Summary
Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.
Abstract
Délétion du gène joue un rôle important dans l'analyse de la fonction génique. L'une des méthodes les plus efficaces pour perturber les gènes de manière ciblée est le remplacement de la totalité du gène avec un marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison homologue, l'échange d'ADN a lieu entre les séquences avec une grande similitude. Par conséquent, des séquences génomiques linéaires flanquant un gène cible peuvent être utilisés pour diriger spécifiquement un marqueur sélectionnable sur le site d'intégration souhaité. Des extrémités franches de la construction de deletion activent les systèmes de réparation d'ADN de la cellule et ainsi favoriser l'intégration de la construction, soit par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue ou non homologue jonction bout. Dans les organismes avec efficacité la recombinaison homologue, le taux de délétion du gène réussi peut atteindre plus de 50%, ce qui cette stratégie, un système de dissociation génétique précieux. Le champignon Ustilago maydis est un modèle micro-organisme eucaryote montrant tel recombinat homologue efficaceion. Sur ses environ 6.900 gènes, beaucoup ont été caractérisé fonctionnellement avec l'aide de mutants de deletion, et répété échec des tentatives de remplacement de gènes points fonction essentielle du gène. Caractérisation ultérieure de la fonction du gène par le marquage avec des marqueurs ou des mutations des domaines prédits fluorescents repose également sur l'échange d'ADN par recombinaison homologue. Ici, nous présentons le U. maydis stratégie de génération de contrainte en détail en utilisant l'exemple le plus simple, la suppression du gène.
Introduction
Ustilago maydis est un champignon modèle phytopathogènes qui a été largement étudié depuis des décennies 1,2. Il existe en deux morphologies, une étape non pathogène type levure et une filamenteux, forme infectieuse 3. Découvertes révolutionnaires universelles telles que les mécanismes de recombinaison et de réparation de l' ADN homologues ont été faites à l'étape de ce champignon 4 croissance type levure. En outre, le commutateur morphologique des facteurs de filaments et de virulence infectieuses importantes pour l' infection sont bien caractérisés 5,6. La connaissance moléculaire de plus en plus sur la biologie et de la virulence de ce champignon du charbon repose sur une stratégie de remplacement de gène simple 7-9 soutenu par une excellente annotation du génome 10 et la facilité de génétique inverse en utilisant, par exemple, la collecte de plasmide bien organisé dans notre institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Normalisés, tests d'infection rapide dans le maïs seedlings permettent des études détaillées de pathogénicité facteurs 11.
Le génome de U. maydis contient environ 6.900 gènes 10. Pour étudier leur fonction, ils peuvent être supprimés individuellement ou en combinaison grâce à un système de recombinaison homologue efficace. Régions flanquantes d'environ 1 kb contenant des extrémités parfaitement homologues sont idéales pour les taux de recombinaison homologue supérieure à 50%, mais déjà 250 pb avec des extrémités non homologues permettent un certain degré d'intégration correcte de la construction 9. À l' heure actuelle, cinq cassettes de résistance différentes, Hygr, CBXR, NATR, G418R, et la médiation de la résistance contre phleoR hygromycine, la carboxine, la nourséothricine, G418 et phléomycine, sont utilisés pour sélectionner les transformants 7,9. En outre, la résistance à l'hygromycine a été développé dans une cassette recyclable (TRAF-Hygr) qui peut être éliminé par l'expression transitoire d'une recombinase FLP hétérologue 12. Ceci permet le retrait de la cassette de résistance et donc en théorie illimité des modifications génétiques. Phléomycine est mutagène 13, de sorte que les nouvelles cassettes, en particulier , la cassette Hygr recyclable, l'utilisation de phleoR diminue. Mutants quadruples peuvent ainsi être générés en utilisant les quatre autres cassettes, mais pour les mutants quintuples, le système FRT-Hygr est recommandé 14.
Cette stratégie générale de délétion du gène a été transféré avec succès à d' autres champignons du charbon tels que Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 et donc offre la possibilité de nouvelles applications dans les organismes génétiquement encore intraitables avec un système de recombinaison homologue efficace. En outre, les organismes dépourvus de recombinaison homologue peuvent être modifiées pour améliorer le génie génétique comme en témoigne la suppression de gènes impliqués dans la non-homologue-end-assemblage dans Neurospora crassa 18,19.
Nous décrivons ici la stratégie de délétion du gène publié pour U. maydis 7,9 en détail expérimental avec un accent sur la vérification rapide et précise des candidats. A titre d'exemple, nous utilisons les chitinases fongiques et représentent la génération de mutants simples, ainsi que la suppression de multiples souches 20,21. Chitinases sont des exemples intéressants, car ils agissent sur chitine dans la paroi cellulaire rigide. le remodelage de la paroi cellulaire est nécessaire pour les changements morphologiques au cours de la division cellulaire, le commutateur de croissance filamenteuse et la formation de spores. Par conséquent, dans les mutants de deletion phénotypes au long du cycle peuvent être attendus.
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Protocol
1. Génération de deletion Constructs
- Générer un plasmide contenant la construction de deletion (figure 1) comprenant un flanc respectif de 1 kb en amont (UF) et le flanc aval (DF) chacune et la cassette de résistance appropriée flanquée par des sites de restriction de coupe émoussés.
NOTE: Toute stratégie de clonage peut être utilisé (pour le clonage voir référence 22) , nous recommandons Golden Gate clonage pour ces plasmides 9. - Exciser la suppression construire à partir du plasmide en utilisant un couteau émoussé pour obtenir 1 pg d' ADN de la suppression de construire 9. Purifier la construction de suppression pour éliminer l' enzyme et le tampon 22 , par exemple en utilisant des réactifs commerciaux et suivre les instructions du fabricant.
NOTE: Le squelette du vecteur peut rester dans le mélange de transformation.
2. Préparation de protoplastes
REMARQUE: Gardez des conditions stériles pendant toutes les périodes de l'eXperiment. La paroi cellulaire est une barrière de protection qui limite l'accès des molécules de la membrane plasmique. Pour permettre l'absorption de l'ADN contenant la construction de deletion, la paroi cellulaire doit être enlevé par la paroi cellulaire des enzymes dégradant dans une réaction de protoplastes. Les étapes critiques dans la préparation de protoplastes sont 1) la stabilisation osmotique du milieu et 2) en évitant le stress mécanique sur les protoplastes.
- Mark 2 ml tubes avec un fond rond de geler les protoplastes et les refroidir à -20 ° C. Démarrer une pré-culture dans 3 ml YEP-Light à partir d'une plaque fraîche de la souche avec le fond génétique désiré. Incuber sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C.
NOTE: La souche peut être la souche SG200 solopathogenic 10, les souches de type sauvage, souches d'essai tels que AB33 23, ou tout fond mutant pour la production de doubles mutants. Assurez-vous que la souche est libre de la résistance souhaitée. - Diluer la culture dans 50 ml YEP-lumière dans un flas déconcertésk et laisser incuber sur un agitateur orbital à 28 ° C avec 200 tours par minute.
NOTE: Le temps de doublement est d'environ 2 h pour les souches de type sauvage. Autoriser trois duplications minimum. - Cultivez jusqu'à la phase exponentielle. Faire en sorte que la densité optique, mesurée à une longueur d' onde de 600 nm (DO 600) est d' environ 0,8 (0,6 et 1,0 est acceptable). Une DO600 de 1,0 correspond à environ 1 à 2 x 10 7 U. maydis cellules par ml.
- Vérifiez les cellules de contamination sous un microscope. Utilisez 40x. Sédimenter les cellules de la culture de 50 ml toutes les 5 min, 1500 x g et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 25 ml de citrate de sodium, solution de sorbitol (SCS), centrifuger 5 min, 1500 xg, et éliminer le surnageant.
REMARQUE: les contaminations bactériennes peuvent être identifiées comme des cellules petites et souvent en mouvement. Contaminations fongiques peuvent être identifiés sur la base d' une forme de cellule ou une taille différente par rapport aux cellules en forme de cigare de U. maydis. - Pendant centrifugation préparer une solution de protoplastes (12,5 mg / ml Trichoderma lyser enzymes, dans SCS, préparer 3 ml par culot cellulaire, filtre stériliser à travers un filtre 22 um; solution doit être frais pour l' activité enzymatique optimale). SCS est un stabilisant osmotique pour empêcher la rupture de protoplastes lors du retrait de la paroi cellulaire.
- Reprendre le culot dans 2 ml de solution de protoplastes. Incuber pendant 5 à 20 min à température ambiante et vérifier sous le microscope jusqu'à ce que 30 à 40% des cellules sont rondes ou comme pinheads (Figure 2).
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de la glace à partir de maintenant et de gérer protoplastes avec soin! - Laver 3x dans 10 ml froid (4 ° C) SCS, centrifuger à 1000 g pendant 5 min.
- Reprendre le culot dans 10 ml de sorbitol froid, TrisHCl, CaCl2 solution (STC), rotation à 1000 xg pendant 5 min, éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 1 ml de STC froid, faire 100 aliquotes ul dans les tubes refroidis. Congeler les aliquotes à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
3. Transformation de U. maydis
NOTE: La transformation de U. maydis protoplastes repose sur le polyéthylène glycol (PEG) de la méthode de transformation médiée, ce qui est techniquement simple et opposée à électroporation ou transformation biolistique ne nécessite pas d' équipement spécialisé.
- Préparer les plaques de sélection à deux couches (2 plaques par réaction de transformation). La couche inférieure contient l'antibiotique à une concentration doublé. Pipeter 12 ml de RegLight contenant 400 ug / ml d'hygromycine (ou 300 pg / ml de nourséothricine ou 4 ug / ml carboxine ou 1 mg / ml de G418) dans une boîte de Petri. Éviter les bulles.
NOTE: plaques de couche inférieure peut être conservé quelques jours à 4 ° C, mais de préparer la couche supérieure fraîchement lors de la transformation (voir ci-dessous). - protoplastes Décongeler sur la glace (1 tube / transformation). Ajouter 1 pi d'héparine (15 mg / ml). Ajouter 1 pg d' ADN (de construction linéarisé) ou 10 ul H 2
- Pendant ce temps, pour la couche supérieure se propager 12 ml liquéfiés RegLight (ébullition et laisser refroidir à 60 ° C) sur la plaque de fond de RegLight.
NOTE: Cette couche ne contient pas d'antibiotiques. - Ajouter 500 ul de STC / PEG (polyéthylène glycol) dans le tube de transformation (3 2) et mélanger soigneusement en inversant le tube. Incuber 15 min sur la glace.
- Distribuer chaque réaction de transformation sur deux des plaques d'RegLight deux couches. Etalez soigneusement et lentement avec une pipette en verre. Incuber les plaques en position verticale à 28 ° C pendant 5 à 7 jours jusqu'à ce que les transformants poussent comme des colonies. Obtenir environ 100-200 colonies par plaque.
REMARQUE: Les nombres inférieurs pourraient être causés par des protoplastes «mauvais» qui soit contiennent paroi cellulaire trop et ne peut donc pas prendre l'ADN ou ne peut pas se régénérer. Le premier peut être testé par transformation avec un plasmide auto-réplication, ce dernier en testant la régénération sur des plaques sans antibiotiques. <li> Préparer YEP-Light plaques contenant l'antibiotique approprié à 200 pg / ml d'hygromycine (ou 150 pg / ml de nourséothricine ou 2 ug / carboxine ml ou 500 pg / ml de G418, ces concentrations égales la moitié de celle utilisée pour les plaques de fond). Re-purifier au moins 24 colonies de transformants putatifs sur ces plaques. Des colonies isolées devraient être obtenues. Dans le même série de temps de la souche originale sur les médias non-sélective.
REMARQUE: Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant 1-2 semaines.
4. Vérification des événements corrects deletion
NOTE: Les mutations sont vérifiées dans une procédure en trois étapes (Figure 1). Tout d'abord, les candidats contenant la copie de type sauvage du gène sont exclus par PCR. D'autre part, l'intégration de la cassette de résistance dans le locus est vérifiée par PCR. Troisièmement, l'intégration de la cassette de résistance que dans le locus désiré est vérifiée par analyse par transfert de Southern. vérification de la souche minutieuse est essential, de sorte que phénotypes mutants corréler vraiment avec la suppression.
- Premier diagnostic PCR 20
- Conception des amorces appariement dans le gène à supprimer dans ce résultat un produit de 250 à 600 pb (figure 1). Ces petits produits sont faciles à amplifier dans une colonie PCR, et assez longtemps pour la détection dans l'électrophorèse sur gel standard.
- Pour chaque candidat et la souche originale en tant que témoin positif, remettre en suspension un peu (quantité d'une tête d'épingle) d'un matériau cellulaire d'une seule colonie avec un cure-dent dans 20 ul de NaOH 0,02. Incubation à température ambiante pendant 30 min.
REMARQUE: Utiliser des colonies fraîches. Si les plaques sont plus âgés de 1 semaine re-série pour obtenir une nouvelle colonie. - En utilisant 1 pi de la suspension cellulaire pour la PCR immédiatement. Exécuter une réaction PCR standard et analyser les fragments résultants.
NOTE: Ces échantillons ne peuvent pas être stockés.
REMARQUE: les tests Cette PCR pour la présence du gène de type sauvage et de ce fait permet une identification rapide des cand négativeidates dans lequel le gène d'intérêt n'a pas été remplacé. Les clones produisant des bandes dans cette réaction PCR seront rejetées. Un tel clone négatif doit de toute façon être effectué le long comme un contrôle négatif supplémentaire. Les candidats sans un produit de PCR doivent être analysées plus loin. Pour les gènes sans effets négatifs d'environ la moitié des candidats doit contenir le gène de type sauvage, tandis que l'autre moitié ne devrait pas entraîner une bande. Cela correspond à un taux de recombinaison homologue de 50%.
- Deuxième PCR Diagnostic
- Préparation de l'ADN génomique.
REMARQUE: L'ADN génomique (ADNg) peut être préparé en utilisant deux protocoles différents. Le premier concerne les réactifs toxiques comme le phénol et le chloroforme et, par conséquent, doivent être manipulés que par des chercheurs expérimentés (décrits dans 4.2.1.1 à 4.2.1.5) tandis que le second peut également être manipulé par des étudiants moins expérimentés (décrites dans 4.2.1.6 à 4,2. 1.11). Les deux protocoles fonctionnent de manière fiable. 4.2.1.1 étape est identique pour les deux protocols.- Inoculer 5 ml YEP-Light avec chaque candidat et incuber sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C. Goutte 2 ul de la culture sur une plaque de CM. Gardez la culture stérile.
NOTE: A la suite est un protocole standard (ATTENTION: pas toxiques). - Mettre 1 cuillère (~ 200 pi) de billes de verre HCl lavés à 2 ml tubes. Ajouter 2 ml de U. culture maydis. Spin 12.000 xg pendant 5 min. Rejeter le surnageant (culot peut être congelé à ce stade). Ajouter 500 ul de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1) pour la pastille. PRUDENCE! PHENOL EST TOXIQUE!
- Ajouter 500 ul Usti-lyse-tampon 1. Secouez pour 6 à 10 min sur un Vibrax à 1000 rpm. Vérifiez que le culot cellulaire est complètement remis en suspension, mais il faut éviter étendu secouer pour éviter le cisaillement du ADNg. Spin à 12.000 xg pendant 15 min. Transférer 400 ul de la phase aqueuse dans le nouveau tube de réaction (ne touchez pas l'interphase).
- Ajouter 1 ml de 100% (v / v) d'éthanol. Inversez les 3x tube pour mélanger, observer le cfort de l'ADN qui apparaît sous peu. Spin à 12.000 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant et laver avec 200 ul de 70% EtOH. Ne pas remettre le culot dans cette étape.
- Retirer le surnageant complètement (ne laissez pas le culot sécher complètement). Ajouter 50 ul de TE / RNase. Dissoudre ADNg par agitation à 400 tours par minute à 50 ° C pendant 10 min. Analyser 2 pi du ADNg sur un gel d'agarose à 0,8% 20.
NOTE: Les étapes ci-dessous comprennent un protocole non toxique alternative.
- Inoculer 5 ml YEP-Light avec chaque candidat et incuber sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C. Goutte 2 ul de la culture sur une plaque de CM. Gardez la culture stérile.
- Autre préparation d'ADN génomique
- Mettre 1 cuillère (~ 200 pi) de HCl billes de verre lavées à 2 ml tubes. Ajouter 2 ml de U. culture maydis et de spin à 12.000 xg pendant 5 min. Rejeter le surnageant (pellets peuvent être congelés à ce stade).
- Ajouter 500 pi de tampon Usti Lysis 2 au culot. Agiter pendant 5 à 15 min sur un Vibrax à 1000 rpm. Vérifiez que le culot cellulaire est complètement remis en suspension.
- Incuber les tubes à 65 ° C pendant 15 à 20 min. Utilisation approincubateurs appropriés conçus pour accueillir 2 ml tubes est critique. Ensuite, placez-le sur la glace pendant 5 min.
- Ajouter 100 ul de 8 M d'acétate de potassium, le tourbillonnement ou inverser 8 à 10 fois. Essorer 12 000 xg pendant 15 min à température ambiante.
- Transfert de 500 ul du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 400 ul d'isopropanol. Vortex ou inverser 8 à 10 fois. Essorer 12 000 xg pendant 15 min. Retirer le surnageant et laver avec 500 ul de 70% EtOH. Spin 12.000 xg pendant 5 min.
- Faire tremper le surnageant complètement! Finalement, ajoutez un essorage court (10 sec) pour éliminer le liquide résiduel. Laissez le culot d'ADN sec pendant 3 à 5 min. Ajouter 50 ul de TE / RNAse et incuber à 50 ° C pendant 10 à 15 min à 400 tours par minute.
- PCR
- Conception de deux paires d' amorces avec l' un d'eux se lier à l' extérieur des flancs et celle correspondante de liaison au sein de la cassette de résistance (UF-f RC-R; RC-f, DF-r, figure 1) 9.
- En utilisant 1 ul d'une dilution 1:10 de l'ADNg de chaque cCANDIDATS comme matrice dans des réactions PCR 2 vérification de l'insertion correcte amont et en aval 9.
- Utilisez des réactions classiques de PCR pour chaque candidat et analyser les fragments 22 résultant.
REMARQUE: Ces PCR tester pour l'insertion de la cassette de résistance dans le locus génomique correcte. Si les produits sont obtenus pour les deux parties, le candidat est probablement une bonne insertion. Cependant, aussi candidats où un seul côté (en amont ou en aval) pourrait être confirmée doivent être effectuées le long d'une analyse plus approfondie dans le cas où les réactions PCR simplement échoué pour un flanc.
- Préparation de l'ADN génomique.
- Vérification de l' insertion génomique correcte par Southern Blot Analyse 22
- Digérer 15 ul d'ADNg (4.2.1) des candidats mutants et la souche de type sauvage / progénitrices correspondant avec une enzyme appropriée qui coupe à l'extérieur du locus / construction et, en outre, réduit soit dans le gène ou la cassette de résistance menant à bien distmotifs inguishable (figure 1) 8.
NOTE: Aucun des bandes attendues devrait être supérieure à 10 kb, de sorte qu'ils se distinguent clairement de l'ADN non digérés. - Utiliser l'amont et l'aval du flanc en tant que sondes. Pour les étiqueter par exemple utiliser le kit de marquage DIG PCR ou toute méthode standard similaire. Mélanger les sondes marquées dans un rapport de 1: 1 moléculaire et effectuer le transfert de Southern. Gardez au moins deux transformants corrects indépendants.
NOTE: Le modèle de type sauvage doit être clairement détectable dans la souche d'origine et les clones corrects ne doit contenir que les bandes attendues. Des bandes supplémentaires seulement présentes dans les candidats indiquent d'autres insertions de la construction dans un lieu mal. Ces clones doivent être jetés. Le candidat négatif identifié dans le premier diagnostic par PCR doit contenir les bandes de type sauvage et les bandes de taille (imprévisibles) de la construction de deletion à tort intégré.
- Digérer 15 ul d'ADNg (4.2.1) des candidats mutants et la souche de type sauvage / progénitrices correspondant avec une enzyme appropriée qui coupe à l'extérieur du locus / construction et, en outre, réduit soit dans le gène ou la cassette de résistance menant à bien distmotifs inguishable (figure 1) 8.
- Stocks de Glycérine
REMARQUE: les stocks Glycérine servent à maintenir les clones pendant des années dans les collections de souches. Au moins deux transformants indépendants devraient être tenus pour chaque mutant. Cela permet à des phénotypes comparant qui devraient être identiques.- Cultivez 5 ml de cultures de souches mutantes confirmés dans YEP-Light sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C Mix 500 pi de chaque culture avec 500 ul NSY-Glycerol-moyen. Inversez tube jusqu'à ce milieu de culture et sont bien mélangés. Glycérol dans le milieu empêche la formation de cristaux de glace.
- Congeler à -80 ° C. Re-strie une partie de la culture congelée pour tester si le stock est fonctionnel.
5. Microscopic phénotypes
- Cultivez 5 ml de cultures de type sauvage et des souches mutantes dans YEP-Light sur une roue en rotation pendant 12 heures à 28 ° C.
- Le lendemain, la culture diluée à une DO600 d'environ 0,1 et il pousse jusqu'à ce qu'une DO600 comprise entre 0,5 et 0,7. Une DO600 de 1,0 correspcondes à environ 1 à 2 x 10 7 U. maydis cellules par ml.
- Inspecter la morphologie des cellules au microscope.
NOTE: les cellules saines apparaissent en forme de cigare (figure 4, WT). vacuoles prononcés ou la formation des filaments indiquent que les cellules sont soulignées.
REMARQUE: Selon le phénotype mutant attendu, l'analyse peut être adapté, par exemple, si des souches de rapporteurs sont utilisés le dosage approprié peut être effectuée à ce stade. Si la morphologie des cellules est une analyse statistique modifiée devrait être effectuée, par exemple, pour déterminer la longueur de la cellule moyenne.
6. Infection Assay
NOTE: Le test d'infection des semis a été visualisé précédemment dans ce journal 11. Il peut soit être réalisée à l' aide d' un haploïde, solopathogenic souche de fond tels que SG200 10 ou par mélange des partenaires d'accouplement compatibles qui à la fois porteurs de la mutation.
- Cultiver au moins 40 plants de maïs parsouche pendant 7 jours à un cycle lumineux de 16 h, 200 uE, 28 ° C / 22 ° C (jour / nuit). Ils devraient être au stade 3 feuilles et 10-15 cm de hauteur à jour de l'infection.
- Deux jours avant l'infection, démarrer une pré-culture des souches dans 5 ml YEP-Light sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C. Cultiver une culture principale dans 50 ml YEP-Light jusqu'à DO 600 = 1,0 (division cellulaire rate = 2 h, 3 divisions permettent au minimum, peut être fait O / N).
- Centrifuger les cellules de culture de 50 ml à 1500 g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. Laver 3 fois avec H 2 O. stérile Resuspendre les cellules dans H 2 O stérile à une DO 600 de 3,0. Si nécessaire, mélanger les partenaires d'accouplement.
- Injecter 250 - 500 pl de suspension cellulaire dans la tige de 7 jours plants âgés de maïs à l'aide d'une petite seringue. Utilisez H 2 O stérile comme témoin. Gardez les plants infectés pendant 7-14 jours supplémentaires dans les mêmes conditions de température et de lumière. Note du phénotype de chaque plante unelon en bonne santé, la chlorose, la formation des anthocyanes, les petites tumeurs, tumeurs de grande taille, les plantes mortes 10.
NOTE: La notation peut être fait aussi tôt que 7 jours et répété à 14 jours pour suivre l'infection au fil du temps.
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Representative Results
Les constructions de deletion pour les quatre gènes codés dans chitinolytiques U. maydis génome a été généré par clonage Golden Gate utilisation de la cassette Hygr pour la suppression de CTS1, le NATR pour la suppression de CTS2, la cassette d'G418R pour la suppression de CTS3 et CBXR pour la suppression de CTS4 20. Une vue d' ensemble de la stratégie de remplacement de gène est illustrée par la suppression de CTS3 (figure 1). Les mutants simples et doubles de CTS1 avec un second gène chitinolytique ont été générés de manière séquentielle avec les mêmes constructions génétiques dans deux milieux différents pour l' analyse du rôle dans la virulence de chitinases. Deux milieux de contrainte différentes ont été utilisées: AB33 permet l' induction de la croissance filamenteuse, la première étape vers la pathogénicité 23, SG200 est une souche pathogène solo qui permet une maladie rapide marquant 10 CTS3 -deletion construire dans la souche de fond appropriée, des colonies isolées de la deuxième plaque de sélection ont été testés pour la suppression correcte par PCR de diagnostic (tableau 1) et Southern blot (figure 3). Il est intéressant, pour CTS3 le taux de recombinaison homologue était beaucoup plus élevé dans SG200 que dans AB33, mais cette différence n'a pas été systématiquement observée dans les suppressions des autres chitinases.
La vérification des contraintes strictes assure une seule insertion de la suppression construire à la position désirée. Cependant, la modification supplémentaire tel que des mutations ponctuelles peuvent rester inaperçues, ce qui pourrait induire en erreur l'interprétation des phénotypes. Par conséquent, au moins deux transformants indépendants sont phénotypées.
figue ure 1. Vue d' ensemble de la stratégie de suppression illustrée par CTS3. Cet aperçu schématique comprend la suppression construire avec flanc amont (UF), flanc aval (DF), et la cassette de résistance à la généticine (G418R), le locus génomique de type sauvage (WT ) et CTS3 mutant de deletion et toutes les amorces ainsi que les sites de restriction utilisés pour la vérification de la souche. Les premiers résultats de la PCR dans le diagnostic d'un produit que si la copie du gène de type sauvage est présent, les deux deuxièmes PCR de diagnostic conduisent à des produits si la cassette de résistance a été correctement intégré. Pour le transfert de Southern de l'ADN génomique est digéré par PstI, les sondes couvrent l'UF et DF (barres rouges) conduisant à la détection d'une bande de 6,7 kb dans le type sauvage et deux bandes de 5,6 kb et de 2,0 kb du mutant. En outre, la sonde DF reconnaît faiblement un produit de 2,6 kb. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Vérification microscopique de protoplastes réaction. (A) des cellules de type sauvage non traitées (FB2) apparaissent en forme de cigare. (B) Après le traitement avec la paroi cellulaire des enzymes dégradant (ici pour 30 min), l'apparition de sphères rondes à une extrémité (s) et le bar-bell comme des structures (b) indique que la dégradation de la paroi cellulaire a commencé. Finalement les protoplastes sont complètement ronde (r), qui est due à l'absence de paroi cellulaire. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fig ure 3. Southern blot de l' ADN génomique CTS3 suppression. A été digéré avec PstI. Les deux flancs ont été marqués, mélangés dans des rapports équimolaires et utilisé comme une seule sonde. Dans le SG200 de type sauvage et les suppressions de la chitinases CTS1 et CTS2, une seule bande de 6,7 kb est détecté. Dans les suppressions de CTS3 (g et k), deux bandes de 5,6 kb et 2,0 kb sont visibles indiquant la suppression correcte de CTS3. Une bande supplémentaire de 2,6 kb peut être visualisé par une surexposition massif. Cela correspond à un fragment qui est reconnu par un chevauchement de seulement 100 pb de la sonde de flanc aval. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Certaines mutations conduisent à des défauts évidents de croissance qui peuvent être détectés au microscope. Dans les suppressions chitinase, mutants simples ne présentaient pastout défaut évident, alors que CTS1 / 2 doubles mutants a montré une séparation cellulaire prononcée défaut 20. La coloration des septa a montré que la cytocinèse a été achevée mais les cellules restent connectés probablement par l' intermédiaire de la chitine résiduelle (figure 4 à partir Langner et al. , 2015). Un phénotype similaire de croissance microscopique est connue pour la suppression de khd4 24, un gène codant pour une protéine de liaison à l' ARN médiation renouvellement de l' ARN post-transcriptionnelle des gènes impliqués dans la morphologie et la pathogénicité 25.
La figure 4. Une analyse microscopique de mutants de deletion. La morphologie cellulaire et la cloison formation des souches chitinase de deletion. CTS1 / 2 Ô souches présentent un défaut de séparation des cellules et former de gros agrégats, ce qui est pas due à un manque de formation de cloison. Primaire et secondairesepta (voir l'élargissement 5x dans les encadrés) ont été colorées avec calcofluor blanc (CW) avant la microscopie. Les barres d'échelle = 10 pm. Ce chiffre est reproduit avec la permission de Langner et al. 2015 cellule eucaryote 20. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour tester la contribution de chitinases à la virulence, des tests d'infection des semis ont été effectués en utilisant les mutants de la souche SG200 fond. Tandis que les mutants dans khd4 ont été réduits dans la virulence, la suppression des chitinases n'a pas affecté l' infection des plants de maïs (figure 5) 20,25.
La Figure 5. Infection dosage des mutants de deletion. Disease Rating deles semis de maïs 9 jours après l' infection par le U. respectif maydis souches. (A) Les symptômes macroscopiques qui sont utilisés pour la maladie de pointage. (B) Deux transformants indépendants ont été testés pour chaque souche (N> 100). Tous les mutants de chitinase déficient (1/2 / 3Δ: endochitinases mutants triples, 4Δ: simple mutant N-acétylglucosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: mutant quadruple) infectées de la plante hôte conduisant à la formation de la tumeur lourde observée dans les infections de type sauvage avec la souche SG200 solopathogenic. En revanche, une souche portant une délétion du gène codant pour la protéine de liaison à l' ARN Khd4 a été réduite dans la virulence 24 comme indiqué précédemment. Les barres d'erreur indiquent l'écart-type de trois expériences indépendantes. Ce chiffre est modifié avec la permission de Langner et al. 2015 cellule eucaryote 20. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher une grandeversion r de ce chiffre.
| génétiques | 1 er diagn. PCR (exclu / testé) | 2 e diagn. PCR (confirmé / testé) | Du sud (confirmé / testé) | % RECOMB. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 CTS1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 CTS1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tableau 1:. Vérification de contrainte pour la suppression de CTS3 Le CTS3 du gène de la chitinase a été supprimé dans quatre différents contextes génétiques pour permettre des études de la croissance filamenteuse (AB33) et l' infection (SG200) dans des deletions uniques et multiples.
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Discussion
Ce protocole décrit comment générer des mutants de délétion pour les études de génétique inverse en U. maydis. Le point de départ est une construction de deletion qui contient des séquences flanquantes du gène d'intérêt contenant des séquences d'environ 1 kb en amont du début et en aval du codon d' arrêt ainsi que d' une cassette de résistance approprié , car il a déjà été optimisé 7,9 . Les constructions doivent être générées individuellement pour chaque gène et soigneusement vérifié pour les erreurs de séquence avant la suppression du gène. Des mutations ponctuelles dans les flancs peuvent provoquer des altérations indésirables dans la séquence génomique, en particulier si les flancs atteignent dans le gène voisin ou la mutation modifie des éléments régulateurs. Cela affecterait tous les transformants et peut provoquer des phénotypes et des effets secondaires non liés à la suppression du gène désiré.
Lors de la planification de la stratégie de suppression, le phénotype attendu doit être considéré de choisir l'arrière-plan génétique. Dans le cas présent, AB33 23 et SG200 10 ont été choisis pour permettre de tester des phénotypes dans le commutateur et plante infection morphologique. De même, beaucoup d' autres lectures-outs peuvent être d'intérêt, par exemple des fusions avec CTS1 sont employés dans l' exportation de protéines hétérologues 14,26, et un fond de tension avec fluorescence taggés rrm4 permet l' analyse du transport de l' ARN sur endosomes 27,28.
Lors de la vérification de la souche, les PCR de diagnostic à haut débit permettent une réduction rapide du nombre de candidats à tester dans le transfert de Southern plutôt laborieux. En particulier, la première PCR de diagnostic permet d'exclure des candidats contenant encore la copie de type sauvage du gène et empêche ainsi l'utilisation massive de phénol toxiques dans les préparations ADNg. Dans un cas standard avec un gène non essentiel, environ la moitié des colonies peut contenir le gène de type sauvage. Cette présélection peut être d'un grand intérêt pour les gènes avec des phénotypes de croissance potentiellement nuisibles. Des centaines de candidats peuvent rapidement être sélectionnés.
Si tous les candidats contiennent la copie de type sauvage, la suppression du gène est très probablement mortelle. Cela peut être confirmé par la suppression d' une copie dans une souche diploïde de fond (par exemple D132) et analyse de la ségrégation après la germination des téliospores 29. Alternativement, une stratégie de suppression conditionnelle à l'aide d'un promoteur inductible peut être choisi pour suivre le phénotype mutant. Cependant, la contamination résultant également de la méthode brute à base de NaOH pour la préparation ADNg peut interférer avec la PCR et conduire à des faux négatifs à savoir les candidats ne montrent pas une bande et sont donc conservées même si elles contiennent le gène. Ceci peut être exclu par l'essai d'un gène de contrôle avec un produit de taille comparable dans une réaction de PCR multiplex indépendant ou par PCR avec les deux amorces et d'amorces spécifiques d'un gène d'un gène de contrôle qui aboutissent à un plus grand fragment.
content "> Si un mutant est déjà disponible, par exemple, CTS1 Δ 30 ou rrm4 Δ, la génération de souche de versions marquées peut être accélérée par le remplacement de la délétion du gène de résistance cassette (par exemple Hygr) dans le génome avec une nouvelle construction contenant, par exemple, la rrm4 marqué par fluorescence et un marqueur de résistance différente (par exemple NATR). Dans ce cas, les transformants peuvent être sélectionnés par la perte du marqueur de résistance initiale 9. les candidats corrects sont résistants seulement contre le nouvel antibiotique (nourseothricine) et ont perdu leur résistance initiale (hygromycine ). en outre, la complémentation du phénotype mutant en trans peut être réalisée pour vérifier la fonctionnalité des constructions marquées 30,31.La stratégie de délétion du gène et de la modification décrite ici offre un outil fiable et exacte dans l' analyse génétique de U. maydis. Pour cependant plusieurs suppressions, la souche genération peut obtenir du temps, étant donné que les modifications doivent être effectuées de manière séquentielle. Par conséquent, comme un outil complémentaire, l' année dernière le système CRISPR-Cas a été établi pour U. maydis 32. Il offre la possibilité de perturber plusieurs gènes simultanément et est un excellent ajout à la boîte à outils génétique de U. maydis.
En résumé, le protocole de manipulation génétique et U. maydis génération de souche décrite ici est une méthode robuste qui a été largement utilisé dans la communauté depuis des années. Avec la collection complète de modules de cassettes de résistance respective, il permet toutes sortes de génie génétique dans ce champignon, abordant diverses questions allant de base à la recherche appliquée.
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Acknowledgments
Remerciements particuliers à Dr. Benedikt Steuten pour la lecture critique du manuscrit. Le travail original sur les chitinases a été réalisée par le Dr Thorsten Langner. Le laboratoire du VG est pris en charge par le Pôle d'excellence en sciences végétales (CEPLAS, DFG EXC 1028) et ICSOB, le laboratoire de KS est soutenu par ICSOB. KB est soutenu par ICSOB. Les activités scientifiques du Centre des sciences de la bioéconomie (ICSOB) ont été soutenus financièrement par le Ministère de l'innovation, des sciences et de la recherche dans le cadre de la NRW Strategieprojekt ICSOB (n ° 313 / 323-400-00213). LF est soutenu par une bourse de doctorat du DFG Groupe international de formation de recherche 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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