생존을 증가 효소 소화 시간 트립신 저해에 조정이 필요할 수있다. 뉴런의 생존 비율이 낮은 경우, 트립신의 농도를 희석하거나 효소 분해 시간을 단축. 인큐베이터 습도 수준은 배양 기간 동안 전체 시스템의 증발 유도 삼투압 않도록 유지되어야한다.
접시에 매트릭스의 밀착성이 좋은 줄무늬를 제조하기위한 중요한 요소이다. 비조직적 스트라이프 패턴의 접시면 결과에 부적절한 준수. 그러나 세포와 기질의 농도의 밀도는 성공적인 실험 중요하다. 스트라이프의 높은 단백질 농도는 누구의 반발 또는 매력적인 활동을 알 수없는 분자를 분석하는 것이 좋습니다. 우리가 해리 차 뉴런을 사용하여,이 프로토콜을 입증 하였지만, 또한의 Organotypic 이식편 배양 물 (15)을 적용한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/100 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
References
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