Summary

<em> במבחנה</em> דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Published: December 08, 2016
doi:

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

מחסום דם-המוח מפריד בין המחזור המערכתי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 3. הוא מספק מכשול פיזי מעכב את התנועה החופשית של תאים ואת דיפוזיה של מולקולות מסיסות במים מגן על המוח מפני פתוגנים ואפשרות חומרים מזיקים. בנוסף תפקוד המחסום שלה, BBB מאפשרת אספקה ​​של חמצן וחומרים מזינים את המוח parenchyma, אשר מבטיח תפקוד תקין של רקמות עצביות. תכונות פעילות של BBB מוסדרות מאוד על ידי המרכיבים התאיים ו acellular שלה, עם ECS מאוד מיוחדת להיות האלמנט המבני העיקרי שלה. ECS של BBB מאופיינת על ידי הנוכחות של צומת חזק (TJ) מתחמים, חוסר fenestrations, פעילות pinocytic נמוכה מאוד, ואת מנגנוני הובלה פעילים באופן קבוע. רכיבים אחרים של BBB קרום המרתף EC, pericytes הטבעה האנדותל, הרגליים בסוף astrocytic ו = נקוב הקשוריםקרום במרתף enchymal גם לתרום לפיתוח, תחזוקה ותפקוד של BBB 2,4 6, ויחד עם נוירונים microglia, מהווים את יחידת העצבים וכלי הדם (NVU), המאפשר תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית 7 9.

במגוון מחלות נוירולוגיות, כגון ניווניות, מחלות דלקתיות או זיהומיות, הפונקציה של BBB נפגעת 2,5,10. חוסר וויסות של TJ מתחמי מנגנוני הובלה מולקולרי מוביל גדל חדירות BBB, extravasation לויקוציטים, דלקת ופגיעה עצבית. על מנת ללמוד נכסים BBB בתנאים pathophysiological כאלה, שונים במבחנה מודלים BBB הוקמו 9,11,12. יחד הם סיפקו תובנות רבות ערך את השינויים של מחסום שלמות, חדירות וכן מנגנוני הובלה. מודלים אלה מעסיקים תאי אנדותל של אדם, עכבר, חולדה, חזירי או בהמוצא כבש 13 18; תאי אנדותל ראשוני או שורות תאים בתרבית או כמו monoculture או יחד עם pericytes ו / או האסטרוציטים כדי לחקות באופן הדוק יותר את BBB in vivo 19 25. בשנים האחרונות, מדידת ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) הפכה לכלי מקובל להעריך נכסי מכשול אנדותל 26,27.

TEER משקף את עכבת שטף היונים על פני בשכבת תא הירידה שלה מספקת מדד רגיש של שלמות מחסום אנדותל שנפרץ ומכאן חדירות מוגברת. מערכות המדידה TEER שונים פותחו, כולל אפיתל Voltohmmeter (EVOM), חישה עכבה Cell-המצע חשמלי (ECIS), וניתוח התא בזמן אמת 15,28 30. TEER משקף את התנגדות שטף היון בין ECS הסמוכים (מסלול paracellular) והוא ביחס ישרמחסום שלמות. הספקטרוסקופיה עכבת 27,31, עכבה הכוללת מורכבת (Z) נמדדה, אשר מספקת מידע נוסף על שלמות המחסום ידי מדידת Ccl. Ccl מתייחס נוכחי קיבולי דרך קרום תא (מסלול transcellular): שכבת התאים מתנהגת כמו קבלים במעגל השווה החשמלי, הפרדת האישומים משני צידי הממברנה ואת עומדת ביחס הפוך על שלמות המכשול. כאשר גדל על מוסיף חדיר, ECS לדבוק, להתרבות על פני קרום microporous. זה מתנגד זרם קיבולי הרקע של הכנס (שבעצמו מתנהג כמו קבלים) ומוביל לירידת הקיבול עד שהוא מגיע לרמה המינימאלית שלה. זה ואחריו הקמת TJ מתחמים כי חותם מן החלל בין ECS הסמוך. זה מגביל את שטף היון דרך מסלול paracellular, ו TEER מגדילה עד שהוא מגיע לרמה שלה. בתנאים דלקתיים, אולם endotheliמחסום אל נפגע: TEER יורדת ככל TJ קומפלקסים לקבל שיבש Ccl מתחזקת ככל רכיב הקיבולים של הכנס עולה שוב.

מדידת TEER שלנו עושה שימוש במערכת תא ניטור 32 אוטומטית: מסקנה היא עיקרון ספקטרוסקופיה עכבה ומרחיב הבקשות הקודמות שלה. כאן אנו מתארים מודל BBB במבחנה המאפשר חקר תכונותיהם המחסום, כולל האינטראקציה של האנדותל מוח עם תאי חיסון; בפרט תאי T מופעלים. תנאי pathophysiological כאלה הם נצפו מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית, כגון טרשת נפוצה ודלקת encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי במודל חיה שלה 33 37. כאן, צעד חיוני הוא הגלגול של encephalitogenic, תאי T ספציפי-המיאלין ברחבי BBB. זה ואחריו מחדש שלהם במרחב perivascular וכניסת parenchyma המוח, שם הם מגייסים תאי חיסון אחרים ואותידלקת diate ו demyelination עוקבת 1,35,38. עם זאת, מנגנונים מולקולריים של האינטראקציה בין תאי T כגון ותאי האנדותל, המרכיבים העיקריים של BBB, אינם מובנים היטב. הפרוטוקול שלנו שואף למלא את הפער הזה ולתת תובנה חדשות על ההשלכות על תאי האנדותל (כלומר, שלמות מחסום וחדירות) במגע הישיר שלהם גומלין מורכב עם תאי T מופעלים.

הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבר העיקרי, גדל כמו בשכבה על מוסיף חדיר עם ממברנות microporous. תאי האנדותל הם שיתוף תרבותי עם תאי CD4 + T, אשר ניתן המופעל מראש או polyclonally או בצורה אנטיגן ספציפי. עמית תרבות MBMECs עם המופעל מראש, אבל לא נאיבי בתאי T גורם לירידה TEER וגידול Ccl, אשר מספק מדד כמותי של הפרעה בתפקוד מחסום MBMEC. הטכניקהפולשני הוא: היא משתמשת מובנהית במקום אלקטרודות מקל, אשר למנוע הפרעה עיקרית של monolayer EC; ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תפקוד מחסום ללא שימוש סמני תא. זה גורם מדידה רציפה באופן אוטומטי ומאפשר הערכה עצמאית של שני פרמטרים מחסומים (TEER ו CCL) בו זמנית לאורך זמן. השיטה היא גם רגיש מספיק כדי להבחין בין רמות שונות של הפעלת תא T ואפקטים של תאי T כזה על ECS.

ניתן להשתמש בו במגוון רחב של מבחנים תפקודיים: ציטוקינים שונים ו / או כמוקינים מעורבים בתהליכים דלקתיים ניתן להוסיף גם את התרבות המשותפת של MBMECs ותאי T; נוגדנים חוסמים נגד מולקולות הידבקות התא משני האיחוד האירופי או בצד T-cell יכול לשמש; ומעכבים של סמנים הפעלה תא T או נכסי cytolytic שלהם ניתן להוסיף במהלך יחול תאי T או שיתוף התרבות שלהם עם ECS. Assay הוא שימושי גם עבור גלגול T-cellמבחנים, כפי שהוא יכול לשמש בקרת איכות של שלמות monolayer MBMEC לפני התוספת של תאי T. כל זה הופך שיטה זו כלי תכליתי ואמין ללמוד את BBB במבחנה, תוך שימת דגש על ההשפעה של תאי T מופעלים על שלמות monolayer EC. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת להבנת המנגנונים של שיבוש BBB בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה במודל חיה שלה EAE, שבו תגובתי עצמית, תאי T encephalitogenic לחצות את BBB ולגרום דלקת ונזק עצבי.

Protocol

עבור כל הניסויים, עכברים גדלו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים במתקן החיה המרכזי באונ' מינסטר, על פי הנחיות גרמניות לטיפול בבעלי חיים. כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות ועדת האתיקה ניסיון בעלי החיים ואושר על ידי הרשויות המקומיות של נורדריין-וסטפאליה, גרמניה (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). </p…

Representative Results

איור 1 מספק סקירה כללית של המודל במבחנה BBB לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי T ותאי האנדותל. הניסוי מורכב משלושה שלבים עיקריים. הצעד הראשון הוא הבדידות של MBMECs ראשית ממנהל בקורטקס המוח, ותרבותם במשך חמישה ימים. כשהם מגיעים למפגש בצלחת…

Discussion

כמה שלבים של הפרוטוקול המתואר חיוניים עבור ניסוי מוצלח. במהלך הבידוד MBMEC הראשונית ותרבות, חשוב כי העבודה נעשית בתנאים סטריליים ככל האפשר, כדי למנוע את הזיהום של תרבית תאים עם נבגי פטריות או חיידקים. על מנת לקבל תרבות טהורה של ECS, מומלץ להשתמש במצע המכיל puromycin עבור שלושת…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים אניקה Engbers ופרנק Kurth לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם ד"ר מרקוס שפר (nanoAnalytics GmbH) לדיונים מועילים לגבי מדידות TEER. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), A03 פרויקט SFB1009 כדי HW ו LK, CRC TR128, פרויקטי A08; Z1 ו- B01 כדי LK ו HW, ואת המרכז הבינתחומי לחקר קליני (פקולטה לרפואה של מינסטר) מספר מענק Kl2 / 2015/14 עד LK.

Materials

cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

References

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -. C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -. O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence?. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide – How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -. J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  40. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  41. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  42. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  43. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
  44. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  45. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -. J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  46. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  47. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  48. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  49. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
  50. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

View Video