Summary

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em> السوادية الذروية</em> لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Published: September 30, 2016
doi:

Summary

نحن تصف استراتيجية استبدال الجينات قوية لمعالجة وراثيا فطر التفحم السوادية الذروية. يشرح هذا البروتوكول كيفية توليد المسوخ الحذف للتحقيق في الظواهر العدوى. ويمكن أن تمتد إلى تعديل الجينات بأي شكل من الأشكال المطلوبة، على سبيل المثال، عن طريق إضافة تسلسل ترميز علامة بروتين فلوري.

Abstract

الجينات الحذف يلعب دورا هاما في تحليل وظيفة الجين. واحدة من أكثر الوسائل فعالية لتعطيل الجينات بطريقة هادفة هو استبدال الجينات كامل مع علامة اختيار عبر إعادة التركيب مثلي. خلال إعادة التركيب مثلي، وتبادل الحمض النووي يحدث بين متواليات مع تشابه عالية. لذلك، تسلسل الجينوم الخطية المحيطة الجينات المستهدفة يمكن استخدامها لوجه التحديد توجيه علامة اختيار إلى الموقع التكامل المنشود. نهايات حادة للبناء حذف تفعيل نظم إصلاح الحمض النووي للخلية، وبالتالي تعزيز التكامل بين بناء إما عن طريق إعادة التركيب مثلي أو من خلال الانضمام إلى غير المتجانسة نهاية. في الكائنات الحية مع إعادة التركيب مثلي كفاءة، يمكن أن معدل حذف الجينات نجاح تصل إلى أكثر من 50٪ صنع هذه الاستراتيجية قيما نظام تعطيل الجين. فطر التفحم السوادية الذروية هو الكائنات الحية الدقيقة نموذج حقيقية النواة تظهر مثل recombinat مثلي كفاءةأيون. من إزاء 6،900 الجينات، وكثير اتسمت ظيفيا مع مساعدة من المسوخ الحذف، وتكرار فشل محاولات استبدال الجينات نقاط في وظيفة أساسية من الجين. توصيف لاحق من وظيفة الجين عن طريق وضع علامات مع علامات الفلورسنت أو طفرات من المجالات توقع يعتمد أيضا على تبادل الحمض النووي عبر إعادة التركيب مثلي. هنا، نقدم U. الذروية استراتيجية الجيل سلالة بالتفصيل باستخدام أبسط مثال، حذف الجينات.

Introduction

السوادية الذروية هو نموذج الفطريات الممرضة للنبات التي تمت دراستها على نطاق واسع لعقود 1،2. ويوجد في اثنين الأشكال التضاريسية، لذلك، مرحلة تشبه الخميرة غير المسببة للأمراض والخيطية، شكل المعدية 3. وقدمت الاكتشافات اختراق عالمية مثل آليات إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي المتجانسة في مرحلة النمو تشبه الخميرة من هذه الفطريات 4. وعلاوة على ذلك، والتحول المورفولوجي للخيوط والفوعة العوامل المعدية الهامة للعدوى وجيدا تتميز 5،6. المعرفة الجزيئية زيادة عن علم الأحياء والفوعة من هذه الفطريات التفحم تعتمد على استراتيجية استبدال الجينات مباشر 7-9 بدعم من الجينوم الشرح ممتاز 10 وسهولة علم الوراثة العكسية باستخدام، على سبيل المثال، منظمة تنظيما جيدا لجمع البلازميد في معهدنا (HTTP : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). موحدة، فحوصات العدوى السريعة في الذرة الصورةالسماح eedlings دراسات تفصيلية المرضية عوامل 11.

جينوم U. الذروية يحتوي على حوالي 6900 الجينات 10. لدراسة وظيفتها، ويمكن حذف منفردة أو مجتمعة بسبب نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة. المناطق المحيطة من حوالي 1 كيلو بايت تحتوي على نهايات مثلي تماما مثالية لمعدلات إعادة التركيب مثلي أكبر من 50٪، ولكن بالفعل 250 نقطة أساس مع نهايات غير المتجانسة تسمح بعض درجة من التكامل الصحيح للبناء 9. حاليا، خمسة أشرطة مقاومة مختلفة، hygR، cbxR، natR، G418R، وphleoR التوسط المقاومة ضد هيغروميسين، carboxin، nourseothricin، G418 وphleomycin، ويعمل لتحديد لtransformants 7،9. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير المقاومة هيغروميسين إلى شريط كاسيت القابلة لإعادة التدوير (FRT-hygR) التي يمكن إزالتها عن طريق التعبير عابرة من recombinase FLP مغاير 12. وهذا يسمح إزالة كاسيت المقاومة، وبالتالي في نظرية التعديلات الجينية غير محدودة. Phleomycin غير مطفرة 13، بحيث مع أشرطة جديدة، ولا سيما hygR كاسيت القابلة لإعادة التدوير، واستخدام phleoR آخذ في التناقص. ومن ثم لا يمكن المسوخ رباعية توليد باستخدام أربعة أشرطة أخرى، ولكن لالمسوخ خماسية، ينصح نظام FRT-hygR 14.

وقد تم نقل هذه الاستراتيجية حذف الجينات العامة بنجاح الفطريات التفحم أخرى مثل Sporisorium reilianum 15، U. hordei 16، أو U. esculenta 17، وبالتالي توفر إمكانية لمزيد من التطبيقات في الكائنات بعد المستعصية وراثيا مع نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة. وعلاوة على ذلك، والكائنات التي تفتقر إلى إعادة التركيب مثلي يمكن تعديلها لتحسين الهندسة الوراثية كما يدل على ذلك حذف الجينات المسؤولة عن غير مثلي أوند-في الانضمام العصيباء المبوغة crassa 18،19.

نحن هنا وصف الاستراتيجية حذف الجينات التي تنشر لU. الذروية 7،9 في التفاصيل التجريبية مع التركيز على التحقق السريع والدقيق للمرشحين. وكمثال على ذلك، ونحن نستخدم chitinases الفطرية وتصوير جيل من المسوخ واحدة وكذلك حذف عدة سلالات 20،21. Chitinases أمثلة مثيرة للاهتمام، لأنها تعمل على كيتين في جدار الخلية جامدة. مطلوب إعادة جدار الخلية لتغيرات شكلية أثناء انقسام الخلية، والتحول إلى النمو الخيطية، وتشكيل بوغ. وبالتالي، في المسوخ الحذف يمكن توقع الظواهر طوال دورة الحياة.

Protocol

1. توليد حذف التركيبات توليد البلازميد التي تحتوي على بناء الحذف (الشكل 1) يتألف من 1 كيلوبايت الجناح منها المنبع (UF) والمصب الجناح (DF) كل والكاسيت المقاومة المناسب يحيط بها تقييد مواقع قطع حادة. ملاحظة: أي اس…

Representative Results

بنيات الحذف لجميع الجينات chitinolytic أربعة المشفرة في U. تم إنشاؤها الذروية الجينوم عن طريق الاستنساخ جولدن جيت باستخدام كاسيت hygR للحذف من cts1، وnatR للحذف من cts2، الكاسيت G418R للحذف من cts3 وcbxR للحذف من cts4 20.</…

Discussion

يصف هذا البروتوكول وكيفية توليد المسوخ الحذف للدراسات الوراثية العكسية في U. الذروية. نقطة البداية هي بنية الحذف الذي يحتوي تسلسل المرافقة لهذا الجين في المصالح التي تحتوي على تسلسل حوالي 1 كيلو بايت المنبع من بداية والمصب لوقف كودون وكذلك كاسيت المقاومة المناس?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

شكر خاص للدكتور بينيديكت Steuten لقراءة نقدية للمخطوطة. تم تنفيذ العمل الأصلي على chitinases بها الدكتور تورستن انغنر. يتم اعتماد مختبر VG التي كتبها عنقود التميز في علوم النبات (CEPLAS، DFG EXC 1028) وBioSC، يتم اعتماد مختبر KS التي كتبها BioSC. ويدعم KB من BioSC. الأنشطة العلمية لمركز العلوم الاقتصاد الحيوي (BioSC) ودعما ماليا من وزارة الابتكار والعلوم والبحوث في إطار من NRW Strategieprojekt BioSC (رقم 313 / 323-400-00213). ويدعم LF من قبل زمالة الدكتوراه من DFG المجموعة الدولية والبحوث والتدريب 1525 iGRADplant.

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid) Sigma Aldrich A-9878
Bacto Agar  BD 214010 alternatively use local supplier
Bacto Peptone BD 211677 alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract  BD 212750 alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O Grüssing GmbH 10234 alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) Sigma Aldrich P-2250
Carboxin  Sigma Aldrich 45371
Casamino acids  BD 223050
Cholinchlorid Sigma Aldrich C-1879
Citric acid ChemSolute 24,321,000 alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O Fluka 61240 alternatively use local supplier
D(+)Sucrose  Roth 4621.1 alternatively use local supplier
DNA degr. free acid  Sigma-Aldrich D-3159
EDTA Sigma Aldrich E4378
FeCl3*6H2O Grüssing GmbH 10288 alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt Sigma Aldrich A1720
Trichoderma lysing enzymes Sigma Aldrich L1412
Glucose Caelo 2580 alternatively use local supplier
Glycerin  Fisher Chemical G065015 alternatively use local supplier
H3BO3 AppliChem A2940 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3393-50KU
Hygromycin B-solution Roth 1287.2 Dangerous substance. 
KCl VWR 26764298 alternatively use local supplier
KH2PO4 AppliChem A3620 alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree Merck 7487-88-9 Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O AppliChem A2087 alternatively use local supplier
myo-Inositol Sigma Aldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2O AppliChem A2937 alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O Roth 0274.2 alternatively use local supplier
Na2SO4 Grüssing GmbH 12174 alternatively use local supplier
NaCl Fisher Chemical S316060 alternatively use local supplier
NaOH ChemSolute 13,751,000 alternatively use local supplier
NH4NO3 Roth K299.1 alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid) Sigma Aldrich N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate   Werner BioAgents 5,001,000
Nutrient broth  Difco local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 Sigma Aldrich P3803 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG) Sigma Aldrich P-3640
Potassium acetate AppliChem 121479 alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid) Sigma Aldrich P-9755
Riboflavin  Sigma Aldrich R4500
RNaseA Sigma Aldrich R5503
SDS Roth Cn30.3 alternatively use local supplier
small syringe BD 300300 alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm VWR 28145-477 alternatively use local supplier
Sorbitol Roth 6213.1 alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride Serva 36020.02 alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate Fisher Chemical S332060 alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane VWR 103156X alternatively use local supplier
Tris hydrochloride Roth 9090.4 alternatively use local supplier
Triton X-100  Serva  37240 alternatively use local supplier
ZnCl2 Fluka 96470 alternatively use local supplier
Name Company Catalog Number Comments
Composition of solutions/preparation of material Composition of solutions
Carboxin Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418) Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
Heparin Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution  0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight 1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8 Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG 40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 8 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase 10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2 mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

References

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Bösch, K., Frantzeskakis, L., Vraneš, M., Kämper, J., Schipper, K., Göhre, V. Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions. J. Vis. Exp. (115), e54522, doi:10.3791/54522 (2016).

View Video