en<em> In Vitro</em> Modell av blod-hjernebarrieren Bruke impedansspektroskopi: En Fokus på T Cell-endotelceller Interaksjon

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

Blod-hjerne-barrieren skiller den systemiske sirkulasjon fra sentralnervesystemet (CNS) ^{1 – 3.} Det gir en fysisk barriere som hindrer fri bevegelse av celler og diffusjon av vannløselige molekyler og beskytter hjernen mot patogener og potensielt skadelige stoffer. I tillegg til sin barrierefunksjon muliggjør BBB leveringen av oksygen og næringsstoffer til hjernen parenchyma, som sikrer riktig funksjon av den neuronale vev. Funksjonelle egenskaper ved BBB er sterkt regulert av dets cellulære og acellulære komponenter med høyt spesialiserte ECS som sin viktigste strukturelle element. ECS av BBB er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av tett kobling (TJ) komplekser, mangel på fenestrations, ekstremt lav pinocytic aktivitet, og permanent aktive transportmekanismer. Andre komponenter i BBB EU basalmembran, pericytes innebygging endotelet, astrocytic end føtter og = forbundet parienchymal basalmembran også bidra til utvikling, vedlikehold og funksjon av BBB ^{2,4 – 6,} og sammen med nevroner og mikroglia, danner neurovascular enheten (nvu), som muliggjør riktig funksjon av CNS ^{7 – 9.}

I en rekke nevrologiske sykdommer, så som neurodegenerative, inflammatoriske eller infeksjonssykdommer, er funksjonen av BBB kompromittert ^2,5,10. Feilregulering av TJ komplekser og molekylære transportmekanismer fører til økt BBB permeabilitet, leukocytter bloduttredelse, betennelser og nerveskader. For å studere BBB eiendommer under slike patofysiologiske forhold, er det etablert ulike in vitro BBB modeller ^9,11,12. Sammen har de gitt verdifull innsikt i endringer av barriereintegritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Disse modellene benytter endotelceller menneske, mus, rotte, svin eller bsau opprinnelse ^13-18; primære endotelceller eller cellelinjer blir dyrket enten som en monokultur eller sammen med pericytes og / eller astrocytter for å etterligne nærmere BBB in vivo ^19-25. I de senere år har måling av transendothelial elektrisk motstand (teer) blir et allment akseptert verktøy for å vurdere endotelial barriereegenskaper ^26,27.

Teer reflekterer impedansen til den ionefluks gjennom cellenes monolag og dens reduksjon gir et følsomt mål på kompromittert endotelial barriereintegritet og dermed økt permeabilitet. Ulike Teer målesystemer har blitt utviklet, inkludert epithelial Voltohmmeter (EVOM), Elektrisk Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS), og real-time celle analyse ^{15,28 – 30.} Teer reflekterer motstand mot ionefluks mellom tilstøtende ECS (paracellulære vei) og er direkte proporsjonal medbarriereintegritet. I impedansspektroskopi ^27,31, er kompleks total impedans (Z) målt, noe som gir ytterligere informasjon om barriereintegritet ved å måle Ccl. CCL vedrører den kapasitive strøm gjennom cellemembranen (transcellulær rute): cellelaget fungerer som en kondensator i den tilsvarende strømkrets, separering av de ladninger på begge sider av membranen, og er omvendt proporsjonal med barriereintegritet. Når dyrket på permeable innsatser, egenkapitalbevis holder seg, sprer og spredt over mikro membran. Dette motstår bakgrunnen kapasitiv strøm av innsatsen (som i seg selv fungerer som en kondensator) og fører til en reduksjon i kapasitansen til den når sin minimalt nivå. Dette blir etterfulgt av etablering av TJ komplekser som tetning av rommet mellom tilstøtende ECS. Dette begrenser ion fluks gjennom paracellulære rute, og Teer øker til den når sitt platå. Under inflammatoriske tilstander, men den endothelial barrieren er utsatt: Teer avtar som TJ komplekser bli forstyrret og Ccl øker som den kapasitive komponent av innsatsen stiger igjen.

Vår Teer måling bruker automatiserte celleovervåkning ³² system: det følger prinsippet om impedansspektroskopi og utvider tidligere søknader. Her beskriver vi en in vitro BBB modell som gjør det mulig å studere de barriereegenskaper, blant annet interaksjonen av hjerne endotel med immunceller; særlig aktiverte T-celler. Slike patofysiologiske tilstander blir observert i autoimmune sykdommer i sentralnervesystemet, for eksempel multippel sklerose og dens dyremodell eksperimentell autoimmun encefalomyelitt ^33-37. Her er et viktig skritt på sjelevandring av encefalitogene, myelin-spesifikke T-celler på tvers av BBB. Dette etterfølges av deres reaktivering ved perivaskulær plass og inntreden inn i hjernen parenchyma, hvor de rekrutterer andre immunceller og megdiate betennelser og påfølgende demyelinisering ^1,35,38. Imidlertid molekylære mekanismer av interaksjonen mellom slike T-celler og endotelceller, de viktigste bestanddeler av BBB, er ikke godt forstått. Vår protokoll som mål å fylle dette gapet, og gi ny innsikt i konsekvensene på endotelceller (dvs. barriere integritet og permeabilitet) ved sin direkte kontakt og komplekst samspill med aktiverte T-celler.

Protokollen er beskrevet her gjør bruk av primærmusehjerne mikrovaskulære endotelceller, dyrket som et monolag på gjennomtrengelige innlegg med mikroporøse membraner. Endotelceller blir ko-dyrket med CD4 ⁺ T-celler, noe som kan være pre-aktiveres enten polyclonally eller i en antigen-spesifikk måte. Ko-kultur av MBMECs med pre-aktivert, men ikke naive T-celler induserer en reduksjon i teer og en økning i Ccl, som gir et kvantitativt mål på MBMEC dysfunksjon og barriere avbrudd. teknikkener ikke-invasiv: den bruker innebygd i stedet for chopstick elektroder, som hindrer vesentlig forstyrrelse av EC monolayer; den kan brukes til å overvåke barrierefunksjon uten bruk av cellemarkører. Det gjør kontinuerlige målinger i en automatisert måte og gjør en selvstendig vurdering av de to barriere parametere (Teer og CCL) samtidig over tid. Fremgangsmåten er også følsom nok til å skille mellom forskjellige nivåer av T-celleaktivering og virkninger av slike T-celler på ECS.

Den kan brukes i et bredt spekter av funksjonelle analyser: forskjellige cytokiner og / eller kjemokiner involvert i inflammatoriske prosesser kan tilsettes til ko-kulturen av MBMECs og T-celler; blokkerende antistoffer mot celleadhesjonsmolekyler på enten EC eller T-celle side kan anvendes; og inhibitorer av T-celle-aktiveringsmarkører eller av deres cytolytiske egenskaper kan tilsettes i løpet av T-celle-priming eller deres ko-kultur med ECS. Analysen er også nyttig for T-celle-transmigrasjonassays, så det kan tjene som en kvalitetskontroll av MBMEC monolaget integritet før tilsetning av T-celler. Alt dette gjør denne metoden en allsidig og pålitelig verktøy for å studere BBB in vitro, med en vekt på virkningen av aktiverte T-celler på EC monolag integritet. Dette er av særlig betydning for å forstå mekanismene for BBB avbrudd i patogenesen av autoimmune sykdommer, slik som MS og dens dyremodell EAE, hvor selvreaktive, encefalitogene T-celler krysser BBB og føre til betennelse og neuronal skade.

Protocol

For alle forsøk ble mus oppdrettet og holdt under spesifikke patogenfrie forhold i det sentrale dyret anlegget ved University of Münster, ifølge tysk retningslinjer for dyr vare. Alle forsøkene ble utført i henhold til retningslinjene fra dyrestudier etikkomité og godkjent av de lokale myndigheter i Nordrhein-Westfalen, Tyskland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolering og kultur MERK: Isoler MBMECs som tidligere beskrevet i detalj 14 med følgende modifikasjoner: Sac…

Representative Results

Figur 1 gir en generell oversikt over in vitro BBB modell for å studere interaksjonen mellom T-celler og endotelceller. Eksperimentet består av tre store skritt. Det første trinnet er isolering av primære MBMECs fra hjerne cortices, og deres kultur i fem dager. Når de når konfluens i cellekulturplaten, har MBMECs trypsinisert og sådd på nytt på gjennomtrengelige innlegg, som deretter plasseres i den teer instrument. Den Teer og Ccl av MBMECs kontinuerli…

Discussion

Flere trinn i den beskrevne protokoll er avgjørende for en vellykket eksperiment. Under den første MBMEC isolasjon og kultur, er det avgjørende at arbeidet utføres under sterile betingelser så mye som mulig, for å hindre forurensning av cellekulturen med soppsporer og bakterier. For å oppnå en ren kultur av ECS, anbefales det å bruke et medium som inneholdt puromycin for de første tre dagene, som muliggjør overlevelse av ECS, men ikke på andre celletyper (særlig pericytes) ^41,42. Et annet kritisk…

Materials

cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2
Ultracentrifuge	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software	Tree Star	www.flowjo.com	for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm	Corning	3470	for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm	Corning	3472	for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate	Greiner	650 180	flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate	Costar	3526	round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber	Marienfeld	MF-0640010	for cell counting
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350	for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm	Corning	352340	for immune cell isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for immune cell isolation
MACS LS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta	Sigma	C5533	for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG	for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	for MBMEC isolation
DNase I	Sigma	DN25	for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA)	Amresco	0332-100G	for MBMEC isolation
Percoll	Sigma	P1644-1L	for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	for MBMEC and immune cell isolation
Heparin	Sigma	H3393	for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	PeproTech	100-18B	for MBMEC culture medium
Puromycin	Sigma	P8833	for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA	Sigma	C9891	for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	for cell counting
EDTA	Sigma	E5134	for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin	Gibco	21980-032	for T cell culture medium
X-VIVO 15	Lonza	BE04-418Q	protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide	Biotrend	BP0328	for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab	BioLegend	100302	clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ	PeproTech	315-05	for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α	PeproTech	315-01A	for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II	Calbiochem	368055	recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody	Biolegend	116005	clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration