Summary

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em> Ustilago maydis</em> Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Published: September 30, 2016
doi:

Summary

Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.

Abstract

Gene delezione gioca un ruolo importante nell'analisi della funzione del gene. Uno dei metodi più efficaci per interrompere geni in modo mirato è la sostituzione dell'intero gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Durante la ricombinazione omologa, lo scambio di DNA avviene tra sequenze con alta affinità. Pertanto, le sequenze genomiche lineari fiancheggianti un gene bersaglio possono essere utilizzati per indirizzare specificamente un marcatore selezionabile al sito di integrazione desiderato. estremità smussata della delezione costrutto attivano sistemi di riparazione del DNA della cellula e, quindi, promuovere l'integrazione del costrutto sia tramite ricombinazione omologa o non omologa-end-adesione. Negli organismi con efficiente ricombinazione omologa, il tasso di successo delezione del gene può raggiungere più del 50% rendendo questa strategia un sistema gene distruzione di valore. Il fungo fuliggine Ustilago maydis è un modello microorganismo eucariote che mostra come ricombinante omologo efficienteionico. Fuori suoi circa 6.900 geni, molti sono stati funzionalmente caratterizzati con l'aiuto di mutanti di delezione, e ripetuta di pezzi gene tentativi punti in funzione essenziale del gene. caratterizzazione successiva della funzione del gene per codifica con marcatori fluorescenti o mutazioni di domini previsti si basa anche sullo scambio di DNA mediante ricombinazione omologa. Qui, vi presentiamo il U. maydis strategia di generazione ceppo in dettaglio utilizzando l'esempio più semplice, la delezione del gene.

Introduction

Ustilago maydis è un fungo modello di fitopatogeni che è stato ampiamente studiato per decenni 1,2. Esiste in due morfologie, una fase non patogeno di lievito-simili e una filamentosa, forma infettiva 3. Scoperte rivoluzionarie universali come i meccanismi di ricombinazione e riparazione del DNA omologhe sono state fatte in fase di crescita del lievito-simile di questo fungo 4. Inoltre, l'interruttore morfologica al filamento e di virulenza fattori infettivi importanti per l'infezione sono ben caratterizzati 5,6. La conoscenza molecolare crescente sulla biologia e la virulenza di questo fungo fuliggine si basa su una strategia di sostituzione genica semplice 7-9 supportato da un ottimo annotazione del genoma 10 e la facilità di genetica inversa utilizzando, ad esempio, la raccolta plasmide ben organizzata presso il nostro Istituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardizzati, saggi di infezione rapidi nel mais seedlings consentono studi dettagliati di patogenicità fattori 11.

Il genoma di U. maydis contiene circa 6.900 geni 10. Per studiare la loro funzione, possono essere eliminati singolarmente o in combinazione a causa di un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Regioni fiancheggianti di circa 1 kb contenenti estremità perfettamente omologhe sono ideali per i tassi di ricombinazione omologa superiore al 50%, ma già 250 bp con estremità non omologhe consentono un certo grado di corretta integrazione del costrutto 9. Attualmente, cinque diverse cassette di resistenza, HYGR, cbxR, NATR, G418R, e phleoR mediare resistenza contro Hygromycin, carbossina, nourseothricin, G418 e phleomycin, sono impiegati per selezionare per trasformanti 7,9. Inoltre, la resistenza igromicina è stata sviluppata in una cassetta riciclabile (FRT-HYGR) che può essere rimosso mediante l'espressione transiente di un eterologa ricombinasi FLP 12. Questo permette la rimozione della cassetta di resistenza e quindi in teoria illimitato modificazioni genetiche. Phleomycin è mutageno 13, in modo che con le nuove cassette, in particolare riciclabile cassette HYGR, l'uso di phleoR sta diminuendo. Mutanti quadruple possono così essere generati utilizzando gli altri quattro cassette, ma per mutanti quintuple, il sistema FRT-HYGR è consigliato 14.

Questa strategia generale gene delezione è stato trasferito con successo ad altri funghi Smut come Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, o U. esculenta 17 e offre quindi la possibilità di ulteriori applicazioni in organismi geneticamente ancora intrattabili con un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Inoltre, gli organismi privi ricombinazione omologa possono essere modificati per migliorare l'ingegneria genetica come esemplificato dalla delezione di geni coinvolti nella non-omologa-itd-entrare in Neurospora crassa 18,19.

Qui si descrive la strategia di eliminazione del gene pubblicato per U. Maydis 7,9 in dettaglio sperimentale con un focus sulla verifica rapida e accurata dei candidati. A titolo di esempio, usiamo le chitinasi fungine e rappresentare la generazione dei singoli mutanti, nonché l'eliminazione più ceppi 20,21. Chitinasi sono esempi interessanti, perché agiscono sulla chitina nella parete cellulare rigida. è richiesto il rimodellamento della parete cellulare di cambiamenti morfologici durante la divisione cellulare, passare alla crescita filamentosa, e formazione di spore. Quindi, in mutanti di delezione può aspettare fenotipi in tutto il ciclo di vita.

Protocol

1. Generazione di eliminazione costrutti Generare un plasmide contenente la delezione costrutto (Figura 1) comprendendo una rispettiva 1 kb fianco upstream (UF) e sul fianco valle (DF) ciascuno e la cassetta di resistenza appropriata fiancheggiata da siti di restrizione taglio smussato. NOTA: Qualsiasi strategia clonazione può essere utilizzato (per la clonazione vedi riferimento 22) si consiglia di Golden Gate clonazione per tali plasmidi 9. Excise la …

Representative Results

I costrutti di delezione per tutti i quattro geni chitinolytic codificati nel U. maydis genoma sono stati generati dal Golden Gate clonazione utilizzando la cassetta HYGR per l'eliminazione della CTS1, il NATR per l'eliminazione della CTS2, cassetta G418R per l'eliminazione della cts3 e il cbxR per l'eliminazione di cts4 20. Una panoramica generale della strategia di sostituzione g…

Discussion

Questo protocollo descrive come generare mutanti di delezione per studi di genetica inversa a U. maydis. Il punto di partenza è un costrutto delezione che contiene sequenze fiancheggianti del gene di interessi contenente sequenze di circa 1 kb a monte dell'inizio e valle del codone di stop, nonché una cassetta di resistenza appropriata come è stato precedentemente ottimizzato 7,9 . I costrutti devono essere generate singolarmente per ogni gene e controllate con cura per errori di sequenza prim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un ringraziamento particolare al Dr. Benedikt Steuten per la lettura critica del manoscritto. L'opera originale sulle chitinasi è stato effettuato dal Dr. Thorsten Langner. Il laboratorio di VG è supportato dal Cluster di Eccellenza in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, il laboratorio di KS è supportato da BioSC. KB è supportato da BioSC. Le attività scientifiche del bioeconomia Science Center (BioSC) sono stati sostenuti finanziariamente dal Ministero per l'Innovazione, la Scienza e la ricerca nell'ambito del NRW Strategieprojekt BioSC (n ° 313 / 323-400-00213). LF è sostenuto da una borsa di studio di dottorato del 1525 iGRADplant DFG International Group formazione alla ricerca.

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid) Sigma Aldrich A-9878
Bacto Agar  BD 214010 alternatively use local supplier
Bacto Peptone BD 211677 alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract  BD 212750 alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O Grüssing GmbH 10234 alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) Sigma Aldrich P-2250
Carboxin  Sigma Aldrich 45371
Casamino acids  BD 223050
Cholinchlorid Sigma Aldrich C-1879
Citric acid ChemSolute 24,321,000 alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O Fluka 61240 alternatively use local supplier
D(+)Sucrose  Roth 4621.1 alternatively use local supplier
DNA degr. free acid  Sigma-Aldrich D-3159
EDTA Sigma Aldrich E4378
FeCl3*6H2O Grüssing GmbH 10288 alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt Sigma Aldrich A1720
Trichoderma lysing enzymes Sigma Aldrich L1412
Glucose Caelo 2580 alternatively use local supplier
Glycerin  Fisher Chemical G065015 alternatively use local supplier
H3BO3 AppliChem A2940 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3393-50KU
Hygromycin B-solution Roth 1287.2 Dangerous substance. 
KCl VWR 26764298 alternatively use local supplier
KH2PO4 AppliChem A3620 alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree Merck 7487-88-9 Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O AppliChem A2087 alternatively use local supplier
myo-Inositol Sigma Aldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2O AppliChem A2937 alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O Roth 0274.2 alternatively use local supplier
Na2SO4 Grüssing GmbH 12174 alternatively use local supplier
NaCl Fisher Chemical S316060 alternatively use local supplier
NaOH ChemSolute 13,751,000 alternatively use local supplier
NH4NO3 Roth K299.1 alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid) Sigma Aldrich N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate   Werner BioAgents 5,001,000
Nutrient broth  Difco local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 Sigma Aldrich P3803 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG) Sigma Aldrich P-3640
Potassium acetate AppliChem 121479 alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid) Sigma Aldrich P-9755
Riboflavin  Sigma Aldrich R4500
RNaseA Sigma Aldrich R5503
SDS Roth Cn30.3 alternatively use local supplier
small syringe BD 300300 alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm VWR 28145-477 alternatively use local supplier
Sorbitol Roth 6213.1 alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride Serva 36020.02 alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate Fisher Chemical S332060 alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane VWR 103156X alternatively use local supplier
Tris hydrochloride Roth 9090.4 alternatively use local supplier
Triton X-100  Serva  37240 alternatively use local supplier
ZnCl2 Fluka 96470 alternatively use local supplier
Name Company Catalog Number Comments
Composition of solutions/preparation of material Composition of solutions
Carboxin Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418) Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
Heparin Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution  0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight 1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8 Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG 40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 8 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase 10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2 mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

References

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Bösch, K., Frantzeskakis, L., Vraneš, M., Kämper, J., Schipper, K., Göhre, V. Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions. J. Vis. Exp. (115), e54522, doi:10.3791/54522 (2016).

View Video