Summary

Un<em> In vitro</em> Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d'impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Published: December 08, 2016
doi:

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique sépare la circulation systémique du système nerveux central (SNC) 1 3. Il fournit une barrière physique qui empêche la libre circulation des cellules et la diffusion des molécules solubles dans l'eau et protège le cerveau contre les agents pathogènes et des substances potentiellement nocives. En plus de sa fonction de barrière, la BHE permet l'apport d'oxygène et de nutriments pour le parenchyme du cerveau, ce qui assure le bon fonctionnement du tissu neuronal. Propriétés fonctionnelles du BBB sont très réglementés par ses composants cellulaires et acellulaires, avec CEs hautement spécialisé étant son principal élément structurel. CEs de la BHE sont caractérisés par la présence de jonctions serrées (TJ) de complexes, le manque de fenestrations, très faible activité pinocytaire, et les mécanismes de transport actives en permanence. D'autres composantes du BBB La membrane basale CE, péricytes enrobage de l'endothélium, astrocytaires pieds d'extrémité et = par associémembrane basale de enchymal contribuent également au développement, la maintenance et le fonctionnement du BBB 2,4 6 et, de concert avec les neurones et les microglies, forment l'unité neurovasculaire (NVU), qui permet le bon fonctionnement du CNS 7-9.

Dans une variété de maladies neurologiques, telles que la neuro – dégénératives, des maladies inflammatoires ou infectieuses, la fonction de la BHE est compromise 2,5,10. Dysrégulation de TJ complexes et les mécanismes de transport moléculaire entraîne une augmentation de la perméabilité BBB, leucocytaire extravasation, l'inflammation et des lésions neuronales. Afin d'étudier les propriétés BBB dans de telles conditions physiopathologiques, divers modèles in vitro de BBB ont été établies 9,11,12. Ensemble, ils ont fourni des indications précieuses sur les changements de l'intégrité de la barrière, la perméabilité ainsi que des mécanismes de transport. Ces modèles utilisent des cellules endothéliales humaines, de souris, de rat, de porc ou de borigine ovine 13 18; les cellules endothéliales primaires ou de lignées de cellules sont cultivées soit en monoculture ou conjointement avec les péricytes et / ou des astrocytes dans le but d'imiter plus étroitement la BHE in vivo 19-25. Ces dernières années, la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) est devenu un outil largement accepté pour évaluer les propriétés de barrière endothéliale 26,27.

TEER reflète l'impédance au flux d'ions à travers la monocouche cellulaire et sa diminution fournit une mesure sensible de l'intégrité de la barrière endotheliale compromise et par conséquent une plus grande perméabilité. Divers systèmes de mesure de TEER ont été mis au point, y compris épithéliale Voltohmmeter (EVOM), Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS), et analyse en temps réel des cellules 15,28 30. TEER reflète la résistance au flux d'ions entre CEs adjacentes (voie paracellulaire) et est directement proportionnelle à laintégrité de la barrière. En impédance spectroscopie 27,31, impédance totale complexe (Z) est mesurée, qui fournit des informations supplémentaires sur l'intégrité de la barrière en mesurant Ccl. Ccl se rapporte au courant capacitif à travers la membrane cellulaire (transcellulaire passage): la couche cellulaire se comporte comme un condensateur dans le circuit électrique équivalent, la séparation des charges sur les deux côtés de la membrane et est inversement proportionnelle à l'intégrité de la barrière. Lorsqu'il est cultivé sur des inserts perméables, CEs adhèrent, prolifèrent et étalée sur la membrane microporeuse. Résiste à ce courant capacitif de fond de l'insert (qui lui-même agit comme un condensateur) et conduit à une baisse de la capacité jusqu'à ce qu'elle atteigne son niveau minimal. Elle est suivie par la mise en place de TJ complexes qui joint l'espace entre CEs adjacents. Cela restreint le flux d'ions à travers la voie paracellulaire et TEER augmente jusqu'à ce qu'il atteigne son plateau. Dans des conditions inflammatoires, cependant, le endothelial barrière est compromise: TEER diminue à mesure que les complexes TJ se perturbé et Ccl augmente à mesure que la composante capacitive de l'insert augmente à nouveau.

Notre mesure TEER utilise la surveillance automatisée des cellules 32 du système: il suit le principe de la spectroscopie d'impédance et étend ses applications précédentes. Ici, nous décrivons un modèle in vitro BBB qui permet l'étude des propriétés de barrière, y compris l'interaction de l' endothélium cérébral avec les cellules immunitaires; en particulier les lymphocytes T activés. De telles conditions physiopathologiques sont observées dans les maladies auto – immunes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et de son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto – immune 33-37. Ici, une étape cruciale est la transmigration des cellules T spécifiques de la myéline encéphalitogéniques à travers la BHE. Ceci est suivi par leur réactivation dans l'espace périvasculaire et l'entrée dans le parenchyme du cerveau, où ils recrutent d'autres cellules immunitaires et mel' inflammation diate et démyélinisation ultérieure 1,35,38. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales, les principaux constituants de la BHE, ne sont pas bien comprises. Notre protocole vise à combler cette lacune et donner de nouvelles perspectives sur les conséquences sur les cellules endothéliales ( par exemple, l' intégrité de la barrière et de perméabilité) lors de leur contact direct et interaction complexe avec les cellules T activées.

Le protocole décrit ici utilise des cellules du cerveau endothéliales microvasculaires de souris primaires, cultivées en monocouche sur des inserts perméables avec des membranes microporeuses. Les cellules endothéliales sont co-cultivées avec des cellules T CD4 +, qui peut être pré-activé soit polyclonale ou d'une manière spécifique de l' antigène. Co-culture de cellules T avec MBMECs pré-activé, mais pas naïf induit une diminution de la TEER et une augmentation de la CCl, qui fournit une mesure quantitative du dysfonctionnement et la rupture de la barrière MBMEC. La techniqueest non-invasive: il utilise intégré à la place d'électrodes de baguettes, qui empêchent perturbation majeure de la monocouche CE; il peut être utilisé pour surveiller la fonction de barrière sans l'utilisation de marqueurs cellulaires. Il effectue des mesures continues de manière automatisée et permet une évaluation indépendante des deux paramètres de barrière (TEER et Ccl) simultanément au fil du temps. Le procédé est également suffisamment sensible pour faire la distinction entre les différents niveaux d'activation des lymphocytes T et les effets de ces cellules T sur CEs.

Il peut être utilisé dans une large gamme de dosages fonctionnels: les différentes cytokines et / ou chimiokines impliquées dans les processus inflammatoires peuvent être ajoutés à la co-culture de MBMECs et les lymphocytes T; blocage des anticorps dirigés contre des molécules d'adhésion cellulaire de chaque côté de la CE, ou des cellules T peuvent être utilisées; et des inhibiteurs de marqueurs d'activation des lymphocytes T ou de leurs propriétés cytolytiques peuvent être ajoutés au cours de l'amorçage des cellules T ou de leur co-culture avec CEs. L'essai est également utile pour la transmigration des cellules Tdes essais, car il peut servir de contrôle de la qualité de l'intégrité de la monocouche MBMEC avant l'addition des cellules T. Tout cela fait de cette méthode un outil polyvalent et fiable pour étudier la BHE in vitro, avec un accent sur l'effet des lymphocytes T activés sur l' intégrité de la monocouche CE. Ceci est d'une importance particulière pour la compréhension des mécanismes de la perturbation BBB dans la pathogenèse des maladies auto-immunes, telles que MS et son modèle animal EAE, où, les cellules T encéphalitogéniques autoréactives traversent la BHE et provoquent une inflammation et des lésions neuronales.

Protocol

Pour toutes les expériences, les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans l'animalerie centrale à l'Université de Münster, selon les directives allemandes pour le soin des animaux. Toutes les expériences ont été réalisées selon les directives du comité d'éthique des animaux expérimentaux et approuvés par les autorités locales de Rhénanie du Nord-Westphalie, Allemagne (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolement…

Representative Results

La figure 1 donne un aperçu général du modèle BBB in vitro utilisé pour étudier l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales. L'expérience consiste en trois étapes principales. La première étape est l'isolement des MBMECs primaires provenant corticales du cerveau, et leur culture pendant cinq jours. Lorsqu'ils atteignent la confluence de la plaque de culture cellulaire, MBMECs sont trypsinisées et réensemencées s…

Discussion

Plusieurs étapes du protocole décrit sont essentiels pour une expérience réussie. Pendant l'isolement de MBMEC initial et de la culture, il est crucial que le travail est effectué dans des conditions stériles, autant que possible, afin d'éviter la contamination de la culture cellulaire avec des spores fongiques ou bactéries. Afin d'obtenir une culture pure de CEs, il est recommandé d'utiliser un milieu contenant Puromycin pour les trois premiers jours, ce qui permet la survie des CEs, mais pas l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Annika Engbers et Frank Kurth pour leur excellent soutien technique et Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) pour des discussions utiles concernant les mesures de TEER. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projet A03 HW et LK, CRC TR128, projets A08; Z1 et B01 à LK et HW, et le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (Faculté de médecine de Münster) numéro de subvention Kl2 / 2015/14 à LK.

Materials

cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

References

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -. C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -. O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence?. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide – How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -. J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  40. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  41. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  42. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  43. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
  44. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  45. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -. J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  46. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  47. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  48. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  49. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
  50. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

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Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

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