Summary
ومن المعروف أن الدهون تلعب دورا هاما في الوظائف الخلوية. هنا، نحن تصف طريقة لتحديد تكوين الدهون العدلات، مع التركيز على مستوى الكوليسترول في الدم، باستخدام كل HPTLC وHPLC للحصول على فهم أفضل للآليات الكامنة وراء العدلات تشكيل فخ خارج الخلية.
Abstract
تحليل الدهون التي يقوم بها عالية الأداء اللوني طبقة رقيقة (HPTLC) هو طريقة بسيطة نسبيا فعالة من حيث التكلفة لتحليل مجموعة واسعة من الدهون. تم الإبلاغ عن وظيفة الدهون (على سبيل المثال، في التفاعلات المضيف الممرض أو دخول المضيف) للعب دورا حاسما في العمليات الخلوية. هنا، وتبين لنا طريقة لتحديد تركيبة الدهون، مع التركيز على مستوى الكولسترول العدلات المشتقة من الدم الأولية، عن طريق HPTLC بالمقارنة مع الأداء العالي اللوني السائل (HPLC). وكان الهدف هو تحقيق دور التعديلات الدهون / الكوليسترول في تشكيل الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة). ومن المعروف الإفراج NET كآلية دفاع المضيف لمنع الجراثيم من الانتشار داخل المضيف. لذلك، تم علاج العدلات الإنسان المستمدة من الدم مع ميثيل β-السيكلودكسترين (MβCD) للحث على التعديلات الدهون في الخلايا. عن طريق HPTLC وHPLC، لقد أظهرنا أن العلاج MβCD الخلايا يؤدي إلى الدهونالتعديلات المرتبطة انخفاض كبير في محتوى الكوليسترول الخلية. وفي الوقت نفسه، أدت المعاملة MβCD من العدلات إلى تشكيل المستجدة، كما يتضح من الفحص المجهري المناعي. وخلاصة القول، هنا نقدم طريقة مفصلة لدراسة التعديلات الدهون في العدلات وتشكيل المستجدة.
Introduction
وقد ثبت الدهون لتلعب دورا هاما في توازن الخلايا، وموت الخلايا والتفاعلات المضيف الممرض، وإطلاق سراح خلوى 1. مع مرور الوقت، زادت الفائدة والمعرفة حول تأثير الدهون في التفاعلات المضيف الممرض أو التهاب، والعديد من المنشورات تأكيد الدور المحوري لبعض الدهون، خصوصا الكوليسترول الستيرويد، في الاستجابات الخلوية. العلاج الدوائي مع الستاتين، والتي تستخدم باسم مثبطات الكولسترول الحيوي من خلال منع 3-هيدروكسي-3-methylglutaryl-coenzym-A-اختزال (HMG-لجنة الزراعة اختزال)، يمكن أن تعمل كوكلاء المضادة للالتهابات عن طريق خفض مستويات المصل من انترلوكين (6) وبروتين سي التفاعلي (2). الكولسترول والهياكل التخصيب glycosphingolipid يمكن استخدامها من قبل العديد من مسببات الأمراض، مثل البكتيريا والفيروسات، كبوابة إلى المضيف 3، 4، 5،الطبقة = "XREF"> 6. الإسفنجية (على سبيل المثال، سفينغوميالين) وقد ثبت أن استخدامها من قبل مسببات الأمراض من أجل تعزيز المرضية من 7. في الضامة، واستخدام المتفطرات المجالات للدخول خلايا الكولسترول إثراء؛ استنزاف الكولسترول يمنع امتصاص الفطرية 8. وعلاوة على ذلك، أدى إصابة الضامة مع الفرنسيسيلة التولارية، وكيل الحيوانية مسؤولة عن حمى الأرانب (المعروف أيضا باسم حمى الأرانب) 9، لالعدوى التي ألغيت عندما تم المنضب الكولسترول من الأغشية 10. وبالمثل، وقد تجلى غزو الخلايا المضيفة التي كتبها القولونية عبر الهياكل غنية بالدهون لتكون 4 تعتمد على الكولسترول. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب السالمونيلا التيفية الفأرية العدوى من الخلايا الظهارية أن الكوليسترول ضروري للدخول الممرض إلى خلايا 11. الكولسترول استنزاف inhibiteد الإقبال على السالمونيلا 11. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أجرتها Gilk وآخرون. أظهرت أن الكولسترول يلعب دورا هاما في امتصاص كوكسيلة بورنيتية 12. بالإضافة إلى ذلك، تونغ وآخرون. وجدت أن 25 hydroxycholesterol يلعب دورا حاسما في البلعمة من قبل lipopolysaccharide في (LPS) -stimulated الضامة (13). تم تخفيض البلعمة عندما الضامة المعالجة الدوائية في استنزاف الكولسترول 14. وهكذا، والكولسترول والدهون الأخرى يبدو أن تلعب دورا هاما في العدوى والالتهابات، ومنذ نضوبها يمكن أن تقلل من خطر الغزو من عدة مسببات 10 و 11 و 12.
في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على إظهار أن التعديلات الدهون، وخاصة استنزاف الكولسترول من الخلايا، لحث على تشكيل extracellula العدلةالفخاخ ص (المستجدة) في العدلات المشتقة من الدم البشري 15. منذ اكتشاف المستجدة في عام 2004، وقد ثبت أن يلعب أدوارا حاسمة في فخ البكتيريا، وبالتالي في إعاقة انتشار العدوى 16 و 17. تتكون المستجدة من العمود الفقري الحمض النووي المرتبطة الهستونات، البروتياز، والببتيدات المضادة للميكروبات 16. الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات يمكن الناجمة عن غزو الجراثيم 18 و 19 و المواد الكيميائية مثل phorbol-ميريستيت-خلات (PMA) أو العقاقير المخفضة للكوليسترول 16 و 20. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية مفصلة، وخصوصا دور الدهون في هذه العملية، لا تزال غير واضحة تماما. تحليل الدهون يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات والتفاعلات الخلوية، مثل إطلاق سراح المستجدة. Cholesteرول وسفينغوميالين مقومات الحيوية للغشاء الخلية والدهون microdomains، حيث يضيفون الاستقرار وتسهيل تجميع البروتينات المتورطين في الاتجار البروتين ويشير أحداث 21. للتحقيق في دور الآلية من بعض الدهون، وكلاء الدوائية محبة للجهتين مثل قليل السكاريد دوري ميثيل β-السيكلودكسترين (MβCD)، ويمكن استخدامها لتغيير تركيبة الدهون من الخلايا وتقليل الكولسترول في المختبر 15. هنا، فإننا نقدم وسيلة لاستخدام HPTLC لتحليل تكوين الدهون العدلات ردا على MβCD. وقد استخدم HPLC لتأكيد مستوى الكولسترول في عدد العدلات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف طريقة لتصور تشكيل المستجدة بواسطة المجهر المناعي في العدلات المشتقة من الدم البشري ردا على MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على جمع الدم المحيطي في هذا البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية المحلية. قدمت جميع المواد البشرية المستنيرة خطية.
1. عزل العدلات المستمدة الدم الإنسان عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي
- عزل العدلات المشتقة من الدم البشري
- طبقة ~ 20 مل من الدم على 20 مل من الصوديوم دياتريزوات حل / ديكستران بالقرب من اللهب ودون خلط.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 470 x ج من دون فرامل.
- إزالة الخلايا وحيدة النواة وطبقة البلازما مصفر. نقل المرحلة خلية النوى (PMN) (المرحلة الثانية مع تراكم الخلايا، الشكلان 1 و 2) في جديد أنبوب 50 مل وملء ما يصل إلى 50 مل مع المياه المالحة الفوسفات مخزنة-1X (PBS).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 470 x ج مع الفرامل.
- إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه في 5 مل من الماء المعقم FOص 5 ثوان إلى ليز كريات الدم الحمراء.
- ملء فورا ما يصل الى 50 مل مع برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 470 ز س.
- إزالة طاف. يجب أن يكون بيليه الأبيض. إذا كان لا يزال أحمر، كرر الخطوات من 1.1.5 و1.1.6.
- إعادة تعليق بيليه في 1000 ميكرولتر من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المتوسطة. حساب عدد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق في عدادة الكريات تحت المجهر الضوئي.
- إعداد تعليق خلية في RPMI بتركيز 2 × 10 6 / مل. ما يقرب من 2.5 × 10 7 العدلات يمكن حصاده من 20 مل من الدم.
- العلاج الدوائي للعدلات لتحليل الدهون
- استخدام 5 × 10 7 خلايا من الخطوة 1.1.9. ضبط عدد الخلايا في الخالص المتوازن المتوسطة Hank's محلول الملح (HBSS) في وجود أو غياب 10 ملي MβCD أو 25 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية في إجمالي حجم 300 ميكرولتر في أنبوب رد فعل 1.5 مل.
- احتضان هذه العينات فيأنابيب رد فعل لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 470 x ج مع الفرامل.
- إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه خلية في 300 ميليلتر من HBSS.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 470 x ج مع الفرامل.
- إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من الكلوروفورم / الميثانول (1: 1)، التجانس مع قنية 26-G من امتصاص العينة الدخول والخروج إلى حقنة 1 مل 10 مرات، وتخزين العينات في -20 ° C.
- العلاج الدوائي للعدلات لتقدير صافي المناعي
- إعداد بولي-L-ليسين المغلفة لوحات 48-جيدا مع coverslips الزجاج.
- مكان واحد ساترة الزجاج 8 ملم في كل بئر، إضافة 55 ميكرولتر من العقيمة 0.01٪ بولي-L-ليسين، واحتضان ل~ 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- يغسل مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تخزين لوحات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر في الثلاجة حتى المطلوبة.
- سيارةefully إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية (2 × 10 5/100 ميكرولتر) من الخطوة 1.1.9 لكل بئر في وسط كل ساترة.
- إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر إما النهائي 10 ملي MβCD أو النهائي 25 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 370 x ج مع الفرامل.
- احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 370 x ج مع الفرامل.
- إصلاح الخلايا مع 155 ميكرولتر من 4٪ PFA، والانتهاء منها في فيلم البارافين البلاستيك، وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 10 دقيقة في RT.
ملاحظة: للحصول على بيانات عن تشكيل NET الناجمة عن MβCD، يرى نيومان وآخرون. 15.
- إعداد بولي-L-ليسين المغلفة لوحات 48-جيدا مع coverslips الزجاج.
2. عزل وتحليل العدلات المشتقة من الدم البشري الدهون
- عزل الدهون من العدلات المشتقة من الدم المحيطي الإنسان على أساس بليغ وداير 22 وBrogden وآخرون. 23
- على الجليد، ماصة العدلات (موجودة في الميثانول وحل الكلوروفورم) إلى أنبوب زجاجي المسمار الحد الأقصى 15 مل مع (PTFE) ختم تترافلوروإيثيلين والتجانس لهم عن طريق هز لمدة 1 دقيقة. استخدام أنابيب زجاجية لمنع الدهون من الربط إلى السطوح البلاستيكية. استخدام PTFE قبعات لمنع التلوث من المطاط / البلاستيك.
- إضافة 2 مل من الميثانول ثم بعد 1 دقيقة بنسبة 1 مل من الكلوروفورم. يهز مرة أخرى لمدة 1 دقيقة.
- تدوير أنابيب زجاجية في RT و 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
- بيليه جزء البروتين بواسطة الطرد المركزي الحل في 7 ° C و1،952 x ج لمدة 10 دقيقة.
- صب بعناية طاف في 15 مل أنبوب زجاجي المسمار الحد الأقصى الجديد، وترك بيليه التي تحتوي على البروتين وراء. تخزين بيليه في -20 درجة مئوية لمدة الكمي في المستقبل.
- إضافة 1 مل من الكلوروفورم، وانتظر 1 دقيقة، إضافة 1 مل من الماء المقطر المزدوج، وعكس الزجاج أنبوب المسمار الحد الأقصى مع العينة لمدة 30 ثانية.
- إذا لزم الأمر، إجراء مزيد من خطوة تنقية اختياري بتكرار الخطوة 2.1.8.
- تجفيف العينات في فراغ مكثف في 60 ° C وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
- إعداد أربعة حلول تشغيل التالية والحل تلطيخ.
- الحل 1: مزيج خلات الإيثيل (26.6٪)، 1-بروبانول (26.6٪)، والكلوروفورم (26.6٪)، والميثانول (26.6٪)، وكلوريد البوتاسيوم (9.6٪). إعداد بوكل بحل 0.25 غرام من بوكل في 100 مل من الماء ذات جودة HPLC.
- الحل 2: مزيج ن الهكسان (73٪)، ايثر (23٪)، وحمض الستريك (2٪).
- حل 3: 100٪ ن الهكسان.
- إعداد الحل تلطيخ بواسطةخلط الماء المقطر (90 مل) مع 7.5 غرام من كبريتات النحاس، ثم قم بإضافة 10 مل من حمض الفوسفوريك.
- ملء تصل إلى 5 ملم من كل الحل في غرفة زجاجية منفصلة. إضافة أي نوع من ورق الترشيح لزيادة سرعة الجري في كل غرفة.
- قبل احتضان 20 × 10 سم HPTLC هلام السيليكا 60 لوحة من الزجاج في حل تشغيل أول حتى يصل إلى حل تشغيل الجزء العلوي من لوحة. ثم تجف لمدة 10 دقيقة في 110 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين هذه اللوحات لاستخدامها في المستقبل في رقائق الألومنيوم والمجففة لمدة 10 دقيقة في 110 درجة مئوية قبل استخدامها. - حل بيليه الدهون التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.1.10 في 200 ميكرولتر من كلوروفورم / الميثانول (1: 1) حل واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية إلى حل.
- استخدام مسطرة وقلم رصاص لينة بمناسبة البقع تحميل لالعدد المرغوب فيه من العينات، بالإضافة إلى معيار واحد على الأقل. علامة المسافة التوالي في حوالي 4 سم و 6 سم من أجل حل تشغيل الأول والثاني على التوالي.
- لتحميل العينات، وغسل حقنة 10 ميكرولتر 3 مرات في الكلوروفورم / الميثانول (1: 1) قبل تحميل كل عينة جديدة. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة قطرة من الحكمة، في محاولة للتركيز على عينة صغيرة كمجال ممكن. يجب أن يتم تحميل عينات على الأقل في مكررة.
- وضع لوحة عموديا في الغرفة الأولى مع تشغيل الحل 1 (الخطوة 2.2.1.1). تأكد من أن لوحة موازية لجدار غرفة زجاجية لتحقيق سرعة الهجرة موحدة.
- مرة واحدة وصلت الى خط المذيبات العلامة الأولى، وإزالة لوحة، وجففه، ووضعه في الحل الثاني. كرر خطوات مماثلة للمرة الثانية وللحلول تشغيل ثالثة؛ ترك لوحة في الحل حتى تصل الجبهة المذيبات الجزء العلوي من لوحة، ثم إزالة وجففها في RT لمدة 1 دقيقة.
- وضع لوحة في محلول كبريتات النحاس لمدة 7 ق. إزالة لوحة، وجففه جيدا، وخبز في الفرن لمدة 7 دقائق في 170 ° C. انتظر لوحة لتبرد.
- باليودنانوغرام واللوني طبقة رقيقة وبرامج التحليل هلام، فضلا عن برامج معالجة الصور، مسح وتحليل كما هو موضح سابقا من قبل Brogden وآخرون. 23.
- إرفاق العمود 100 × 4.6 مم إلى 5 ميكرون / 4.6 مم خرطوشة حارس والحرارة إلى 32 ° C. استخدام الميثانول كمرحلة النقالة بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة عند 65 بار والأشعة فوق البنفسجية للكشف عن قياس في 202 نانومتر لقياس كمية الكولسترول في كل عينة.
- غسل آلة HPLC السابقة بدقة لتحليل العينات، تنفيذ الخطوات التالية: تنظيف مضخة، وغسل الإبرة، والشطف وعاء، وتطهير حقنة، وغسل تطهير المضخة. يغسل كل بالماء. وأخيرا، إجراء تطهير النظام مع الميثانول بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق.
- لإنشاء منحنى الكولسترول القياسية، وإعداد لا يقل عن 4 تركيزات تتراوحمن 0.05 ملغ / مل إلى 2 ملغ / مل من الكولسترول في الكلوروفورم / الميثانول (1: 1) 24.
- إعادة تعليق العينات التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.1.10 في 500 ميكرولتر من كلوروفورم / الميثانول (1: 1) في زجاجات 1.5 مل غلاس بلون الكهرمان مع برغي أعلى PTFE أحمر / الأغطية سيليكون البيضاء.
- قياس تركيزات الكوليسترول باستخدام معيار أعدت في الخطوة 2.3.3.
ملاحظة: املأ بروتوكول أخذ العينات، بدءا من سيطرة واحد على الأقل معيار واحد السلبية، تليها عينات. - التعبير عن النتائج على النحو المساحة تحت منحنى والمقارنة بين عينات المناسبة باستخدام أي برنامج الإحصائي.
ملاحظة: يمكن أيضا نتائج يكون كميا ضد منحنى القياسية، ويمكن كما هو مبين المبلغ الإجمالي الكولسترول لكل مليلتر، ز، أو عدد من الخلايا. ينبغي أن تحسب المعادلة منحنى القياسية باستخدام القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.3.
3. التصور والكمي لالمستجدة
- فيماualization والمستجدة
ملاحظة: ويستند هذا التصور المستجدة على الأعمال المنشورة سابقا من قبل نيومان وآخرون. 15.- غسل العينات ثابتة من الخطوة 1.3.8 3 مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
- كتلة وpermeabilize مع 100 ميكرولتر من 2٪ BSA، 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لكل بئر لمدة 45 دقيقة في RT.
- إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية: وحيدة النسيلة الماوس المضادة DNA-هيستون 1-الأجسام المضادة (تمييع الأسهم مع 2.2 ملغ / مل 1: 5000 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100) أو الأجسام المضادة بولكلونل ضد الميلوبيروكسيديز (MPO. أرنب المضادة للMPO، تمييع 1: 300 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل 3 مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (مضان المسمى الماعز المضادة للماوس، 1: 1000 في BSA-PBS-تريتون X-100 و الماعز المضادة للأرنب، 1: 1000 X-100 BSA-PBS-تريتون) لمدة 1 ساعة عند RT في الظلام.
- يغسل 3 مرات مع 200 & #181؛ L من برنامج تلفزيوني 1X.
- إزالة coverslips باستخدام الملقط ووضعها وجهه لأسفل مع 3 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة التي تحتوي على دابي على الشرائح الزجاجية.
- فحص العينات باستخدام متحد البؤر مقلوب قاعدة مضان المجهر مجهزة HCX PL APO 40X 0،75-1،25 النفط الهدف الغمر 15.
- تقدير حجم نواة لإفراز NET
- فتح برنامج معالجة الصور (مثل يماغيج) وسحب وإسقاط صورة الفائدة في شريط الأدوات.
- انقر على "الإضافات"، "تحليل"، و "مكافحة خلية".
- اضغط على زر "تهيئة" في إطار مكافحة واختيار نوع المضاد (على سبيل المثال، انقر على 7 باللون الأحمر لخلايا إطلاق NET و 8 باللون الأصفر للخلايا غير الإفراج، كما هو معروض في الشكل 6B-الأول والثاني).
ملاحظة: معايير للخلايا-NET إيجابي: ملطخة إيجابيا نواة خضراء + لnucleu أقل كثافةالصورة (فقدان تفصص) أو فقدان شكل دائري النواة + زيادة حجم النواة، أو حدوث خارج الخلية متميزة من تبادل لاطلاق النار. - انقر كل التمسك الخلية إلى المعايير المذكورة أعلاه وكتابة عدد الخلايا عدها في ورقة البيانات من برامج التحليل.
- حساب النسبة المئوية للخلايا إطلاق NET باستخدام أعداد الخلايا معدود من الخلايا الإفراج NET وغير اطلاق سراحهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم عزل العدلات المشتقة من الدم البشري عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة (الشكل 2). لدراسة تأثير التغيرات الدهون على العدلات، وعولج الخلايا مع 10 ملي MβCD، الذي يستنزف الكولسترول من الخلية. وفي وقت لاحق، تم عزل الدهون من العينات التي كتبها بليغ وداير (الشكل 1، يسار لوحة)، كما وصفها Brogden وآخرون. 23. تم تحميل عينات الدهون أعدت على لوحات HPTLC هلام السيليكا والتشغيل باستخدام بروتوكول ثلاثة حل، والتي تم الأمثل لفصل وتصور مجموعة واسعة من الدهون، بما في ذلك الكوليسترول، استرات الكوليسترول، سفينغوميالين، الدهون الفوسفاتية، وtriacylglycerides، والأحماض الدهنية الحرة ، monoacylglycerol، فسفاتيديل إيثانولامين، كارديوليبين، فسفاتيديل، وفسفاتيديل (الشكل 3A). المشتقات المؤكسج من الكولسترول (oxysterols) ليست للكشف ثإيث هذا الأسلوب. تم إجراء تحليل كمي إضافي من الكوليسترول باستخدام HPLC (الشكل 3B). وبلغت قيمة التراجع عن الكولسترول بشكل ملحوظ أفضل عند استخدام HPLC الشكل (4A) مقارنة HPTLC (الشكل 4B). لتصور المستجدة، وحفز الخلايا مع المحفزات المذكورة أعلاه، الثابتة والملون لDNA / هيستون 1 (الأخضر)، MPO (الحمراء)، والحمض النووي (الأزرق) علامات NET كما نموذجية (الشكل 5A). كما هو معروض في الشكل 5A، وهو أمر واضح للMPO، DNA / هيستون 1، ويحدث DNA في شباك عندما تم علاج الخلايا مع 10 ملي MβCD لمدة 2 ساعة. وفي وقت لاحق، تم تحليل المجهر تأثير خفض الكولسترول. لذلك، كانت ملطخة خلايا الحمض النووي (الأزرق) وDNA / هيستون 1 (الأخضر)، واحصي نوى بين الافراج عن NET باستخدام البرنامج المساعد خلية مكافحة من يماغيج برامج معالجة الصور (الشكل 5B). خدم العدلات غير المعالجة كعنصر تحكم عن spontaneouق NET تشكيل (الشكل 5B-ط). في الشكل المعروض، وإطلاق سراح NET في العدلات غير المعالجة بعد 2 ساعة من الحضانة 3.89٪، في حين أسفرت علاج الخلايا مع 10 ملي MβCD في 35.17٪ NET تشكيل (الشكل 5B).
الشكل 1: عرض تخطيطي الخطوات المتبعة في تحديد تركيبة الدهون وخارج الخلية الإفراج فخ من العدلات المشتقة من الدم البشري. يتم عزل العدلات باستخدام التدرج الكثافة وتعامل مع ميثيل β-السيكلودكسترين (MβCD) للحث على التعديلات الدهون وتشكيل NET. بعد ذلك، يتم عزل الدهون وتحليلها باستخدام إما HPTLC أو HPLC، وتصور المستجدة وكميا المناعي.
الشكل (3): HPTLC وHPLC تحليل الدهون معزولة عن العدلات. (A) معيار يستخدم لتحديد نسبة الدهون الموجودة في العدلات عبر HPTLC (الممر الأيسر). CE: استرات الكوليسترول، TG: Triacylglycerides، FFA: الأحماض الدهنية الحرة، تشول: نسبة الكولسترول في الدم، MG: Monoacylglycerol، PE: فسفاتيديل إيثانولامين، CL: كارديوليبين، PS: فسفاتيديل، PC: فسفاتيديل، وSM: سفينغوميالين. (B) نتيجة الممثل تظهر ذروة الكولسترول محدد ل2 ملغ / مل في 4.980 دقيقة باستخدام بروتوكول HPLC هو موضح هنا.
يحلل HPLC وHPTLC من الكولسترول: الشكل 4. الرسوم البيانية التي تبين العلاقة بين تركيز الكولسترول والمنطقة، مقاسا HPLC (A)، وشدة الفرقة، مقاسا HPTLC (B). وكان الحد الأدنى للكشف HPLC 0.0016 ملغ / مل، مع قيمة الانحدار لمنحنى مستوى 0.998 N = 3، SEM (A). الكولسترول بدءا من 2 ملغ / مل وصولا الى 0.05 ملغ / مل يمكن أن يكون شبه كميا باستخدام HPTLC (B)، مع حد أدنى من الكشف عن 0.05 ملغ / مل N = 3، SEM. قيمة الانحدار لمنحنى قياسي HPTLC هي 0.918.
الشكل 5: الميكروسكوب مضان التمثيلية التي تظهر الهياكل NET وsubsequent الكمي NET. (A) العدلات حفز مع 10 ملي MβCD لكانت ملطخة 2 ساعة ل(ب) MPO (أحمر)، (ج) DNA / هيستون 1 (الأخضر)، و (د) DNA (الأزرق). (ط) تراكب من (ب)، (ج)، و (د). وحضنت (B) الخلايا لمدة 2 ساعة مع (ط) HBSS المتوسطة أو (ب) 10 ملي MβCD، وشبكات صدر كانت ملطخة للنواة (الأزرق) وDNA / هيستون 1 (الخضراء). وتميزت نوى NET سلبية مع عداد 8 (الصفراء) و-NET إيجابي نوى مع عداد 7 (الحمراء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المذكورة هنا يمكن استخدامها لتحليل الدهون محددة، مثل الكولسترول، عن طريق HPTLC أو HPLC والتحقيق في آثار التعديلات الدهون الدوائية على تشكيل المستجدة (انظر نيومان وآخرون 15).
HPTLC هو طريقة فعالة من حيث التكلفة وبسيطة نسبيا لتحليل مجموعة واسعة من الدهون في عدد كبير من العينات. وقد استخدم هذا الأسلوب في العديد من المجالات البحثية، بما في ذلك تقدير المضادات الحيوية 25، تخزين الدهون في أمراض التخزين الليزوزومية 26، وتحديد مستويات الكوليسترول في الدم وcholesterylglucoside في الخلايا الظهارية (27). تم تعديل الأسلوب هو موضح هنا والأمثل لعزل الدهون من سكان العدلة تنقيته. ومع ذلك، فإن صيغة معدلة بشكل طفيف ويمكن أيضا أن تستخدم لعزل الدهون من عينات الأنسجة (انظر Brogden وآخرون. 23). استخدام هذا التقىهود، والدهون يمكن أيضا فصل على نحو فعال، وحددت، وشبه كميا ضد معيار معروف. خطوة حاسمة في هذه الطريقة هي استخدام المخزن المؤقت اسمه منها، لأن استخدام أي عازلة أو وسيلة أخرى قد تؤدي إلى تلوث الدهون وشرائح الدهون غير محددة في العينات. منذ حساسية محدودة مع HPTLC، HPLC ينبغي أن تستخدم كوسيلة من وسائل أكثر دقة لتقدير المطلق.
HPLC يسهل تقدير وتحديد نسبة الكوليسترول وأشكاله المختلفة أو المشتقات عن طريق إجراء المقارنة إلى الدهون المعروفة. باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، فمن الممكن لقياس بشكل موثوق وصولا الى 0.0016 ملغ / مل الكولسترول (الشكل 4A)، مع نسبة الخطي تصل إلى 10 ملغ / مل (R = 0.990). طريقة HPTLC تمكين الكشف عن الكولسترول وصولا الى 0.05 ملغ / مل، ولكن مع منحنى السيني وانخفاض معامل الارتباط من R = 0.906 (الشكل 4B). ارتفاع حساسية وأعلى الارتباط مما يجعل معامل HPLC طريقة متفوقة كثيرا لتقدير الدقيق للدهون، والتي تمكن في وقت لاحق الخلافات الصغيرة بين عينات ليتم الكشف. ومع ذلك، على حد سواء أساليب يمكن استخدامها في تركيبة. HPTLC يمكن استخدامها للحصول على نظرة عامة إلى التي يمكن أن تغير الدهون، وHPLC يمكن استخدامها في نهج أكثر استهدافا لتحديد الفرق من الدهون معين في عينة معينة. عند مقارنة قياساتنا مع القيم التي تم الحصول عليها من قبل الآخرين 28، 29، كان كميا أقل نسبة الكولسترول في مجموع العدلات. ويمكن تفسير ذلك من خلال المنهجية المستخدمة. استخدمت دراسات أخرى كشف fluorimetric، والتي تقوم على رد الفعل إلى جانب الانزيم الذي يكشف كل من الكوليسترول الحر وcholesterylesters.
هنا، يتم استخدام HPTLC وHPLC في تركيبة للتحقق من أن MβCD يؤدي إلى انخفاض كبير في نسبة الكولسترول كما تبين أيضا من قبل Gorudko وآخرون.SS = "XREF"> 28. أنها أظهرت انخفاضا 60٪ من الكولسترول في العدلات بنسبة 10 ملي MβCD. بالإضافة إلى ذلك، كان انخفاض طفيف في مستوى سفينغوميالين ولكن ليس استرات الكوليسترول كشف في العدلات عندما تعامل مع MβCD (انظر نيومان وآخرون 15). في نفس الوقت، واستنزاف الكولسترول يؤدي إلى تشكيل المستجدة (انظر نيومان وآخرون 15). هذه الحقائق تتطابق جيدا مع هذه الظاهرة أن العلاج العدلات مع الستاتين، مثبطات 3-هيدروكسي-3 methylglutaryl أنزيم (HMG-COA) اختزال، الانزيم معدل الحد في الكولسترول الحيوي، يعزز تشكيل المستجدة. ومع ذلك، منذ علاج ستاتين العدلات المعارض أقوى تحريض NET بالمقارنة مع العلاج MβCD (انظر نيومان وآخرون 15 وتشو وآخرون. 20)، آثار إضافية من العقاقير المخفضة للكوليسترول مثلا على prenylated غشاء الراسية المستجيب المتواجدويمكن أيضا أن تشارك الإضافية في تشكيل المستجدة.
تشكيل المستجدة هي آلية دفاع المضيف وصفه جديدة نسبيا. وقد تم حتى الآن وصف الألياف DNA خارج الخلية، ليس فقط في الثدييات 30 و 31، ولكن أيضا في الدجاج والسمك والجمبري، والنباتات 32 و 33 و 34 و 35. على تحفيز العدلات مع مسببات الأمراض أو غيرها من المحفزات، يتم الافراج المستجدة في الفضاء خارج الخلية، حيث اصطاد وربما قتل الجراثيم الغازية 36. دراسة تكوين الدهون من العدلات تنشيط قد تساعد على فهم الآليات الخلوية التوسط نشاطها المضادة للميكروبات. وبما أننا يقاس فقط على مستوى الدهن الكلي للالعدلات، يبقى أن تحدد كيف يختلف محتوى الدهون ويتأثر MβCD في خلية كاملة مقابل بلاسالأغشية أماه وبين مختلف المجالات غشاء الصغيرة. ومع ذلك، وهذا يتطلب إجراءات فصل غشاء محددة كما هو موضح سابقا (شو وآخرون). 37
وبالاضافة الى لونين، وشبكات الإنسان تحتوي على العديد من البروتينات العدلات، مثل MPO. الإيلاستاز، الببتيد مضادات الميكروبات LL-37؛ أو كالغرانيولين 17، 36. وقد ركزت البحوث التي أجريت مؤخرا بشكل كبير على دور هذه البروتينات المحددة والتغييرات الشكلية، التي بدء وتسهيل تشكيل المستجدة 15 و 38 و 39. ومع ذلك، حتى الآن، وهناك المعرفة حول أهمية بعض الدهون يقتصر فقط خلال هذه العملية 15 و 20. لذلك، هذا هو مجال اهتمام بوجه خاص إلى استكشاف بمزيد من التفصيل في المستقبل. وأخيرا، والمعرفة على التعديلات غشاء الدهونيمكن أن تكون بمثابة أساس لأساليب علاجية لتعزيز جهاز المناعة ضد العدوى. وكمثال على ذلك، فقد تبين أن استنزاف الكوليسترول قد تساعد في مكافحة مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية مثل بكتيريا، منذ أن تبين لها أن الكوليسترول يزيد من مقاومة تلك الحشرات ضد المضادات الحيوية والببتيدات المضادة للميكروبات 40. قد يكون دراسات مماثلة مفيدة لفهم التفاعلات المضيف الممرض مع الأنواع البكتيرية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل زمالة أكاديمي FÜR Tiergesundheit (AFT) وزمالة من برنامج الدكتوراه، "الحيوانية والحيوانية المنشأ التهابات،" من جامعة الطب البيطري، هانوفر، ألمانيا، شريطة أن أريان نيومان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
