Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Published: March 29, 2017 doi: 10.3791/54667
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1,4, 1, 1,4
1Department of Physiological Chemistry, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Fish Disease Research Unit, University of Veterinary Medicine, 3Department of Clinical Sciences, Biomedical Center, Lund University, 4Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover
* These authors contributed equally

Summary

Lipider er kendt for at spille en vigtig rolle i cellulære funktioner. Her beskriver vi en fremgangsmåde til bestemmelse lipidsammensætningen af ​​neutrofiler, med vægt på kolesterolniveauet, ved hjælp af både HPTLC og HPLC at få en bedre forståelse af de underliggende mekanismer for neutrofil ekstracellulær fælde dannelse.

Abstract

Lipid analyse udført ved højtydende tyndtlagskromatografi (HPTLC) er en relativt enkel, omkostningseffektiv fremgangsmåde til analyse af et bredt udvalg af lipider. Funktionen af lipider (fx i værtspatogene interaktioner eller vært post) er blevet rapporteret at spille en afgørende rolle i cellulære processer. Her viser vi en metode til at bestemme lipidsammensætning, med fokus på cholesterolniveauet af primære blodafledte neutrofiler ved HPTLC i sammenligning med højtryksvæskechromatografi (HPLC). Formålet var at undersøge rollen af ​​lipid / cholesterol ændringer i dannelsen af ​​neutrofile ekstracellulære fælder (NET). NET frigivelse er kendt som en værtsforsvarsmekanisme at forhindre patogener i at sprede i værten. Derfor blev afledt af blod humane neutrofiler behandlet med methyl-β-cyclodextrin (MβCD) for at inducere lipid forandringer i cellerne. Anvendelse HPTLC og HPLC, har vi vist, at MβCD behandling af cellerne fører til lipidændringer associeret med en signifikant reduktion i indholdet af cellen kolesterol. Samtidig, MβCD behandling af neutrofilerne førte til dannelsen af ​​NET, som vist ved immunfluorescens mikroskopi. Sammenfattende her præsenterer vi en detaljeret metode til at studere lipid ændringer i neutrofiler og dannelsen af ​​NET.

Introduction

Lipider er blevet vist at spille vigtige roller i cellehomøostase, celledød, værtspatogene interaktioner og cytokinfrigørelse 1. Over tid har interesse for og viden om virkningerne af lipider i vært-patogen interaktioner eller inflammation øges, og flere publikationer bekræfter den centrale rolle, som visse lipider, især steroid kolesterol, i cellulære responser. Farmakologisk behandling med statiner, som anvendes som inhibitorer af cholesterolbiosyntese ved at blokere 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reduktase (HMG-CoA-reduktase), kan fungere som anti-inflammatoriske midler ved at sænke serumniveauerne af interleukin 6 og C-reaktivt protein 2. Cholesterol og glycosphingolipid-berigede strukturer kan bruges af flere patogener, såsom bakterier og vira, som en gateway i værten 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sphingolipider (fx sphingomyelin) er blevet vist at blive brugt af patogener til at fremme deres patogenicitet 7. I makrofager, mycobakterier brug cholesterolberiget domæner til indtastning celler; en udtynding af cholesterol hæmmer mycobakteriel optagelse 8. Endvidere infektion af makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk agens ansvarlig for tularemia (også kendt som kanin feber) 9, førte til en infektion, der blev afskaffet når cholesterol blev depleteret fra membranerne 10. Tilsvarende blev invasionen af værtsceller ved Escherichia coli via lipidrige strukturer vist sig at være kolesterol-afhængig 4. Desuden Salmonella typhimurium infektion eksperimenter af epitelceller viste, at cholesterol er afgørende for patogen indtrængen i cellerne 11. Cholesteroldepletering inhibited optagelsen af Salmonella 11. Endvidere en nylig undersøgelse fra gilk et al. viste, at kolesterol spiller en vigtig rolle i optagelsen af Coxiella burnetti 12. Derudover Tuong et al. konstateret, at 25-hydroxycholesterol spiller en afgørende rolle i fagocytose med lipopolysaccharid (LPS) -stimuleret makrofager 13. Fagocytose blev reduceret, når makrofager blev farmakologisk behandlet til nedbryder kolesterol 14. Således, cholesterol og andre lipider synes at spille en vigtig rolle i infektion og inflammation, idet deres udtømning kan reducere risikoen for invasion fra flere patogener 10, 11, 12.

For nylig kunne vi vise, at lipid ombygninger, især udtømningen af ​​cholesterol fra cellen, inducere dannelsen af ​​neutrofil extracellular fælder (net) i humane blodafledte neutrofiler 15. Siden opdagelsen af NET i 2004, har de vist sig at spille kritiske roller i bakteriel indespærring, og dermed i at hindre spredning af smitte 16, 17. NET består af en DNA-rygrad forbundet med histoner, proteaser og antimikrobielle peptider 16. Frigivelse af NET ved neutrofiler kan induceres ved invaderende patogener 18, 19 og kemiske stoffer, såsom phorbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Imidlertid er de detaljerede cellulære mekanismer og især rollen af ​​lipider i denne proces, er stadig ikke helt klar. Analysen af ​​lipider kan føre til en bedre forståelse af de involverede i en lang række af cellulære processer og interaktioner, såsom frigivelse af NET mekanismer. Cholesterol og sphingomyelin er vitale bestanddele i cellemembranen og lipid mikrodomæner, hvor de tilføjer stabilitet og lette klyngedannelse af de involverede protein handel og signalhændelser 21-proteiner. For at undersøge den mekanistiske rolle, som visse lipider, amfifile farmakologiske midler, såsom det cykliske oligosaccharid methyl-β-cyclodextrin (MβCD), kan anvendes til at ændre lipidsammensætningen af en celle og til at reducere kolesterol in vitro 15. Her præsenteres en fremgangsmåde til at bruge HPTLC at analysere lipidsammensætningen af ​​neutrofiler i respons på MβCD. HPLC blev anvendt til at bekræfte niveauet af kolesterol i neutrofile befolkning. Desuden beskriver vi en metode til at visualisere dannelsen af ​​NET ved immunfluorescens mikroskopi i humane blodafledte neutrofiler i respons på MβCD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Indsamlingen af ​​det perifere blod i denne protokol blev godkendt af de lokale menneskelige forskningsetik provision. Alle mennesker, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke.

1. Isolering af humant blod-afledte Neutrofiler ved densitetsgradientcentrifugering

  1. Isolering af humane blodafledte neutrofiler
    1. Lag ~ 20 ml blod på 20 ml af natrium diatrizoat / dextranopløsning nær en flamme og uden blanding.
    2. Centrifugeres i 30 minutter ved 470 xg uden bremse.
    3. Fjern de mononukleare celler og den gullige plasmalaget. Overfør polymorfkernede celle (PMN) fase (anden fase med akkumulerende celler; figurerne 1 og 2) i en ny 50 ml rør og fylde den op til 50 ml med 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
    4. Centrifugeres i 10 minutter ved 470 xg med bremse.
    5. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 5 ml sterilt vand for 5 s at lysere erythrocytterne.
    6. fylde straks op til 50 ml med 1 x PBS og centrifugeres i 10 minutter ved 470 x g.
    7. Fjern supernatanten. Pelleten skal være hvidt. Hvis det stadig er rød, skal du gentage trin 1.1.5 og 1.1.6.
    8. Pellet resuspenderes i 1000 pi Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Tæl celle nummer ved hjælp trypanblå farvning i et hæmocytometer under et lysmikroskop.
    9. Fremstille en cellesuspension i RPMI i en koncentration på 2 x 10 6 / ml. Ca. 2,5 x 10 7 neutrofiler kan høstes fra 20 ml af blod.
  2. Farmakologisk behandling af neutrofiler til lipidanalyse
    1. Anvende 5 x 10 7 celler fra trin 1.1.9. Juster celletallet i ren Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) medium i nærvær eller fravær af 10 mM MβCD eller 25 nM PMA i et samlet volumen på 300 pi i et 1,5 ml reaktionsrør.
    2. Inkuber prøverne ireaktionsrør i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    3. Centrifugeres i 10 minutter ved 470 xg med bremse.
    4. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 300 pi HBSS.
    5. Centrifugeres i 10 minutter ved 470 xg med bremse.
    6. Resuspender cellepelleten i 1 ml chloroform / methanol (1: 1), homogenisere den med en 26-G kanyle ved at suge prøven ind og ud i en 1 ml sprøjte 10 gange, og opbevare prøverne ved -20 ° C.
  3. Farmakologisk behandling af neutrofiler til NET kvantificering ved immunfluorescens
    1. Forberede poly-L-lysin-overtrukne plader med 48 brønde med dækglas.
      1. Placer en 8-mm dækglas i hver brønd tilsættes 55 pi sterilt 0,01% Poly-L-lysin, og inkuberes i ~ 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
    2. Vaskes to gange med 200 pi af 1 x PBS. pladerne med 200 pi af 1 x PBS per brønd opbevares i køleskab indtil brug.
    3. Bilefully tilsæt 100 pi cellesuspension (2 x 10 5/100 pi) fra trin 1.1.9 per brønd i midten af hver dækglas.
    4. Tilsæt 100 pi per brønd af enten de endelige 10 mM MβCD eller den endelige 25 nM PMA.
    5. Centrifugeres i 5 minutter ved 370 xg med bremse.
    6. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    7. Centrifugeres i 5 minutter ved 370 xg med bremse.
    8. Fikseres cellerne med 155 pi 4% PFA, pak dem ind i plast paraffin film, og gemme dem natten over ved 4 ° C eller i 10 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: data om NET induceret af MβCD, se Neumann et al. 15.

2. Lipid Isolering og analyse af humant blod-afledte Neutrofiler

  1. Isolere lipiderne fra de humane perifert blod-afledte neutrofiler baseret på Bligh og Dyer 22 og Brogden et al. 23
    1. På is, pipette neutrofilerne (til stede i methanol og chloroform opløsning) til en 15 ml skruelåg glasrør med en polytetrafluorethylen (PTFE) tætning og homogeniseres dem ved rystning i 1 minut. Bruge glasrør at forhindre lipiderne i at binde til plastoverflader. Brug PTFE hætter at forhindre kontaminering af gummi / plast.
    2. Tilsæt 2 ml methanol efterfulgt 1 min senere af 1 ml chloroform. Ryst igen i 1 min.
    3. Rotere glasrørene ved stuetemperatur og 50 rpm i 30 min.
    4. Pelletering af proteinfraktionen ved centrifugering af opløsningen ved 7 ° C og 1.952 xg i 10 minutter.
    5. dekanteres omhyggeligt supernatanten til et nyt 15 ml glas med skruelåg rør, hvorefter det proteinholdige pellet bag. Opbevar pellet ved -20 ° C til fremtidig kvantificering.
    6. Tilsæt 1 ml chloroform, vent 1 min, tilsæt 1 ml dobbeltdestilleret vand, og invertsukker glasset med skruelåg rør med prøven i 30 sekunder. Centrifuge ved 7 ° C og 1.952 xg i 10 minutter og kassere den øvre fase, ned til, men ikke inklusive den uklare lag.
    7. Om nødvendigt udføre et eventuelt yderligere oprensningstrin ved at gentage trin 2.1.8.
    8. Tør prøverne i en vakuumkoncentrator ved 60 ° C og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
  2. Højtydende tyndtlagskromatografi (HPTLC) til semi-kvantificere mængden af flere lipider, herunder cholesterol, phospholipider og sphingomyelin
    1. Forbered følgende fire kørende løsninger og farveopløsning.
      1. Løsning 1: Bland ethylacetat (26,6%), 1-propanol (26,6%), chloroform (26,6%), methanol (26,6%), og kaliumchlorid (9,6%). Forberede KCI ved at opløse 0,25 g KCl i 100 ml HPLC-kvalitet vand.
      2. Løsning 2: Bland n-hexan (73%), diethylether (23%), og citronsyre (2%).
      3. Opløsning 3: 100% n-hexan.
      4. Forbered farvning løsning vedblande destilleret vand (90 ml) med 7,5 g kobbersulfat, og derefter tilsættes 10 ml phosphorsyre.
    2. Fyld op til 5 mm af hver opløsning i en separat glas kammer. Tilføj nogen form for filter papir for at øge hastigheden i hvert kammer.
    3. Præ-inkubere en 20 x 10 cm HPTLC silicagel 60 glasplade i første arbejdsspindel opløsning, indtil den kørende opløsning når toppen af ​​pladen. Derefter tørre det i 10 minutter ved 110 ° C.
      BEMÆRK: Disse plader kan lagres til fremtidig anvendelse i aluminiumfolie og tørret i 10 minutter ved 110 ° C før anvendelse.
    4. Opløs lipid pellet opnået fra trin 2.1.10 i 200 pi chloroform / methanol (1: 1) opløsning og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C til opløsning.
    5. Brug en lineal og en blød blyant til at markere lastning pletter for det ønskede antal prøver, plus mindst én standard. Mark løbedistancen ved ca. 4 cm og 6 cm for den første og anden arbejdsspindel opløsning hhv.
    6. At indlæse prøverne vaskes 10 pi sprøjten 3 gange i chloroform / methanol (1: 1) forud for lastning hver ny prøve. Belastning 10 pi af hver prøve dråbevis, forsøger at koncentrere prøven på så lille et område som muligt. Prøver skal lastes mindste dubletter.
    7. Pladen lodret i det første kammer med rindende opløsning 1 (trin 2.2.1.1). Sikre, at pladen er parallelt med væggen af ​​glasset kammer for at opnå en ensartet hastighed migration.
    8. Når opløsningsmidlet linje har nået det første mærke, fjerne pladen, tør den, og placere den i den anden opløsning. Gentag lignende trin for den anden og for tredje driftsforhold løsninger; forlade pladen i opløsningen indtil væskefronten når toppen af ​​pladen, derefter fjerne og tør det ved stuetemperatur i 1 min.
    9. Placere pladen i kobbersulfatopløsning i 7 s. Fjern pladen, tør det grundigt, og bage det i en ovn i 7 minutter ved 170 ° C. Vente på pladen at afkøle.
    10. Using et tyndtlagskromatografi og gelanalyse software, samt en billedbehandling software, scanne og analysere som tidligere beskrevet af Brogden et al. 23.
  3. Højtydende væskekromatografi (HPLC) for at kvantificere mængden af kolesterol
    1. Vedhæfte en 100 x 4,6 mm søjle til en 5 um / 4,6 mm beskyttelsesindsats og opvarme det til 32 ° C. Anvende methanol som den mobile fase ved en strømningshastighed på 1 ml / min ved 65 bar og en UV-detektor måling ved 202 nm til kvantificering af mængden af ​​cholesterol i hver prøve.
    2. Vask HPLC maskine grundigt før de analyseres, at udføre følgende trin: rengøring af pumpen, vask af nålen, skylning potten, skylning af sprøjten, og vask af pumpen udrensning. Vask alt med vand. Endelig udfører en systemsletning med methanol ved en strømningshastighed på 5 ml / min i 5 min.
    3. At etablere en kolesterol standardkurve fremstilles mindst 4 koncentrationer i områdetfra 0,05 mg / ml til 2 mg / ml cholesterol i chloroform / methanol (1: 1) 24.
    4. Resuspendere prøver opnået fra trin 2.1.10 i 500 pi chloroform / methanol (1: 1) i ravfarvede 1,5 ml glasflasker med skruelåg rød PTFE / hvid silikone låg.
    5. Kvantificere cholesterolkoncentrationer anvendelse af standard fremstillet i trin 2.3.3.
      BEMÆRK: Fyld i prøveudtagningsprotokollen, begyndende med mindst en standard og en negativ kontrol, efterfulgt af prøverne.
    6. Resultaterne udtrykkes som arealet under kurven og sammenligne mellem relevante prøver ved hjælp af enhver statistisk software.
      BEMÆRK: Resultaterne kan også kvantificeres over for en standardkurve og kan vises som det samlede kolesterol beløb pr ml, g, eller antallet af celler. Standardkurven ligning, bør beregnes ved hjælp af værdierne opnået i trin 2.3.3.

3. Visualisering og Kvantificering af NET

  1. Visualization af NET
    BEMÆRK: visualisering af NET er baseret på tidligere offentliggjorte arbejde af Neumann et al. 15.
    1. Vask de faste prøver fra trin 1.3.8 3 gange med 200 pi 1 x PBS.
    2. Block og permeabilisere med 100 pi 2% BSA, 0,2% Triton X-100 i PBS per brønd i 45 minutter ved stuetemperatur.
    3. Tilsæt 100 pi primære antistoffer: monoklonalt muse-anti-DNA-histon 1-antistof (fortynding af stamopløsningen med 2,2 mg / ml 1: 5.000 i PBS indeholdende 2% BSA og 0,2% Triton X-100) eller polyklonalt antistof mod myeloperoxidase (MPO; kanin-anti-MPO; fortyndes 1: 300 i PBS indeholdende 2% BSA og 0,2% Triton X-100). Inkuber natten over ved 4 ° C.
    4. Vask 3 gange med 200 pi af 1 x PBS.
    5. 100 pi af det sekundære antistof (fluorescens-mærket gede-anti-muse; 1: 1.000 i BSA-PBS-Triton X-100 og gede-anti-kanin, 1: 1.000 BSA-PBS-Triton X-100) i 1 time ved RT i mørke.
    6. Vask 3 gange med 200 & #181; L i 1 x PBS.
    7. Fjern dækglas med en pincet og placere dem med forsiden nedad med 3 pi montering medium, der indeholder DAPI på objektglas.
    8. Undersøge prøverne under anvendelse af et konfokalt omvendt basen fluorescensmikroskop udstyret med en HCX PL APO 40X 0,75-1,25 olieimmersionsobjektiv 15.
  2. Kvantificering af NET-frigivende kerner
    1. Åbn et billedbehandling software (f.eks ImageJ) og træk og slip billede af interesse i værktøjslinjen.
    2. Klik på "Plugins", "analysere" og "Cell tæller."
    3. Tryk på knappen "Initialiser" i tælleren vinduet og vælge en tæller (f.eks klik på 7 i rød for NET-frigivende celler og 8 i gult for ikke-frigivende celler, som vist i figur 6B-i og ii).
      BEMÆRK: Kriterierne for NET-positive celler: Positivt farvede grønne kerne + en mindre tæt nucleus (tab af lobulation) eller et tab af den runde form af kernen + en forøget størrelse af kernen, eller en forekomst af en distinkt ekstracellulært off-shoot.
    4. Klik hver celle fastholdelsen af ​​de ovennævnte kriterier og skrive det optalte celletallet i et datablad af en analyse software.
    5. Beregne procentdelen af ​​NET-frigivende celler ved anvendelse af optalte celleantal af NET-frigørende og ikke-frigivende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Humane blodafledte neutrofiler blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering (figur 2). For at undersøge virkningen af ​​lipid ændringer på neutrofiler, blev cellerne behandlet med 10 mM MβCD, som udtømmer cholesterol fra cellen. Efterfølgende blev lipiderne isoleres fra prøver ved Bligh og Dyer (figur 1, venstre panel), som beskrevet af Brogden et al. 23. De fremstillede lipid prøver blev fyldt på silicagelplader HPTLC plader og køre under anvendelse af en tre-opløsning protokol, som er optimeret til at adskille og visualisere et bredt udvalg af lipider, herunder cholesterol, cholesterolestere, sphingomyelin, phospholipider, og triacylglycerider, frie fedtsyrer , monoacylglycerol, phosphatidylethanolamin, cardiolipin, phosphatidylserin, og phosphatidylcholin (figur 3A). Oxygenerede derivater af cholesterol (oxysterols) ikke er påviselige wed denne metode. En yderligere kvantitativ analyse af cholesterol blev udført ved anvendelse af HPLC (figur 3B). Regressionen værdi for kolesterol var markant bedre, når anvendelse af HPLC (figur 4A) sammenlignet med HPTLC (figur 4B). At visualisere de NET blev cellerne stimuleret med de ovennævnte stimuli, fikseret og farvet for DNA / histon 1 (grøn), MPO (rød), og DNA (blå) som typiske NET markører (figur 5A). Som vist i figur 5A, en klar forekomst af MPO, DNA / histon 1, og DNA forekommer i NET, når cellerne blev behandlet med 10 mM MβCD i 2 timer. Efterfølgende blev mikroskopisk analyseret effekten af ​​kolesterol reduktion. Derfor blev cellerne farvet for DNA (blå) og DNA / histon 1 (grøn), og NET-frigivende kerner blev talt under anvendelse af celletalsmåleren plugin fra billedbehandlingssoftware ImageJ (figur 5B). Ubehandlede neutrofiler tjente som en kontrol for spontaneous NET-dannelse (figur 5B-i). I den viste figur, NET frigivelse i ubehandlede neutrofiler efter 2 timers inkubation var 3,89%, mens behandling af cellerne med 10 mM MβCD resulterede i 35,17% NET-dannelse (figur 5B).

figur 1
Figur 1: Skematisk viser trinene involveret i bestemmelse af lipidsammensætning og ekstracellulær fælde frigivelse fra humane blodafledte neutrofiler. Neutrofiler isoleres under anvendelse af en densitetsgradient og behandles med methyl-β-cyclodextrin (MβCD) for at inducere lipid ændringer og NET dannelse. Derefter lipider isoleres og analyseres ved anvendelse af enten HPTLC eller HPLC, og NET visualiseres og kvantificeres ved immunofluorescens.

Figur 2
Rong> Figur 2: Billeder, der viser en typisk densitetsgradient anvendt til at isolere polymorfonukleære celler fra frisk-isolerede blod. Fire lag er synlige efter centrifugering: plasma, mononukleære celler, polymorfonukleære celler og erythrocytter.

Figur 3
Figur 3: HPTLC og HPLC-analyse af lipider isoleret fra neutrofiler. (A) Standard anvendes til at identificere lipiderne stede i neutrofiler via HPTLC (venstre bane). CE: Kolesterol estere, TG: ECN, FFA: Fri fedtsyrer, Chol: Kolesterol, MG: monoacylglycerol, PE: phosphatidylethanolamin, CL: cardiolipin, PS: phosphatidylserin, PC: phosphatidylcholin og SM: sphingomyelin. (B) Repræsentativ resultat viser en kolesterol-specifik top for 2 mg / ml ved 4,980 min anvendelse af den beskrevne her HPLC protokol.

jove_content" fo: keep-together.within-side = "1"> Figur 4
Figur 4: HPLC og HPTLC analyser af cholesterol. Grafer, der viser forholdet mellem cholesterolkoncentration og område, som målt ved HPLC (A), og båndintensitet, målt ved HPTLC (B). Den mindste detektionsgrænsen for HPLC var 0,0016 mg / ml, med en regression værdi for standardkurven af 0,998 N = 3, SEM (A). Kolesterol i området fra 2 mg / ml ned til 0,05 mg / ml kan være semi-kvantificeres ved anvendelse af HPTLC (B), med en detektionsgrænse på 0,05 mg / ml N = 3, SEM minimum. Regressionen værdi for HPTLC standardkurve er 0,918.

Figur 5
Figur 5: Repræsentative fluorescensmikrografer udviser NET strukturer og subsequent NET kvantificering. (A) Neutrofiler stimuleret med 10 mM MβCD i 2 timer blev farvet for (ii) MPO (rød), (iii) DNA / histon 1 (grøn), og (iv) DNA (blå). (I) Overlay af (ii), (iii) og (iv). (B) Cellerne blev inkuberet i 2 timer med (i) HBSS medium eller (ii) 10 mM MβCD, og frigivne NET blev farvet for kerner (blå) og DNA / histon 1 (grøn). NET-negative kerner blev markeret med tæller 8 (gul) og NET-positive kerner med tælleren 7 (rød).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De her beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at analysere specifikke lipider, såsom cholesterol, ved HPTLC eller HPLC og at undersøge virkningerne af farmakologiske Lipidforandringer på dannelsen af NET (se Neumann et al. 15).

HPTLC er en relativt omkostningseffektiv og enkel metode til at analysere en lang række lipider i et stort antal prøver. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt i mange forskningsområder, herunder antibiotisk kvantificering 25, lipidlagring i lysosomale sygdomme 26, og bestemmelse af kolesterol og cholesterylglucoside niveauer i epitelceller 27. Den her beskrevne fremgangsmåde blev modificeret og optimeret til at isolere lipider fra en oprenset neutrofil befolkning; imidlertid kan en let modificeret udgave også anvendes til at isolere lipider fra vævsprøver (se Brogden et al. 23). Under anvendelse af denne mødtehod, lipider kan også være effektivt adskilt, der er konstateret, og semi-kvantificeres mod en kendt standard. Et kritisk trin i denne fremgangsmåde er brugen af ​​den respektive navngivne puffer, eftersom brugen af ​​enhver anden puffer eller medium kan føre til lipid kontaminering og uspecifikke lipid bands i prøverne. Da følsomheden er begrænset med HPTLC bør HPLC anvendes som en mere præcis metode til absolut kvantificering.

HPLC letter kvantificering og identifikation af kolesterol og dens forskellige former eller derivater ved at udføre en sammenligning med en kendt lipid. Ved anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, er det muligt på pålidelig kvantificere ned til 0,0016 mg / ml cholesterol (figur 4A), med en lineær forhold op til 10 mg / ml (R = 0,990). HPTLC fremgangsmåde muliggør kolesterol detektion ned til 0,05 mg / ml, men med en sigmoid kurve og en nedre korrelationskoefficient på R = 0,906 (figur 4B). Den højere følsomhed og højere korrelation koefficient dermed gør HPLC en meget overlegen metode til den nøjagtige kvantificering af lipider, som efterfølgende muliggør skal detekteres mindre forskelle mellem prøverne. Imidlertid kan begge metoder anvendes i kombination; HPTLC kan bruges til at få et overblik i hvilken lipider kan ændres, og HPLC kan anvendes i en mere målrettet tilgang til kvantificere forskellen af ​​en specifik lipid i en given prøve. Når man sammenligner vores målinger med værdierne opnået ved andre 28, 29, blev mindre kolesterol kvantificeret i alt neutrofiler. Dette kan forklares ved den anvendte metode. Andre undersøgelser anvendes en fluorimetrisk påvisning, som er baseret på et enzym-koblet reaktion, der påviser både fri cholesterol og cholesterylesters.

Her, HPTLC og HPLC anvendes i kombination for at verificere, at MβCD fører til en signifikant reduktion af kolesterol som også tidligere vist af Gorudko et al.ss = "xref"> 28. De viste en 60% reduktion af cholesterol i neutrofiler med 10 mM MβCD. Derudover en lille reduktion af sphingomyelin niveau men ikke cholesterolestere var påviselig i neutrofilerne, når de behandles med MβCD (se Neumann et al. 15). Samtidig, udtømningen af kolesterol fører til dannelsen af NET (se Neumann et al. 15). Disse finde korrelerer godt med det fænomen, at behandling af neutrofiler med statiner, inhibitorer af 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A (HMG-CoA) reduktase, det hastighedsbegrænsende enzym i cholesterolbiosyntese, øger dannelsen af ​​NET. Men da statin behandling af neutrofiler udviser stærkere NET induktion sammenlignet med MβCD behandling (se Neumann et al. 15 og Chow et al. 20), yderligere virkninger af statiner fx på prenyleret membranforankret effektor proteins kan også være involveret i dannelsen af ​​NET.

Dannelsen af ​​NET er et relativt nyt beskrevet værtsforsvarsmekanisme. De ekstracellulære DNA fibre er nu blevet beskrevet, ikke kun i pattedyr 30, 31, men også i kylling, fisk, rejer, og planter 32, 33, 34, 35. Ved stimulering af neutrofilerne med patogener eller andre stimuli, er NET frigives i det ekstracellulære rum, hvor de indeslutter og eventuelt dræbe invaderende patogener 36. Studere lipidsammensætningen af ​​et aktiveret neutrofil kan hjælpe til at forstå de cellulære mekanismer, som medierer dets antimikrobielle aktivitet. Da vi kun måles totallipidekstrakten niveau af neutrofilerne, det er endnu ikke fastslået, hvorledes lipidindholdet adskiller og påvirkes af MβCD i hele celler versus plasma membraner og blandt forskellige membran mikro domæner. Dette kræver imidlertid specifikke procedurer membranseparation som beskrevet tidligere (Xu et al.). 37

Udover chromatin, humane NET indeholder adskillige neutrofile proteiner, såsom MPO; elastase, det antimikrobielle peptid LL-37; eller calgranulin 17, 36. Nyere forskning har fokuseret kraftigt på den rolle, som disse specifikke proteiner og morfologiske ændringer, som igangsætter og letter dannelsen af NET 15, 38, 39. Men indtil videre er der kun begrænset viden om betydningen af visse lipider under denne proces 15, 20. Derfor er dette en særlig interessant område, der skal udforskes nærmere i fremtiden. Endelig viden på lipidmembranen modifikationerkunne tjene som grundlag for terapeutiske tilgange til styrke immunforsvaret mod infektioner. Som et eksempel blev det vist, at udtømningen af kolesterol kan hjælpe med at bekæmpe antibiotikaresistente patogener, såsom H. pylori, idet det blev påvist, at cholesterol forøger modstanden af disse fejl mod antibiotika og antimikrobielle peptider 40. Lignende undersøgelser kan være nyttige for forståelsen af ​​vært-patogen interaktioner med forskellige bakteriearter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et fællesskab af Akademie für Tiergesundheit (Aid for Trade) og et stipendium fra ph.d.-studiet, "Animal og zoonotiske infektioner," fra University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, forudsat at Ariane Neumann.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A-21070
Anti-MPOα antibody Dako A0398
BSA Sigma-Aldrich 3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber Celeromics MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner Leica DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10x Sigma-Aldrich P5493-1L Dilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed Thermo Fisher Scientific 35503
Excel Microsoft 2010
DNA/Histone 1 antibody Millipore MAB3864
ImageJ NIH 1.8 http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope VWR 630-1554
Methyl-β-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4555-1G
PFA Carl Roth 0335.3 dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMA Sigma-Aldrich P8139-1MG Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Polymorphprep AXIS-SHIELD AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Invitrogen P7581
RPMI1640 PAA E 15-848
HBSS with CaCl and Mg Sigma H6648
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ml
Trypanblue Invitrogen 15250-061 0.4% solution
Water Carl Roth 3255.1 endotoxin-free
Name Company Catalog Number  Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol Sigma-Aldrich 33538
10 µL syringe Hamilton 701 NR 10 µl
Diethyl ether Sigma-Aldrich 346136
Ethyl acetate Carl Roth 7336.2
Canullla 26 G Braun 4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate Merck 1027805000
Chloroform Carl Roth 7331.1
CP ATLAS software Lazarsoftware 2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column Merck 152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster Hitachi HITA 892-0080-30Y Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector Hitachi 5410
HPLC Column Oven Hitachi 5310
HPLC Auto Sampler Hitachi 5260
HPLC Pump Hitachi 5160
Methanol Carl Roth 7342.1
n-Hexane Carl Roth 7339.1
Phosphoric acid Sigma-Aldrich 30417
Potassium chloride Merck 49,361,000
Potters LAT Garbsen 5 ml
SDS Carl Roth CN30.3
HPTLC silica gel 60 Merck 105553
Vacufuge plus basic device Eppendorf 22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom Sigma CLS3548
Coverslip Thermo Fisher Scientific 1198882
Glass slide Carl Roth 1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mL BD Bioscience 309659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
  2. Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
  3. Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
  4. Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
  5. Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
  6. Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
  7. Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
  8. Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
  9. Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
  10. Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
  11. Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
  12. Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
  13. Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
  14. Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
  15. Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
  16. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  17. von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
  18. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  19. Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
  20. Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  21. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
  22. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  23. Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
  24. Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
  25. Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
  26. Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
  27. Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
  28. Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
  29. Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
  30. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
  31. Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
  32. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
  33. Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  34. Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
  35. Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
  36. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  37. Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
  38. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  39. Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
  40. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).

Tags

Immunologi Neutrofiler Neutrofil Ekstracellulær Fælder (NET) kolesterol methyl-β-cyclodextrin (MβCD) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) High Performance Tyndtlagskromatografi (HPTLC)
Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. … More

Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. M., Reuner, F., Naim, H. Y., von Köckritz-Blickwede, M. Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps. J. Vis. Exp. (121), e54667, doi:10.3791/54667 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter