Vi beskriver en robust genet erstatning strategi for å genetisk manipulere sote sopp Ustilago maydis. Denne protokollen forklarer hvordan å generere delesjonsmutanter å undersøke smitte fenotyper. Den kan utvides til å modifisere gener i enhver ønsket måte, for eksempel ved å legge til en sekvens som koder for en fluorescerende protein tag.
Gene sletting spiller en viktig rolle i analysen av genfunksjon. En av de mest effektive metoder for å forstyrre gener i en målrettet måte er utskifting av hele genet med en selekterbar markør via homolog rekombinasjon. I løpet av homolog rekombinasjon, utveksling av DNA finner sted mellom sekvenser med høy likhet. Derfor kan lineære genomiske sekvenser som flankerer et målgen kan brukes for spesifikt å dirigere en selekterbar markør til den ønskede integreringssete. Butte ender av konstruksjonen slettingen aktiverer cellens DNA reparasjonssystemer og derved fremmer integrering av konstruksjonen enten via homolog rekombinasjon eller ved ikke-homolog-ende-sammenføyning. I organismer med effektiv homolog rekombinasjon, kan graden av vellykket genet delesjon nå mer enn 50% gjør denne strategien en verdifull gen avbrudd system. Den sote sopp Ustilago maydis er en eukaryot modell mikroorganisme som viser en slik effektiv homolog rekombinantion. Ut fra sine ca 6900 gener, mange har blitt funksjonelt preget med hjelp av delesjonsmutanter, og gjentatt svikt i genet erstatning forsøk punkter viktig funksjon av genet. Påfølgende karakterisering av genet funksjon ved å merke med fluorescerende markører eller mutasjoner av predikerte domener er også avhengig av DNA utveksling via homolog rekombinasjon. Her presenterer vi U. maydis belastning generasjon strategi i detalj ved hjelp av de enkleste eksempel genet sletting.
Ustilago maydis er en fytopatogene modell sopp som har blitt studert i flere tiår 1,2. Det finnes i to morfologi, en gjær-aktig, ikke-patogene scenen og en trådformede, smittsomme skjema 3. Universal gjennombrudd funn som homolog rekombinasjon og DNA-reparasjonsmekanismer ble gjort i gjær-lignende vekst stadium av denne soppen 4. Videre morfologiske bryteren til smittsomme filament og virulensfaktorer viktige for smitte er godt karakterisert 5,6. Den økende molekyl kunnskap om biologi og virulens av denne sote sopp er avhengig av en enkelt gen erstatning strategi 7-9 støttet av en utmerket genom merknad 10 og den enkle revers genetikk bruker, for eksempel den velorganiserte plasmid samlingen på vårt institutt (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserte, raske smitteforsøk i mais seedlings tillate detaljerte studier av patogenitet faktorer 11.
Genomet til U. maydis inneholder rundt 6900 gener 10. For å studere deres funksjon, kan de slettes enkeltvis eller i kombinasjon på grunn av en effektiv homolog rekombinasjon system. Flankerende regioner av omtrent 1 kb inneholdende en perfekt homologe ender er ideelle for forekomst av homolog rekombinasjon større enn 50%, men allerede 250 bp med ikke-homologe ender tillate en viss grad av riktig integrering av konstruksjonen 9. Foreløpig fem forskjellige motstands kassetter, hygromete, cbxR, natR, G418R og phleoR formidling motstand mot hygromycin, karboksin, nourseothricin, G418 og phleomycin, er ansatt for å velge for trans 7,9. I tillegg har hygromycin resistens blitt utviklet til en resirkulerbar kassett (FRT-hygromete) som kan fjernes ved den forbigående ekspresjon av et heterologt FLP rekombinase 12. Dette tillater fjerning av motstanden kassetten og derved i teorien ubegrenset genetiske modifikasjoner. Phleomycin er mutagent 13, slik at med de nye kassetter, spesielt den resirkuler hygromete kassetten, bruk av phleoR er avtagende. Firedoble mutanter kan således bli generert ved hjelp av de øvrige fire kassetter, men for firemannsrom mutanter, blir FRT-hygromete system anbefales 14.
Denne generelle strategien genet sletting har blitt overført til andre sote sopp som Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, eller U. esculenta 17 og derfor tilbyr muligheter for videre søknader i ennå genetisk låste organismer med en effektiv homolog rekombinasjon system. Videre kan organismer som mangler homolog rekombinasjon bli modifisert for å forbedre genetisk modifisering som eksemplifisert ved sletting av gener som er involvert i ikke-homolog-end-bli med i Neurospora crassa 18,19.
Her beskriver vi publiserte genet sletting strategi for U. maydis 7,9 i eksperimentell detalj med fokus på rask og nøyaktig verifisering av kandidatene. Som et eksempel, bruker vi sopp kitinaser og skildrer generasjonen av enkelt mutanter samt flere sletting stammer 20,21. Kitinaser er interessante eksempler, fordi de handler på kitin i den stive celleveggen. Celleveggen ombygging er nødvendig for morfologiske endringer under celledeling, bytte til trådformede vekst, og sporedannelse. Derfor, i delesjonsmutanter fenotyper gjennom hele livssyklusen kan forventes.
Denne protokollen beskriver hvordan å generere delesjonsmutanter for omvendt genetiske studier i U. maydis. Utgangspunktet er en delesjon konstrukt som inneholder flankerende sekvenser av genet interesseinneholdende sekvenser av omtrent 1 kb oppstrøms for start og nedstrøms fra stopp-kodonet, så vel som en passende motstand kassett som den tidligere ble optimalisert 7,9 . Konstruksjonene har å være individuelt genereres for hvert gen og nøye kontrollert for sekvensfeil før sletting av genet. …
The authors have nothing to disclose.
Spesiell takk til Dr. Benedikt Steuten for kritisk lesing av manuskriptet. Den opprinnelige arbeidet med kitinaser ble utført av Dr. Thorsten Langner. Laboratoriet av VG støttes av Cluster of Excellence i plantevitenskap (CEPLAS, DFG EXC 1028) og BioSC, er laboratoriet av KS støttet av BioSC. KB er støttet av BioSC. De vitenskapelige aktiviteter av bioøkonomi Science Center (BioSC) ble finansielt støttet av departementet for innovasjon, vitenskap og forskning innenfor rammen av NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF er støttet av en doc av DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
Casamino acids | BD | 223050 | |
Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |