Summary
ליפידים ידועים לשחק תפקיד חשוב פונקציות הסלולר. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע את הרכב השומנים של נויטרופילים, עם דגש על רמת הכולסטרול, על ידי שימוש בשני HPTLC ו HPLC כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים של היווצרות מלכודת תאי נויטרופילים.
Abstract
ניתוח ליפידים בביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה ביצועים גבוהים (HPTLC) הוא שיטה פשוטה יחסית, חסכונית לנתח מגוון רחב של שומנים. הפונקציה של ליפידים (למשל, באינטראקציות מארח הפתוגן או כניסה מארחת) דווחה לשחק תפקיד מכריע בתהליכים תאיים. הנה, אנחנו מראים שיטה לקביעת רכב שומנים, עם דגש על רמת הכולסטרול של נויטרופילים בדם נגזרות עיקריים, על ידי HPTLC בהשוואת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). המטרה הייתה לבדוק את תפקידו של שינויי שומנים / כולסטרול היווצרות מלכודות תאי נויטרופילים (נטס). שחרור NET ידוע כמנגנון הגנה מארחת כדי למנוע פתוגנים מלהתפשט בתוך הפונדקאי. לכן, נויטרופילים אדם נגזר דם טופלו מהתיל-β-cyclodextrin (MβCD) כדי לגרום שינויי שומנים בתאים. שימוש HPTLC ו HPLC, אנחנו הראינו שטיפול MβCD של תאי מוביל שומניםשינויים קשורים לירידה משמעותית תוכן הכולסטרול של התא. במקביל, טיפול MβCD של נויטרופילים הוביל להיווצרות של הנטס, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. לסיכום, כאן אנו מציגים שיטה מפורטת ללמוד שינויי שומנים ב נויטרופילים ויצירת רשתות.
Introduction
ליפידים הוכחו ממלאים תפקידים חשובים הומאוסטזיס תא, מוות של תאים, אינטראקציות מארח הפתוגן, ציטוקינים שחרור 1. במשך הזמן, עניין וידע על ההשפעה של שומנים אינטראקציות מארח הפתוגן או דלקת גדלו, וכמה פרסומים לאשר את התפקיד המרכזי של שומנים מסוימים, ובמיוחד כולסטרול סטרואידים, בתגובות הסלולר. טיפול תרופתי בסטטינים, אשר משמשים מעכבי ביוסינתזה כולסטרול על ידי חסימת 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-coenzym-A-רדוקטאז (HMG-CoA-reductase), יכול לשמש סוכני אנטי דלקתיות כמו על ידי הורדת רמות בסרום של אינטרלוקין 6 ו 2 חלבון תגובתי C-. ניתן להשתמש Cholesterol- ומבנים מועשר glycosphingolipid ידי כמה פתוגנים, כגון חיידקים ווירוסים, כשער אל המארח 3, 4, 5,class = "Xref"> 6. ספינגוליפיד (למשל, ספינגומיילין) הוכח להיות בשימוש על ידי פתוגנים לקדם פתוגניות שלהם 7. מקרופאגים, השימוש mycobacteria כולסטרול מועשר תחומים להזנת התאים; דלדול של כולסטרול מעכב ספיגת mycobacterial 8. יתר על כן, זיהום של מקרופאגים עם Francisella tularensis, סוכן zoonotic אחראי טולרמיה (הידוע גם בשם קדחת ארנב) 9, הוביל לזיהום כי בוטלה כאשר הכולסטרול הידלדלה מחמת ממברנות 10. באופן דומה, הפלישה של תאים לארח על ידי coli Escherichia באמצעות מבני שומנים עשירים הודגמה להיות כולסטרול תלוי 4. יתר על כן, ניסויי זיהום סלמונלה typhimurium של תאי האפיתל הוכיחו כי הכולסטרול הוא חיוני עבור כניסת הפתוגן לתוך התאים 11. כולסטרול דלדול inhibiteד הספיגה סלמונלה 11. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה על ידי אל Gilk et. כולסטרול הוכיח כי ממלא תפקיד חשוב ב ספיגת Coxiella burnetti 12. בנוסף, Tuong ואח. נמצא כי-hydroxycholesterol 25 משחקת תפקיד מכריע phagocytosis ידי lipopolysaccharide (LPS) -stimulated מקרופאגים 13. Phagocytosis הופחתה כאשר מקרופאגים טופלו פרמקולוגית כדי לרוקן כולסטרול 14. לפיכך, כולסטרול ושומנים אחרים נראו לשחק תפקיד חשוב זיהום ודלקת, מאז הדלדול שלהם יכול להפחית את הסיכון של פלישה מכמה פתוגנים 10, 11, 12.
לאחרונה, הצלחנו להראות כי שינויי שומנים, ובעיקר הדלדול של כולסטרול מן התא, לגרום להיווצרות extracellula נויטרופיליםמלכודות r (נטס) ב נויטרופילים בדם הנגזרות אנושי 15. מאז גילוי נטס ב 2004, הם הוכחו תפקיד קריטי מלכוד חיידקי, ובכך להוות מכשול התפשטות הזיהום 16, 17. רשתות מורכבות של עמוד השדרה DNA הקשורים היסטונים, פרוטאזות, ופפטידים מיקרוביאלית 16. המהדורה של הנטס על ידי נויטרופילים יכול להיגרם על ידי הפולשים פתוגנים 18, 19 ו חומרים כימיים כגון phorbol-myristate-אצטט (PMA) או סטטינים 16, 20. עם זאת, המנגנונים הסלולר המפורטים, ובמיוחד התפקיד של שומנים בתהליך הזה, הם עדיין לא ברורים לחלוטין. הניתוח של שומנים יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים העוסקים במגוון רחב של תהליכים תאיים ואינטראקציות, כגון שחרור נטס. Cholesteרול ו ספינגומיילין הם מרכיבים חיוניים של microdomains קרום התא השומנים, שם הם מוסיפים יציבות להקל על התקבצות של חלבונים המעורבים בסחר חלבון איתות אירועים 21. בכדי לחקור את תפקיד מכניסטית של שומנים מסוימים, סוכנים תרופתי amphiphilic, כגון מתיל-β-cyclodextrin oligosaccharide מחזורית (MβCD), שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הרכב השומנים של התא כדי להפחית כולסטרול במבחנה 15. כאן, אנו מציגים שיטה להשתמש HPTLC לנתח את הרכב השומנים של נויטרופילים בתגובה MβCD. HPLC שימש כדי לאשר את רמת הכולסטרול באוכלוסיה נויטרופילים. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לחזות ההיווצרות של הנטס על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence ב נויטרופילים בדם נגזרות אנושיים בתגובת MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
האוסף של הדם ההיקפי בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת אתיקה לניסויים בבני אדם המקומית. כל בבני אדם נתן את הסכמתו מדעת בכתב שלהם.
1. ניתוק של נויטרופילים הנגזרים דם אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות
- בידוד של נויטרופילים בדם נגזרות האנושיים
- שכבה ~ 20 מ"ל של דם על 20 מ"ל של נתרן diatrizoate / פתרון dextran ליד להבה וללא ערבוב.
- צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 470 XG בלי בלמים.
- הסרת התאים חד הגרעיניים ואת שכבת הפלזמה הצהבהבה. מעבירים את תא polymorphonuclear שלב (PMN) (השלב השני עם צבירת תאים; איורים 1 ו 2) לתוך צינור 50 מ"ל חדש ולמלא אותו עד 50 מ"ל עם בופר פוספט 1x (PBS).
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 470 XG עם הבלם.
- הסר את supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 מ"ל של מים סטריליים FOr 5 ים כדי lyse אריתרוציטים.
- מיד למלא עד 50 מ"ל עם 1x PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 470 גרם x.
- הסר את supernatant. הגלולה צריכה להיות לבנה. אם זה עדיין אדום, חזור על שלבים 1.1.5 ו 1.1.6.
- Resuspend גלולה 1000 μL של מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני. ספירת תאים באמצעות מכתים כחול trypan בתוך hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור.
- כן השעית תא RPMI בריכוז של 2 x 10 6 / מיליליטר. כ 2.5 x 10 7 נויטרופילים ניתן לקצור 20 מ"ל של דם.
- טיפול תרופתי של נויטרופילים לניתוח שומנים
- השתמשו 5 x 10 7 תאים משלב 1.1.9. התאם את מספר התא פתרון Hank's מאוזן מלח טהור (HBSS) בינוני בנוכחות או בהיעדר 10 מ"מ MβCD או 25 ננומטר PMA בנפח כולל של 300 μL בצינור התגובה 1.5 מ"ל.
- דגירת הדגימות בצינורות תגובה עבור 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 470 XG עם הבלם.
- הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלול 300 μL של HBSS.
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 470 XG עם הבלם.
- Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של כלורופורם / מתנול (1: 1), homogenize אותו עם צינורית 26-G על ידי מציצת המדגם פנימה והחוצה לתוך מזרק 1 מ"ל 10 פעמים, ולאחסן את דגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
- טיפול תרופתי של נויטרופילים עבור כימות NET ידי immunofluorescence
- כן פולי- L- ליזין מצופה צלחות 48-היטב עם coverslips זכוכית.
- מניחים coverslip זכוכית אחד 8 מ"מ בכל טוב, להוסיף 55 μL של 0.01% פולי- L- ליזין סטרילי, דגירה ~ 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- לשטוף פעמיים עם 200 μL של 1x PBS. אחסן את הצלחות עם 200 μL של 1x PBS לכל היטב במקרר עד לשימוש.
- אוטוefully להוסיף 100 μL של ההשעיה תא (2 x 10 5/100 μL) משלב 1.1.9 לכל היטב במרכז כל coverslip.
- הוספת 100 μL לכל היטב גם את 10 הסופי מ"מ MβCD או PMA 25 ננומטר הסופי.
- צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 370 XG עם הבלם.
- דגירה של 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 370 XG עם הבלם.
- תקן את התאים עם 155 μL של 4% PFA, לעטוף אותם בסרט פרפין פלסטיק, ולאחסן אותם לילה בשעה 4 ° C או 10 דקות ב RT.
הערה: לקבלת מידע על היווצרות NET המושרה על ידי MβCD, לראות אל נוימן ואח. 15.
- כן פולי- L- ליזין מצופה צלחות 48-היטב עם coverslips זכוכית.
בידוד ליפידים 2. וניתוח של נויטרופילים אדם נגזר דם
- לבודד את השומנים מן נויטרופילים היקפי דם הנגזרות האנושי מבוסס על בליי דאייר 22 ו Brogden ואח. 23
- על קרח, פיפטה נויטרופילים (נוכח מתנול פתרון כלורופורם) לצינור הזכוכית 15 מ"ל הברגה כובע עם חותם polytetrafluoroethylene (PTFE) ו homogenize אותם בטלטול עבור 1 דקות. השתמשו בצינורות זכוכית כדי למנוע את הליפידים מלהיקשר משטחי פלסטיק. השתמש PTFE כובעים כדי למנוע זיהום גומי / פלסטיק.
- להוסיף 2 מ"ל של מתנול ואחריו 1 דקות מאוחר יותר על ידי 1 מ"ל של כלורופורם. נער שוב עבור 1 דקות.
- סובב את צינורות זכוכית ב RT ו 50 סל"ד במשך 30 דקות.
- גלול שבריר החלבון על ידי צנטריפוגה הפתרון ב 7 מעלות צלזיוס ו 1952 XG במשך 10 דקות.
- בזהירות למזוג supernatant לתוך צינור בורג מכסה זכוכית חדש 15 מ"ל, עוזב את גלולה המכילה חלבון מאחורי. אחסן את הגלולה ב -20 ° C עבור כימות בעתיד.
- להוסיף 1 מ"ל של כלורופורם, לחכות 1 דקות, להוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים, וגם להפוך את הצינור בורג מכסה זכוכית עם המדגם עבור 30 s.
- אם נדרש, לבצע צעד טיהור נוסף אופציונאלי ידי חזרת צעד 2.1.8.
- ייבש את דגימות רכז ואקום ב 60 מעלות צלזיוס ולאחסן אותם ב -20 ° C עד נדרשים.
- הכן את פתרונות ריצת ארבעה באי פתרון מכתים.
- פתרון 1: מערבבים אתיל אצטט (26.6%), 1-פרופנול (26.6%), כלורופורם (26.6%), מתנול (26.6%), ו אשלגן כלורי (9.6%). הכן KCl ידי המסת 0.25 גרם של KCl ב 100 מ"ל מים HPLC באיכות.
- פתרון 2: מערבבים n-הקסאן (73%), אתר diethyl (23%), חומצת לימון (2%).
- פתרון 3: 100% n-הקסאן.
- הכן את הפתרון המכתים ידיערבוב מים מזוקקים (90 מ"ל) עם 7.5 גרם של סולפט נחושת, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של חומצה זרחתית.
- מלאו עד 5 מ"מ של כל פתרון בתא זכוכית נפרד. להוסיף כל סוג של נייר מסנן כדי להגדיל את מהירות הריצה בתא אחד.
- טרום דגירה של 20 x צלחת זכוכית 10 ס"מ HPTLC סיליקה ג'ל 60 בפתרון הריצה הראשונה עד הפתרון ריצה מגיע החלק העליון של הצלחת. לאחר מכן לייבש אותו עבור 10 דקות ב 110 מעלות צלזיוס.
הערה: צלחות אלה ניתן לאחסן לשימוש עתידי בנייר אלומיניום יבש עבור 10 דקות ב 110 מעלות צלזיוס לפני השימוש. - ממס את גלולת השומנים המתקבל צעד 2.1.10 ב 200 μL של כלורופורם / מתנול (1: 1) פתרון דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפרק.
- השתמש סרגל ועיפרון רך כדי לסמן את נקודות טעינה עבור המספר הרצוי של דגימות, בתוספת לפחות תקן אחד. מארק למרחק הריצה על כ 4 ס"מ ו 6 ס"מ לפתרון הריצה הראשון והשני, בהתאמה.
- כדי לטעון את דגימות, לשטוף את 10 μL מזרק 3 פעמים ב כלורופורם / מתנול (1: 1) לפני טעינת מדגם חדש. טען 10 μL של כל טיפה חכמה מדגם, מנסים להתרכז המדגם על קטן שטח ככל האפשר. דוגמאות יש לטעון לפחות כפילויות.
- מניח את הצלחת אנכית לתא הראשון עם הפעלת פתרון 1 (שלב 2.2.1.1). ודא כי הצלחת מקבילה לקיר של תא הזכוכית כדי להשיג מהירות הגירה אחידה.
- לאחר השורה הממסה הגיעה הסימן הראשון, להסיר את הצלחת, לייבש אותו, ולמקם אותו הפתרון השני. חזור על צעדים דומים עבור השני ועבור פתרונות הריצה השלישיים; להשאיר את הצלחת הפתרון עד החלק הקדמי הממס מגיע החלק העליון של הצלחת, ולאחר מכן להסיר ולייבש אותו ב RT עבור 1 דקות.
- מניחים צלחת בתמיסה בגפרת-נחושת עבור 7 ים. הסר את צלחת, לייבש אותו ביסודיות, ואופים אותו בתנור במשך 7 דקות ב 170 מעלות צלזיוס. חכה הצלחת לקרר.
- Using כרומטוגרפיה בשכבה דקה ותוכנת ניתוח ג'ל, וכן תוכנות עיבוד תמונה, לסרוק ולנתח כפי שתוארו לעיל על ידי Brogden ואח. 23.
- צרף עמודת 4.6 מ"מ 100 x כדי מחסנית שומר 5 מיקרומטר / 4.6 מ"מימ ומחממים אותו ל 32 מעלות צלזיוס. השתמש מתנול כשלב הנייד בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דק 'ב 65 בר מדידת גלאי UV ב 202 ננומטר לכמת את כמות הכולסטרול כל דגימה.
- לשטוף את מכונה HPLC ביסודיות לפני ניתוח הדגימות, ביצוע הצעדים הבאים: ניקוי המשאבה, שטיפת המחט, שטיפת הסיר, טיהור המזרק, ושטיפת טיהור המשאבה. לשטוף את כל עם מים. לבסוף, לבצע טיהור מערכת עם מתנול בקצב זרימה של 5 מ"ל / דקה 5 דקות.
- כדי לבסס עקומת סטנדרט כולסטרול, להכין לפחות 4 בריכוזים הנעיםמ 0.05 מ"ג / מ"ל ל 2 מ"ג / מ"ל של כולסטרול כלורופורם / מתנול (1: 1) 24.
- Resuspend דגימות שהתקבלו משלב 2.1.10 ב 500 μL של כלורופורם / מתנול (1: 1) בבקבוקי זכוכית 1.5 מ"ל בצבע ענברי עם PTFE אדום הברגה / העפעפיים סיליקון לבן.
- לכמת את ריכוזי הכולסטרול באמצעות תקן מוכן בשלב 2.3.3.
הערה: מלא את פרוטוקול הדגימה, החל לפחות אחד רגילה ואחד ביקורת שלילית, ואחריו הדגימות. - בטא את התוצאות כשהטחות תחת העקומה ולהשוות בין דגימות המתאימות באמצעות כל תוכנה סטטיסטית.
הערה: תוצאות ניתן לכמת גם נגד עקומת סטנדרט וניתן לראות כסכום הכולסטרול הכללי לכל מ"ל, g, או מספר תאים. המשוואה העקומה התקן צריך להיות מחושבת על ידי שימוש בערכים שהושגו בשלב 2.3.3.
ויזואליזציה 3. כימות של הנטס
- Visualization של הנטס
הערה: ויזואליזציה של רשתות מבוססות על עבודה בעבר בהוצאת נוימן ואח '. 15.- שטוף את הדגימות הקבועות משלב 1.3.8 3 פעמים עם 200 μL של PBS 1x.
- חסום permeabilize עם 100 μL של 2% BSA, 0.2% Triton X-100 ב PBS לכל טוב עבור 45 דקות ב RT.
- הוספת 100 μL של נוגדנים ראשוניים: חד שבטיים עכבר אנטי DNA-היסטון 1-נוגדן (לדלל את המניות עם 2.2 מ"ג / מ"ל 1: 5000 ב PBS המכיל BSA 2% ו 0.2% טריטון X-100) או נוגדנים polyclonal נגד myeloperoxidase (MPO; ארנב נגד MPO; לדלל 1: 300 ב PBS המכיל BSA 2% ו 0.2% טריטון X-100). דגירה לילה בשעה 4 ° C.
- לשטוף 3 פעמים עם 200 μL של 1x PBS.
- הוספת 100 μL של נוגדנים משני (עכבר-אנטי עז שכותרתו פלואורסצנטי; 1: 1000 ב BSA-PBS-טריטון X-100 ו עז נגד ארנב; 1: 1000 BSA-PBS-טריטון X-100) עבור 1 שעות ב RT בחושך.
- לשטוף 3 פעמים עם 200 & #181; L של 1x PBS.
- הסר coverslips באמצעות פינצטה ולמקם אותם עם הפנים כלפי מטה עם 3 μL של המדיום גובר המכיל DAPI בשקופיות זכוכית.
- בדיקת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ההפוך-בסיס מצויד מטרת טבילת HCX PL APO 40X 0.75-1.25 שמן 15.
- כימות של גרעינים משחררים-NET
- פתיחת תוכנת עיבוד התמונה (למשל, ImageJ) ו גרור ושחרר תמונה של עניין לתוך סרגל הכלים.
- לחץ על "תוספים", "לנתח", ו "מונה Cell."
- הקש "אתחול" על הכפתור בחלון הדלפק לבחור סוג לדלפק (למשל, לחץ על 7 באדום עבור תאים ושחרור-NET ו- 8 בצהוב עבור תאים שאינם משחררים, כמובא באיור 6B-I ו- II).
הערה: קריטריוני תאי NET-חיובי: הגרעין ירוק מוכתם חיובי + a nucleu צפופה פחותים (אובדן lobulation) או פסד של צורה העגולה של הגרעין + גודל מוגבר של הגרעין, או אירוע של תא מובחן מחוץ לירות. - לחץ בכל דבקות תא הקריטריונים הנ"ל ולכתוב את מספר הסלולרי נספר לגיליון נתונים של תוכנת ניתוח.
- חישוב אחוזי התאים משחרר-NET באמצעות המספרים הסלולריים נספרו של תאי NET-השחרור ולא משחררים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דם הנגזרות אנוש נויטרופילים בודדו על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות (איור 2). כדי לחקור את ההשפעה של שינויים השומנים על נויטרופילים, התאים טופלו 10 מ"מ MβCD, אשר מכלה כולסטרול מהתא. לאחר מכן, ליפידים נותקו מן דגימות ידי בליי דאייר (איור 1, פאנל משמאל), כפי שתואר על ידי Brogden ואח. 23. דגימות השומנים המוכנות הועמסו צלחות HPTLC ג'ל סיליקה ולהפעיל באמצעות פרוטוקול שלושה-פתרון, אשר עבר אופטימיזציה להפריד ולדמיין מגוון רחב של שומנים, כולל כולסטרול, אסטרים כולסטרול, ספינגומיילין, פוספוליפידים, ואת triacylglycerides, חומצות שומן חופשיות , monoacylglycerol, phosphatidylethanolamine, cardiolipin, phosphatidylserine, ו phosphatidylcholine (איור 3 א). נגזרים מחומצן של כולסטרול (oxysterols) אינם יכולים לאתר wה- i בשיטה זו. מניתוח כמותי נוסף של כולסטרול בוצע באמצעות HPLC (איור 3B). שווי רגרסיה עבור כולסטרול היה ניכר יותר כאשר באמצעות HPLC (איור 4 א) לעומת HPTLC (איור 4 ב). כדי להמחיש את הנטס, התאים היו מגורה עם גירויים הנ"ל, קבוע, מוכתם עבור DNA / היסטון 1 (ירוק), MPO (אדום), ו- DNA (כחול) כסמנים NET טיפוסי (איור 5 א). כפי שמוצג באיור 5A, תופעה ברורה של MPO, DNA / היסטון 1, ו- DNA מתרחשת נטס כאשר התאים טופלו 10 מ"מ MβCD עבור 2 h. כתוצאה מכך, ההשפעה של הפחתת כולסטרול נותחה מיקרוסקופית. לכן, התאים היו מוכתמים עבור DNA (כחול) ו DNA / היסטון 1 (ירוק), גרעינים משחררים-NET נספרו באמצעות תוסף נגד תא מן ImageJ תוכנה לעיבוד תמונה (איור 5). נויטרופילים מטופל שימש כביקורת על spontaneouזה היווצרות NET (איור 5 ב-ט). באיור מוצג, שחרור נטו נויטרופילים מטופל לאחר 2 שעות של אינקובציה הייתה 3.89%, ואילו הטיפול של תאים עם 10 מ"מ MβCD הביא להיווצרות 35.17% נטו (איור 5).
איור 1: מראה סכמטי השלבים הכרוכים בקביעת רכב השומנים והשחרור מלכודת תאיים מ הנויטרופילים בדם נגזרות אנושיים. נויטרופילים מבודדים באמצעות שיפוע צפיפות ומטופלים עם מתיל-β-cyclodextrin (MβCD) כדי לגרום שינויים השומנים ואת היווצרות NET. לאחר מכן, שומנים מבודדים ונותחו באמצעות אחת HPTLC או HPLC, ורשתות הם דמיינו לכמת ידי immunofluorescence.
איור 3: HPTLC וניתוח HPLC של ליפידים מבודד נויטרופילים. (א) תקן המשמש לזיהוי השומנים הנוכחים נויטרופילים באמצעות HPTLC (נתיב שמאלי). אסטרים כולסטרול, TG:: CE Triacylglycerides, פ"א: חומצות שומן חופשיות, בחול: כולסטרול, MG: Monoacylglycerol, PE: phosphatidylethanolamine, CL: Cardiolipin, PS: Phosphatidylserine, PC: Phosphatidylcholine, ו SM: ספינגומיילין. (ב) תוצאה נציג מראה לשיא כולסטרול ספציפי עבור 2 מ"ג / מ"ל ב 4.980 דקות באמצעות פרוטוקול HPLC המתואר כאן.
איור 4: HPLC ו HPTLC מנתח של כולסטרול. גרפים המציגים את הקשר בין ריכוז הכולסטרול באזור, כפי שהיא נמדדת על ידי HPLC (א), ועוצמת הלהקה, כפי שהיא נמדדת על ידי HPTLC (B). מגבלת זיהוי מינימלי עבור HPLC היה 0.0016 מ"ג / מ"ל, עם ערך רגרסיה עבור עקומת תקן של 0.998 N = 3, SEM (א). כולסטרול החל 2 מ"ג / מ"ל עד 0.05 מ"ג / מ"ל יכול להיות חצי לכמת באמצעות HPTLC (B), עם גבול הגילוי המינימלי של 0.05 מ"ג / מ"ל N = 3, SEM. שווי רגרסיה עבור העקומה הסטנדרטית HPTLC הוא 0.918.
איור 5: micrographs קרינת נציג מוצג מבני NET ו subsequent כימות NET. (א) נויטרופילים מגורה עם 10 מ"מ MβCD עבור 2 h הוכתמו עבור (ii) MPO (אדום), (iii) DNA / היסטון 1 (ירוק), ו- (iv) דנ"א (כחול). (I) כיסוי של (ii), (iii), וכן (iv). (ב) התאים הודגרו במשך 2 שעות עם (i) HBSS בינוני או (ii) 10 מ"מ MβCD, ורשתות שוחרר הוכתמו עבור גרעינים (כחול) ו- DNA / היסטון 1 (ירוק). NET-שלילי גרעינים סומנו עם נגד 8 (צהוב) ו NET-חיובי גרעינים עם מונה 7 (אדום).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי לנתח שומנים ספציפיים, כגון כולסטרול, על ידי HPTLC או HPLC ו לחקור את ההשפעות של שינויי שומנים תרופתיים על ההיווצרות של הנטס (ראה נוימן ואח '. 15).
HPTLC היא שיטה יחסית חסכונית ופשוטה לנתח מגוון רחב של שומני מספר רב של דגימות. שיטה זו שימשה באזורים מחקר רבים, כולל כימות אנטיביוטי 25, אחסון השומנים במחלות אגירה ליזוזומליות 26, וקביעת רמות כולסטרול cholesterylglucoside בתאי האפיתל 27. השיטה המתוארת כאן שונה ומותאמת לבודד שומנים מן אוכלוסייה נויטרופילים מטוהרת; עם זאת, גרסה מעט שונה יכול לשמש גם כדי לבודד שומנים מן דגימות רקמה (ראה Brogden et al. 23). שימוש זה נפגשהוד, שומנים יכולים גם להיות מופרדים ביעילות, מזוהים למחצה לכמת נגד סטנדרט ידוע. שלב קריטי בשיטה זו הוא השימוש של החיץ בשם בהתאמה, מאז השימוש של כל חיץ או מדיום אחרים עלול להוביל לזיהום שומנים ולהקות שומנים נוקבים בדגימות. מאז רגישות מוגבלת עם HPTLC, HPLC צריך לשמש כשיטה מדויקת יותר עבור כימות מוחלטת.
HPLC מקל על כימות וזיהוי של כולסטרול והצורות או נגזרות השונות שלה על ידי ביצוע השוואה ל שומנים ידועים. באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל, אפשר לכמת את ובאמינות 0.0016 מ"ג / מ"ל כולסטרול (איור 4A), עם למעלה יחס ליניארי 10 מ"ג / מ"ל (R = 0.990). השיטה HPTLC מאפשרת זיהוי כולסטרול עד 0.05 מ"ג / מ"ל, אבל עם עקומת סיגמואיד מקדם קורלציה נמוכה של R = 0.906 (איור 4 ב). הרגישות הגבוהה ואת המתאם גבוה מקדם ובכך הופך HPLC שיטה מעולה הרבה עבור כימות מדויק של שומנים, אשר לאחר מכן מאפשר הבדלים קטנים בין דגימות כדי להתגלות. עם זאת, שתי השיטות ניתן להשתמש בשילוב; HPTLC יכול לשמש כדי לקבל סקירה שלתוכו שומנים עשויים להשתנות, ואת HPLC ניתן להשתמש בגישה ממוקדת יותר לכמת את ההבדל של שומנים ספציפיים במדגם נתון. כאשר משווים מדידות שלנו עם הערכים שהתקבלו על ידי אחרים 28, 29, פחות כולסטרול היה לכמת ב נויטרופילים מוחלט. זה עשוי להיות מוסבר על ידי המתודולוגיה ששימשה. מחקרים אחרים השתמשו זיהוי fluorimetric, אשר מבוסס על תגובת אנזים מצמידים מאתרת הוא כולסטרול cholesterylesters בחינם.
הנה, HPTLC ו HPLC משמשים בשילוב כדי לוודא MβCD מביאה להפחתה משמעותית של כולסטרול כמו גם הראו בעבר על ידי אל Gorudko et.ss = "Xref"> 28. הם הפגינו ירידה 60% של הכולסטרול נויטרופילים ידי 10 מ"מ MβCD. בנוסף, ירידה קלה של רמת ספינגומיילין אבל לא אסטרים הכולסטרול היה לקלוט את אותות נויטרופילים כאשר טופלו MβCD (ראה נוימן ואח '. 15). במקביל, דלדול של כולסטרול מוביל להיווצרות של הנטס (ראה ואח 'נוימן. 15). ממצאים אלה תואמים היטב את התופעה כי טיפול של נויטרופילים עם סטטינים, מעכבים של אנזים 3-methylglutaryl 3-הידרוקסי (HMG-CoA) רדוקטאז, אנזים שער הגבלה ביוסינתזה כולסטרול, מגביר היווצרות של הנטס. עם זאת, מאז הטיפול בסטטינים של נויטרופילים מציג אינדוקציה NET חזק לעומת טיפול MβCD (ראה נוימן ואח '. 15 ו Chow et al. 20), השפעות נוספות של סטטינים למשל על prote מפעיל prenylated קרום מעוגניins עלול גם להיות מעורב היווצרות של הנטס.
ההיווצרות של הנטס היא מנגנון הגנת מארחת רומן תארה יחסית. סיבי DNA תאי עכשיו תוארו לא רק יונק 30, 31, אלא גם עוף, דגים, שרימפס, וצמחים 32, 33, 34, 35. על הגירוי של נויטרופילים עם פתוגנים או גירויים אחרים, רשתות משתחררות לחלל התאי, שם הם ללכוד ואולי להרוג פתוגנים פולשים 36. לימוד רכב השומנים של נויטרופילים מופעלים עשויה לעזור להבין את המנגנונים התאיים תיווך הפעילות מיקרוביאלית שלה. מאז מדדנו את רמת השומנים הכוללת בלבד של נויטרופילים, זה עדיין לא נקבע כיצד התוכן השומנים שונה ומושפע MβCD בתא כולו לעומת יציקהממברנות ma ובקרב תחומים מיקרו קרום שונים. עם זאת, זה דורש הליכי הפרדת קרום ספציפיים כפי שתואר לעיל (שו et al.). 37
מלבד הכרומטין, רשתות אנושיות להכיל מספר חלבונים נויטרופילים, כגון MPO; אלסטט, את LL-37 פפטיד מיקרוביאלית; או calgranulin 17, 36. מחקר שנערך לאחרונה שמבוסס בעיקר על התפקיד של חלבונים ספציפיים אלו שינויים מורפולוגיים, אשר ליזום ולקדם הקמת רשתות 15, 38, 39. עם זאת, עד כה, יש ידע מוגבל רק על החשיבות של שומנים מסוימים במהלך תהליך זה 15, 20. לכן, מדובר באזור מעניין במיוחד כדי להיחקר ביתר פירוט בעתיד. לבסוף, ידע על שינויי קרום שומניםיכול לשמש כבסיס גישות טיפוליות לחיזוק המערכת החיסונית נגד דלקות. כדוגמה, הודגם כי דלדול של כולסטרול עשוי לעזור בלחימה פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה כגון הליקובקטר פילורי, שכן הוכח כי כולסטרול מגבירה את ההתנגדות של החרקים האלה נגד אנטיביוטיקה פפטידים מיקרוביאלית 40. מחקרים דומים יכולים להיות מועילים להבנת אינטראקציות מארח הפתוגן עם מיני חיידקים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של Akademie für Tiergesundheit (AFT) וכן מענק של התוכנית PhD, "Animal ו מידבקות מחיות לאדם דלקות," של האוניברסיטה לרפואה וטרינרית, הנובר, גרמניה, הניתן אריאן נוימן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
