Summary
Липиды, как известно, играют важную роль в клеточных функций. Здесь мы опишем метод для определения липидного состава нейтрофилов, с акцентом на уровень холестерина, как с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и ВЭТСХ, чтобы получить лучшее понимание основных механизмов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Abstract
Анализ липидов проводили методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) является относительно простым, экономически эффективным методом анализа широкого спектра липидов. Функция липидов (например, в хозяин-патоген взаимодействий или записи хоста), как сообщается, играют важную роль в клеточных процессах. Здесь мы покажем метод для определения состава липидов, с акцентом на уровень холестерина в крови первичных производных нейтрофилов, по ВЭТСХ по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Цель состояла в том, чтобы исследовать роль изменений липидов / холестерина в формировании нейтрофильных внеклеточных ловушек (НРТ). NET релиз известен как механизм защиты хозяина, чтобы предотвратить патогены от распространения в пределах хоста. Таким образом, полученные из крови человека нейтрофилов обрабатывали метил-бета-циклодекстрин (MβCD), чтобы вызвать изменения липидов в клетках. Использование ВЭТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии, мы показали, что MβCD обработка клеток приводит к липидаизменения, связанные со значительным снижением содержания холестерина в клетке. В то же время, MβCD обработка нейтрофилов приводило к образованию сетки, как показано иммунофлюоресценции микроскопии. Таким образом, здесь мы приводим детальный метод изучения липидного изменения в нейтрофилах и образования ИХ.
Introduction
Липиды было показано, играют важную роль в гомеостазе клетки, клеточной гибели, хозяин-патоген взаимодействия и высвобождение цитокинов 1. Со временем интерес к и знание о влиянии липидов в хост-патоген взаимодействий или воспаления увеличились, и несколько публикаций подтверждают центральную роль некоторых липидов, особенно холестерина стероид, в клеточных реакций. Фармакологическое лечение статинов, которые используются в качестве ингибиторов биосинтеза холестерина, блокируя 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент-A-редуктазу (ГМГ-КоА-редуктаза), может выступать в качестве противовоспалительных агентов пути снижения уровней в сыворотке крови интерлейкина 6 и С-реактивный белок 2. Холестерином и гликосфинголипид обогащенные структуры могут быть использованы несколькими патогенами, такими как бактерии и вирусы, в качестве шлюза в хост 3, 4, 5,класс = "внешние ссылки"> 6. Сфинголипиды (например, сфингомиелина), была показана для использования патогенов в целях содействия их патогенности 7. В макрофагах, использование микобактерии холестерин обогащенных доменов для ввода клеток; истощение холестерина ингибирует поглощение микобактерий 8. Кроме того, инфекция макрофагов с Francisella tularensis, зоонозного агента , ответственного за туляремии (также известный как лихорадка кролика) 9, привело к инфекции , которая была отменена , когда уровень холестерина был исчерпан из мембран 10. Аналогичным образом , вторжение в клетки - хозяина с помощью кишечной палочки богатых липидами структур было показано, что холестерин-зависимые 4. Кроме того, Salmonella Typhimurium инфекции опыты эпителиальных клеток показали , что холестерин необходим для вступления патогенных микроорганизмов в клетки 11. Холестерин истощение inhibiteд поглощение Salmonella 11. Кроме того, недавнее исследование Gilk и соавт. показали , что холестерин играет важную роль в поглощении Coxiella burnetti 12. Кроме того, Туонг и др. Обнаружено , что 25-hydroxycholesterol играет решающую роль в фагоцитозе липополисахарида (LPS) -стимулированных макрофаги 13. Фагоцитоз был уменьшен , когда макрофаги обрабатывали фармакологически истощать холестерин 14. Таким образом, холестерин и другие липиды , кажется, играют важную роль в инфекции и воспалении, так как их истощение может уменьшить риск вторжения от нескольких патогенов , 10, 11, 12.
В последнее время мы смогли показать, что липидные изменения, особенно истощением холестерина из клетки, индуцирует образование нейтрофилов extracellulaг ловушка (сетки) в крови человек , полученные нейтрофилах 15. С момента открытия НЭО в 2004 году, они были показаны , чтобы играть решающую роль в бактериальной провокации, и , таким образом , в препятствует распространению инфекции 16, 17. НРТ состоят из основной цепи ДНК , связанной с гистонов, протеазы и антимикробных пептидов 16. Выпуск Сетки нейтрофилами могут быть вызваны вторжения патогенных микроорганизмов 18, 19 и химические вещества , такие как форбол-миристат-ацетата (РМА) или статины 16, 20. Однако подробные клеточные механизмы, и особенно роль липидов в этом процессе, все еще не совсем понятно. Анализ липидов может привести к лучшему пониманию механизмов, участвующих в самых разнообразных клеточных процессов и взаимодействий, таких как освобождение сетками. Cholesteрол и сфингомиелином являются жизненно важными компонентами клеточных мембран и липидных микродоменов, где они добавляют стабильности и облегчают кластеризацию белков , вовлеченных в незаконный оборот белка и события 21 сигнализации. Для того, чтобы исследовать механистическую роль определенных липидов, амфифильных фармакологических агентов, такие как циклический олигосахаридов метил-бета-циклодекстрин (MβCD), может быть использовано для изменения липидного состава клетки и уменьшить содержание холестерина в пробирке 15. Здесь мы представляем метод использовать ВЭТСЙ для анализа липидного состава нейтрофилов в ответ на MβCD. ВЭЖХИ использовали для подтверждения уровня холестерина в популяции нейтрофилов. Кроме того, мы опишем метод, чтобы визуализировать образование сеток с помощью иммунофлуоресценции микроскопии в крови человека, полученных нейтрофилов в ответ на MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Сбор периферической крови в этом протоколе был утвержден местной комиссией по этике человека. Все человеческие субъекты при условии их письменного информированного согласия.
1. Выделение крови человека, полученных из Нейтрофилы путем центрифугирования в градиенте плотности
- Выделение крови человека , полученных нейтрофилов
- Слой ~ 20 мл крови на 20 мл диатризоат / декстран раствора натрия вблизи пламени и без перемешивания.
- Центрифуга в течение 30 мин при 470 мкг без тормоза.
- Удалите мононуклеарные клетки и желтоватый слой плазмы. Передача полиморфно клетки (ПМНО) фаз (вторая фаза с накоплением клеток; 1 и 2) в новые 50 мл трубки и заполнить ее до 50 мл с 1x фосфатно-буферным солевым раствором (PBS).
- Центрифуга в течение 10 мин при 470 мкг с тормозом.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл стерильной воды FoR 5 лет, чтобы лизировать эритроциты.
- Немедленно заполнить до 50 мл с 1x PBS и центрифуги в течение 10 мин при 470 х г.
- Удалить супернатант. Осадок должен быть белым. Если он по-прежнему красный, повторите шаги 1.1.5 и 1.1.6.
- Ресуспендируют осадок в 1000 мкл Института Roswell Park Memorial (RPMI) среды. Подсчитайте число клеток с использованием трипанового синего окрашивания в гемоцитометра под световым микроскопом.
- Приготовьте суспензию клеток в среде RPMI при концентрации 2 × 10 6 / мл. Приблизительно 2,5 × 10 7 нейтрофилы могут быть собраны из 20 мл крови.
- Фармакологическое лечение нейтрофилов для анализа липидов
- Используйте 5 × 10 7 клеток со стадии 1.1.9. Регулировка количества клеток в чистом Hank's сбалансированный солевой раствор (HBSS) среде в присутствии или в отсутствие 10 мМ MβCD или 25 нМ РМА в общем объеме 300 мкл в 1,5 мл реакционной трубки.
- Инкубируйте образцы вРеакционные пробирки в течение 2 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
- Центрифуга в течение 10 мин при 470 мкг с тормозом.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл HBSS.
- Центрифуга в течение 10 мин при 470 мкг с тормозом.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл смеси хлороформ / метанол (1: 1), гомогенизировать его с канюлей 26-G путем всасывания образца в и в шприц 1 мл в 10 раз, и хранить образцы при -20 ° С.
- Фармакологическое лечение нейтрофилов для NET количественной оценки с помощью иммунофлюоресценции
- Подготовка поли-L-лизин покрытием 48-луночные планшеты с покровные стекла.
- Поместите один 8-мм покровное стекло в каждую лунку, добавить 55 мкл стерильной 0,01% поли-L-лизином, и инкубируют в течение ~ 20 мин при комнатной температуре (RT).
- Промыть два раза с 200 мкл 1x PBS. Хранить пластины с 200 мкл 1x PBS на лунку в холодильнике, пока они не потребуются.
- Автомобильefully добавляют 100 мкл клеточной суспензии (2 × 10 5/100 мкл) из стадии 1.1.9 на лунку в центре каждого покровное.
- Добавляют 100 мкл на лунку либо окончательного 10 мМ MβCD или окончательного 25 нМ ФМА.
- Центрифуга в течение 5 мин при 370 мкг с тормозом.
- Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
- Центрифуга в течение 5 мин при 370 мкг с тормозом.
- Закрепить клетки с 155 мклы 4% PFA, завернуть их в пластиковой парафиновой пленке, и хранить их в течение ночи при 4 ° С или в течение 10 мин при комнатной температуре.
Примечание: Для получения данных о NET формирования индуцированного MβCD, см Нейман и др. 15.
- Подготовка поли-L-лизин покрытием 48-луночные планшеты с покровные стекла.
2. Выделение липидов и анализ крови человека, полученных Нейтрофилы
- Изолируйте липиды из человеческих нейтрофилов периферической крови , полученных на основе Блаем и Dyer 22 и Brogden и др. 23
- На льду, пипеткой нейтрофилов (присутствующие в метаноле и раствор хлороформа) к завинчивающейся крышкой стеклянной трубки 15 мл с политетрафторэтилена (PTFE) уплотнения и гомогенизируют их при встряхивании в течение 1 мин. Используйте стеклянные трубки, чтобы предотвратить липиды от связывания с пластиковыми поверхностями. Используйте ПТФЭ колпачки для предотвращения загрязнения из резины / пластика.
- Добавляют 2 мл метанола с последующим 1 мин позже 1 мл хлороформа. Встряхните снова в течение 1 мин.
- Поворот стеклянных трубок при комнатной температуре и 50 оборотов в минуту в течение 30 мин.
- Гранулы белковой фракции путем центрифугировани раствора при 7 ° С и 1,952 мкг в течение 10 мин.
- Аккуратно декантируют супернатант в новую 15 Мл Гласс завинчивающейся крышкой трубки, в результате чего белок, содержащий осадок позади. Хранить гранулы при температуре -20 ° С для последующего количественного определения.
- Добавить 1 мл хлороформа, подождите 1 мин, добавляют 1 мл дважды дистиллированной воды, и инвертировать стекла с завинчивающейся крышкой трубки с пробой в течение 30 с.
- При необходимости, выполнить необязательный дополнительный этап очистки путем повторения стадии 2.1.8.
- Сухие образцы в вакуумной концентраторе при 60 ° C и хранят их при температуре от -20 ° C до тех пор, пока требуется.
- Подготовьте следующие четыре ходовые решения и окрашивание раствора.
- Раствор 1: Смешать этилацетат (26,6%), 1-пропанола (26,6%), хлороформ (26,6%), метанол (26,6%) и хлорид калия (9,6%). Подготовьте KCl путем растворения 0,25 г KCl в 100 мл ВЭОГО качества воды.
- Раствор 2: Смешать н-гексан (73%), диэтиловый эфир (23%) и лимонной кислоты (2%).
- Раствор 3: 100% н-гексан.
- Приготовьте раствор окрашиваниясмешивание дистиллированной воды (90 мл) с 7,5 г сульфата меди, а затем добавляют 10 мл фосфорной кислоты.
- Заполните до 5 мм каждого раствора в отдельной стеклянной камере. Добавить какой-либо фильтровальной бумаги, чтобы увеличить скорость движения в каждой камере.
- Предварительно инкубировать 20 х 10 см ВЭТОГО силикагеля 60 стеклянной пластину в первом растворе проточного до тех пор, пока раствор не работает достигает верхнюю часть пластины. Затем высушить его в течение 10 мин при 110 ° С.
Примечание: Эти пластины могут быть сохранены для будущего использования в алюминиевой фольге и сушат в течение 10 мин при 110 ° C до использования. - Растворить липидный осадок, полученный из стадии 2.1.10 в 200 мкл смеси хлороформ / метанол (1: 1) раствор и инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С для растворения.
- Используйте линейку и мягкий карандаш, чтобы отметить погрузочных места для требуемого количества образцов, а также по меньшей мере один стандарт. Отметьте расстояние пробега приблизительно 4 см и 6 см для первого и второго бегового раствора, соответственно.
- Для того, чтобы загрузить образцы, мыть 10 мкл шприц 3 раза в смеси хлороформ / метанол (1: 1) до загрузки каждого нового образца. Нагрузка 10 мкл каждого образца по каплям, пытаясь концентрировать образец на качестве небольшой площади, как это возможно. Образцы должны быть загружены по крайней мере, в двух экземплярах.
- Поместите пластину вертикально в первую камеру с проточным раствором 1 (этап 2.2.1.1). Убедитесь, что пластина расположена параллельно стенке стеклянной камеры для достижения равномерной скорости миграции.
- После того, как линия растворителя достигла первой отметки, удалить пластину, высушить, и поместить его во втором растворе. Повторите аналогичные действия для второго и для третьих решений погонных; оставить пластину в растворе до тех пор, пока фронт растворителя достигнет верхней части пластины, а затем удалить и высушить его при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Поместите пластину в раствор сульфата меди в течение 7 с. Удалить пластину, высушить его полностью, и испечь его в печи в течение 7 минут при температуре 170 ° С. Подождите, пока пластина для охлаждения.
- Usiнг тонкослойной хроматографии и программное обеспечение для анализа гель, а также программное обеспечение для обработки изображений, сканирования и анализа , как описано ранее Brogden и соавт. 23.
- Присоединить колонку 100 х 4,6 мм до 5 мкм / 4,6 мм защитного картриджа и нагревают ее до 32 ° С. Использование метанола в качестве подвижной фазы при скорости потока 1 мл / мин при 65 бар и измерения УФ-детектора при 202 нм, чтобы определить количество холестерина в каждом образце.
- Промыть машину ВЭОЙ тщательно перед анализом проб, выполняя следующие шаги: очистку насоса, промывки иглу, полоскание горшка, продувку шприца, и промывке насоса продувки. Вымойте все с водой. И, наконец, выполнить чистку системы с помощью метанола при скорости потока 5 мл / мин в течение 5 мин.
- Для того, чтобы установить стандартный кривой холестерин, готовит по меньшей мере, 4 концентрации в диапазонеот 0,05 мг / мл до 2 мг / мл холестерина в смеси хлороформ / метанол (1: 1) 24.
- Ресуспендируют образцы, полученные из стадии 2.1.10 в 500 мкл смеси хлороформ / метанол (1: 1) в янтарного цвета 1,5 мл стеклянные бутылки с завинчивающейся крышкой красного PTFE / белых силиконовых крышек.
- Количественно концентрации холестерина с использованием стандарта, полученного на стадии 2.3.3.
Примечание: Заполните в протоколе отбора проб, начиная с, по меньшей мере, один стандартный и один отрицательный контроль, а затем образцы. - Экспресс результаты как площадь под кривой и сравнить между соответствующими образцами с помощью любого статистического программного обеспечения.
Примечание: результаты также могут быть определены количественно по стандартной кривой и может быть показано, как общее количество холестерина в мл, г, или количество клеток. Стандартное уравнение кривой должна быть вычислена с использованием значений, полученных на этапе 2.3.3.
3. Визуализация и Количественное НЭО
- Visualization из НЭО
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация НЭО основана на ранее опубликованной работе Нейман и др. 15.- Промыть фиксированные образцы из стадии 1.3.8 3 раза 200 мкл 1x PBS.
- Блок и проницаемая с 100 мкло 2% БСА, 0,2% Triton X-100 в PBS на лунку в течение 45 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 100 мкл первичных антител: мышиного моноклонального анти ДНК-гистон 1-антителом (разбавление запас с 2,2 мг / мл 1: 5000 в PBS, содержащем 2% BSA и 0,2% Тритон Х-100) или поликлональные антитела против миелопероксидазы (МРО; кролика против МРО; разбавленным 1: 300 в PBS, содержащем 2% BSA и 0,2% Тритон Х-100). Инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 раза с 200 мкл 1x PBS.
- Добавьте 100 мкл вторичного антитела (флуоресцентно-меченного антимышиного, 1: 1000 в BSA-PBS-Triton X-100 и козьего анти-кролик; 1: 1000 БСА-PBS-Triton Х-100) в течение 1 ч при RT в темноте.
- Промыть 3 раза с 200 & #181; л 1x PBS.
- Удалить покровные с помощью пинцета и положите их лицом вниз с 3 мкл монтажной среды, содержащей DAPI на стеклах.
- Изучение образцов с использованием конфокальной перевернутой базовый флуоресцентный микроскоп , снабженный HCX PL APO 40Х 0,75-1,25 нефти погружения цели 15.
- Количественные ядра NET-рилизинг
- Откройте программное обеспечение для обработки изображений (например, ImageJ) и перетащите изображение интереса в панель инструментов.
- Нажмите на кнопку «Плагины», «Analyze» и «Cell прилавка».
- Нажмите на кнопку «Initialize» в окне счетчика и выбрать тип счетчика (например, нажмите на 7 в красный цвет для NET-рилизинг-клеток и 8 в желтый цвет для не-рилизинг-клеток, как показано на фиг.6В-я и II).
Примечание: Критерии для NET-позитивных клеток: Позитивно окрашенные зеленые ядра + менее плотной nucleuс (потерей дольчатости) или потеря круглой формы ядра + увеличенного размером ядра, или появления отдельного внеклеточного ответвления. - Нажмите каждую клетку, прилипшую к указанным выше критериям и писать подсчитанное количество клеток в лист данных с программным обеспечением для анализа.
- Рассчитывают процент NET-рилизинг-клеток с использованием подсчитанные числа клеток нетто-рилизинг и не рилизинг клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Человеческие нейтрофилы крови , полученных выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности (рисунок 2). Для того, чтобы исследовать влияние липидных изменений на нейтрофилы, клетки обрабатывали 10 мМ MβCD, который истощает холестерина из клетки. Впоследствии, липиды были выделены из образцов по Блаем и Dyer (фиг.1, левая панель), как описано Brogden и соавт. 23. Приготовленные образцы липидов наносили на силикагель ВЭТСХ пластин и проводили с использованием протокола три раствора, который был оптимизирован, чтобы отделить и визуализировать широкий спектр липидов, в том числе холестерина, эфиров холестерина, сфингомиелина, фосфолипидов и триацилглицеридов, свободных жирных кислот , monoacylglycerol, фосфатидилэтаноламин, кардиолипина, фосфатидилсерин и фосфатидилхолин (фиг.3А). Окисленные производные холестерина (оксистерины) не обнаруживаются шIth этого метода. Дополнительный количественный анализ холестерина проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (рис 3B). Значение регрессии для холестерина было значительно лучше при использовании ВЭОГО (фиг.4А) по сравнению с ВЭТСМИ (фиг.). Для того, чтобы визуализировать сетки, клетки стимулировали с вышеупомянутыми раздражителями, фиксированы, и окрашивают для ДНК / гистона 1 (зеленый), МРО (красный), и ДНК (синих) в качестве типичных маркеров NET (Рис 5А). Как показано на фиг.5А, четкое возникновения MPO, ДНК / гистона 1, и ДНК происходит в сетками , когда клетки обрабатывали 10 мМ MβCD в течение 2 ч. Впоследствии, эффект снижения холестерина был микроскопически проанализированы. Таким образом, клетки окрашивали на ДНК (голубой) и ДНК / гистонов 1 (зеленый) и NET-рилизинг ядра подсчитывали с помощью счетчика клеток плагин из программного обеспечения для обработки изображений ImageJ (фигура 5В). Необработанные нейтрофилы служили в качестве контроля spontaneouЧистая формирование (фигура 5В-я). В показанном рисунке, чистый выпуск в необработанных нейтрофилов после 2 ч инкубации была 3,89%, в то время как обработка клеток с 10 мМ MβCD в результате 35,17% NET формирования (фигура 5В).
Рисунок 1: Схема , показывающая этапы , участвующая в определении состава липидов и внеклеточное высвобождение ловушки из крови человека , полученные нейтрофилов. Нейтрофилы выдел ют с использованием градиента плотности и обрабатывают метил-бета-циклодекстрин (MβCD), чтобы вызвать липидные изменения и NET образования. Затем липиды выделяли и анализировали с помощью либо ВЭТСХ или ВЭЖХ, и НРТ визуализируют и количественно с помощью иммунофлуоресценции.
Рисунок 3: ВЭТСЙ и ВЭЖЙ - анализ липидов , выделенные из нейтрофилов. (А) Стандарт , используемый для идентификации липидов , присутствующих в нейтрофилах через ВЭТСХ (левая полоса). CE: Эфиры холестерина, ТГ: триацилглицериды, FFA: Свободные жирные кислоты, Чхоль: холестерин, MG: Monoacylglycerol, PE: фосфатидилэтаноламин, CL: кардиолипина, PS: Phosphatidylserine, ПК: фосфатидилхолин и SM: Сфингомиелины. (Б) представителя результата , показывающего уровень холестерина конкретного пика в течение 2 мг / мл при 4.980 мин с использованием протокола ВЭОГО , описанным здесь.
Рисунок 4: ВЭЖЕ и ВЭТСЕ анализы холестерина. Графики , показывающие зависимость между концентрацией холестерина и площади, как измерено с помощью ВЭЖХ (А), а также интенсивности полос, как измерено ВЭТСХ (B). Минимальный предел обнаружения для ВЭЖХ , составляла 0,0016 мг / мл, со значением регрессии для стандартной кривой 0,998 N = 3, SEM (A). Холестерин в пределах от 2 мг / мл до 0,05 мг / мл может быть пол-количественно с использованием ВЭТОГО (B), с минимальным пределом обнаружения 0,05 мг / мл N = 3, SEM. Значение регрессии для стандартных кривого ВЭТОГО является 0,918.
Рисунок 5: Типичные флуоресценции микрофотографии , отображающие NET структуры и после-uent NET квантификации. (А) Нейтрофилы стимулировали 10 мМ MβCD в течение 2 ч окрашивали на (II) MPO (красный), (III) ДНК / гистонов 1 (зеленый), и (IV) ДНК (синий). (Я) Наложение (II), (III) и (IV). (В) Клетки инкубировали в течение 2 ч с (I) HBSS среды или (II) , 10 мМ MβCD и выпустили НЭО окрашивали для ядер (синий) и ДНК / гистонов 1 (зеленый). NET-отрицательные ядра были отмечены со счетчиком 8 (желтый) и NET-положительных ядер с счетчика 7 (красный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы , описанные здесь , могут быть использованы для анализа конкретных липидов, таких как холестерин, от ВЭТСХ или ВЭЖХ и исследовать эффекты фармакологических липидных изменений на формирование НЭО (см Нейман и др. 15).
ВЭТСХ является относительно экономически эффективным и простым методом для анализа широкого спектра липидов в большом количестве образцов. Этот метод был использован во многих областях исследований, в том числе количественной оценки антибактериальной 25, липидного хранения при заболеваниях 26 хранения лизосомальных и определения уровней холестерина и cholesterylglucoside в эпителиальных клетках 27. Описанный здесь метод был модифицирован и оптимизирован для выделения липидов из очищенных нейтрофилов населения; однако, слегка модифицированный вариант также может быть использован для выделения липидов из образцов тканей (см Brogden и др. 23). С помощью этого встретилосьХод, липиды могут быть также эффективно разделены, которые были определены, и полу-количественно по известному стандарту. Важный шаг в этом методе является использованием соответствующего имени буфера, так как использование любого другого буфера или среды может привести к липидному загрязнению и неспецифическим липидным полосам в образцах. Так как чувствительность ограничена с ВЭТСМ, ВЭЖМ следует использовать в качестве более точного метода абсолютной количественной оценки.
ВЭЖХ облегчает идентификацию и количественное определение холестерина и его различных форм или производных путем выполнения сравнения с известным липида. При использовании протокола , описанного выше, можно достоверно определить количество до 0,0016 мг / мл холестерина (фиг.4А), с линейным соотношением до 10 мг / мл (R = 0,990). Метод ВЭТСЙ позволяет обнаруживать холестерин до 0,05 мг / мл, но с кривым сигмовидным и более низким коэффициентом корреляции R = 0,906 (фиг.). Более высокая чувствительность и выше корреляция Таким образом, коэффициент делает ВЭЖХ гораздо лучший метод для точного количественного анализа липидов, который впоследствии позволяет меньшие различия между образцами, которые будут обнаружены. Тем не менее, оба метод может быть использован в комбинации; ВЭТСЙ может быть использовано, чтобы получить общее представление, в котором липиды могут быть изменены, и ВЭЖЕ может быть использован в более целевой подходе для количественной оценки различий конкретного липида в данном образце. При сравнении наших измерений с величинами , полученными с помощью других 28, 29, меньше холестерина количественно в общем объеме нейтрофилов. Это может быть объяснено используемой методологии. Другие исследования использовали флуориметрическое обнаружение, который основан на ферментную реакцию в сочетании, который обнаруживает как свободный холестерин и cholesterylesters.
Здесь, ВЭТСЙ и ВЭЖЕ используются в комбинации , чтобы проверить , что MβCD приводит к значительному снижению холестерина , как и ранее , показанному Gorudko и соавт.сс = "Xref"> 28. Они продемонстрировали снижение на 60% холестерина в нейтрофилах на 10 мМ MβCD. Кроме того, незначительное снижение уровня сфингомиелинового , но не эфиры холестерина было обнаружено в нейтрофилах при обработке MβCD (см Неймана и др. 15). В то же время, истощение холестерина приводит к образованию ИХ (см Неймана и др. 15). Эти найти хорошо коррелируют с явлением, что лечение нейтрофилов с статины, ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А (HMG-CoA) редуктазы, фермент, ограничивающий скорость биосинтеза холестерина, повышает образование сетками. Однако, так как лечение статинов нейтрофилов проявляет более сильную индукцию NET по сравнению с лечением MβCD (см Неймана и др. 15 и Ие и др. 20), дополнительные эффекты статинов например , на прениловой мембрану якоря эффекторных защиймодули также могут быть вовлечены в формировании ИХ.
Образование НЭО является относительно новым описанным механизмом защиты хозяина. Внеклеточные волокна ДНК уже были описаны не только у млекопитающих , 30, 31, но также и у кур, рыбы, креветок и растений 32, 33, 34, 35. При стимуляции нейтрофилов с патогенами или другими раздражителями, НРТ высвобождаются в межклеточное пространство, где они запутать и , возможно , убить вторгшиеся патогены 36. Изучение липидного состава активированного нейтрофилы может помочь понять клеточные механизмы, опосредующие антимикробную активность. Поскольку мы измеряли только общий уровень липидов в нейтрофилах, еще предстоит определить, как содержание липидов отличается и зависит от MβCD в целой клетки по сравнению с плама мембрана и среди различных областей мембраны микро. Однако, это требует специальных процедур мембранного разделения , как описано ранее (Xu и др.). 37
Кроме хроматина, человек НРТ содержит несколько нейтрофильных белков, такие как МРО; эластаза, антимикробного пептида LL-37; или calgranulin 17, 36. Недавние исследования в значительной степени сосредоточены на ролях этих специфических белков и морфологических изменений, которые инициируют и способствуют образованию ЕГО 15, 38, 39. Однако, до сих пор, есть только ограниченные знания о важности определенных липидов в ходе этого процесса 15, 20. Таким образом, это особенно интересная область, чтобы изучить более подробно в будущем. Наконец, знание о липидных модификациях мембранможет служить основой для терапевтических подходов для укрепления иммунной системы против инфекций. В качестве примера, было показано , что истощение холестерина может помочь в борьбе устойчивых к антибиотикам патогенов , таких как H. пилори, так как было показано , что уровень холестерина усиливает сопротивление тех ошибок против антибиотиков и антимикробных пептидов 40. Подобные исследования могут быть полезны для понимания хост-патоген взаимодействия с различными видами бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана общении Akademie für Tiergesundheit (AFT) и стажер из программы PhD, «животных и зоонозных инфекций,» Университета ветеринарной медицины, Ганновер, Германия, предоставило Ариан Нейман.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
