Summary
Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.
Abstract
Lipid-Analyse durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie durchgeführt (HPTLC) ist ein relativ einfaches, kostengünstiges Verfahren zur Herstellung eine breite Palette von Lipiden analysiert. Die Funktion von Lipiden ( zum Beispiel in der Wirt-Pathogen - Interaktionen oder Host - Eintrag) wurde eine entscheidende Rolle bei zellulären Prozessen spielen gemeldet. Hier zeigen wir ein Verfahren Lipidzusammensetzung, um zu bestimmen, mit dem Fokus auf dem Cholesterinspiegel des primären Blut abgeleiteten Neutrophilen, durch HPTLC im Vergleich zur Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Ziel war es, die Rolle der Lipid / Cholesterin Veränderungen bei der Bildung von Neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) zu untersuchen. NET-Release wird als Abwehrmechanismus bekannt Erreger zu verhindern innerhalb des Host-Ausbreitung. Daher Blut gewonnenen humanen Neutrophilen wurden mit Methyl-β-cyclodextrin (MßCD) behandelt, um Lipidveränderungen in den Zellen zu induzieren. Mit HPTLC und HPLC haben wir gezeigt, dass MßCD Behandlung der Zellen zu Lipid führtmit einer signifikanten Verringerung des Cholesteringehalt der Zelle verbunden sind Veränderungen. Zur gleichen Zeit, MßCD Behandlung der Neutrophilen führte zur Bildung von NETs, wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt. Zusammenfassend hier präsentieren wir eine detaillierte Methode Lipid Veränderungen in Neutrophilen und die Bildung von NETs zu studieren.
Introduction
Lipids wurden 1 eine wichtige Rolle in Zellhomöostase, Zelltod, Wirt-Pathogen - Interaktionen und Zytokin - Freisetzung gezeigt spielen. Im Laufe der Zeit das Interesse für und das Wissen über die Auswirkungen von Lipiden in der Wirt-Pathogen-Interaktionen oder Entzündung haben zugenommen, und mehrere Publikationen bestätigen die zentrale Rolle bestimmter Lipide, vor allem das Steroid Cholesterin, in zellulären Antworten. Pharmakologische Behandlung mit Statinen, die durch die Blockierung 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) als Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese verwendet werden, können als entzündungshemmende Mittel wirken, indem sie die Serumspiegel von Interleukin Senkung 6 und C-reaktives Protein 2. Cholesterin- und Glycosphingolipid angereicherten Strukturen können durch verschiedene Pathogene, wie Bakterien und Viren verwendet werden, als Gateway in das Wirts 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sphingolipide (zB Sphingomyelin) wurde von Pathogenen verwendet gezeigt werden , um ihre Pathogenität 7 zu fördern. In Makrophagen, Mykobakterien Verwendung Domänen-Cholesterin angereicherten Zellen für die Eingabe; ein Abbau von Cholesterin hemmt Mykobakterien - Aufnahme 8. Weiterhin Infektion von Makrophagen mit Francisella tularensis, einem Zoonoseerregers verantwortlich für Tularämie (auch als Kaninchen Fieber bekannt) 9, führte zu einer Infektion , die aufgehoben wurde , wenn Cholesterin aus den Membranen 10 aufgebraucht wurde. In ähnlicher Weise wurde die Invasion von Wirtszellen durch Escherichia coli über lipidreichen Strukturen demonstriert Cholesterin-abhängige 4 sein. Darüber hinaus zeigten S. typhimurium Infektionsversuche von Epithelzellen , dass Cholesterin für Erreger Eintritt in die Zellen 11 wesentlich ist. Cholesterin Verarmungs inhibited die Aufnahme von Salmonella - 11. Ferner ist eine aktuelle Studie von Gilk et al. gezeigt , dass Cholesterin 12 eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Coxiella burnetii spielt. Zusätzlich Tuong et al. festgestellt , dass 25-hydroxycholesterol spielt stimulierte eine entscheidende Rolle bei der Phagozytose durch Lipopolysaccharide (LPS) Makrophagen 13. Phagozytose reduziert wurde , wenn pharmakologisch Makrophagen Cholesterin 14 verarmen behandelt wurden. So Cholesterin und andere Lipide scheinen eine wichtige Rolle bei Infektionen und Entzündungen zu spielen, da ihre Erschöpfung des Risiko einer Invasion von mehreren Erregern 10, 11 zu reduzieren, 12.
Vor kurzem konnten wir feststellen, dass Lipid-Veränderungen zeigen, vor allem den Abbau von Cholesterin aus der Zelle, induziert die Bildung von neutrophilen Extrazellulärr Fallen (NETS) in menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile 15. Seit der Entdeckung von NETs im Jahr 2004 wurde sie gezeigt entscheidende Rolle bei der bakteriellen Einschluss zu spielen und damit in behindern die Ausbreitung der Infektion 16, 17. NETs besteht aus einem DNA - Rückgrat mit Histonen, Proteasen assoziiert und antimikrobielle Peptide 16. Die Freisetzung des NETs durch Neutrophile durch eindringende Krankheitserreger 18, 19 und chemische Substanzen wie Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) oder Statine 16, 20 induziert werden. Allerdings sind die detaillierten zellulären Mechanismen, und vor allem die Rolle von Lipiden in diesem Verfahren sind noch nicht ganz klar. Die Analyse von Lipiden kann in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und Interaktionen, wie zB die Freisetzung von NETs beteiligt zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen. Cholesterol und Sphingomyelin sind wichtige Bestandteile der Zellmembran und Lipid - Mikrodomänen, in denen sie die Stabilität hinzuzufügen und die Clusterbildung der in den Proteintransport und Signalereignisse 21 beteiligten Proteine zu erleichtern. Um die mechanistische Rolle bestimmter Lipiden, amphiphilen pharmakologischer Mittel, wie die cyclische Oligosaccharid Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) zu untersuchen , kann verwendet werden , um die Lipidzusammensetzung einer Zelle zu verändern , und zur Verringerung von Cholesterin in vitro 15. Hier präsentieren wir eine Methode HPTLC zu verwenden, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen in Reaktion auf MßCD zu analysieren. HPLC wurde verwendet, um das Niveau des Cholesterins in der neutrophilen Population zu bestätigen. Weiterhin beschreiben wir ein Verfahren, um die Bildung von NETs durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie in menschlichem Blut abgeleiteten Neutrophilen als Reaktion auf MßCD sichtbar zu machen.
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Protocol
Die Sammlung des peripheren Blutes in diesem Protokoll wurde von der lokalen Menschenforschungsethikkommission genehmigt. Alle menschlichen Probanden, wenn ihr eine schriftliche Einverständniserklärung.
1. Isolierung von humanen blutabgeleiteten Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation
- Isolierung von menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile
- Schicht ~ 20 ml Blut auf 20 ml Natriumdiatrizoat / Dextran-Lösung in der Nähe einer Flamme und ohne sich zu vermischen.
- Zentrifuge 30 min bei 470 x g ohne Bremse.
- Entfernen Sie die einkernigen Zellen und die gelbliche Plasmaschicht. Übertragen die polymorphkernigen Zellen (PMN) Phase (zweite Phase mit Akkumulatorzellen; 1 und 2) in ein neues 50 - ml - Röhrchen und füllt sie bis zu 50 ml mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Zentrifuge für 10 Minuten bei 470 · g mit Bremse.
- Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 5 ml sterilem Wasser foR 5 s, die Erythrozyten lysieren.
- Unmittelbar füllt für 10 min bei 470 x g auf 50 ml mit 1 × PBS und Zentrifugieren auf.
- Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet sollte weiß sein. Wenn es immer noch rot ist, wiederholen Sie die Schritte 1.1.5 und 1.1.6.
- Das Pellet in 1000 ul Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium. Zählen der Zellzahl unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung in einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop.
- Vorbereiten einer Zellsuspension in RPMI in einer Konzentration von 2 x 10 6 / ml. Etwa 2,5 x 10 7 Neutrophilen können aus 20 ml Blut geerntet werden.
- Pharmakologische Behandlung von Neutrophilen für Lipidanalyse
- Verwenden 5 x 10 7 Zellen aus Schritt 1.1.9. Stellen Sie die Zellzahl in reiner Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) -Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM MßCD oder 25 nM PMA in einem Gesamtvolumen von 300 & mgr; l in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen.
- Inkubieren Sie die Proben in derReaktionsröhrchen für 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Zentrifuge für 10 Minuten bei 470 · g mit Bremse.
- Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 300 & mgr; l HBSS.
- Zentrifuge für 10 Minuten bei 470 · g mit Bremse.
- Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Chloroform / Methanol (1: 1), homogenisiert es mit einer 26-G-Kanüle, indem die Probe in der und aus in eine 1 ml Spritze saugt 10mal, und speichert die Proben bei -20 ° C.
- Pharmakologische Behandlung von Neutrophilen für NET Quantifizierung von Immun
- Bereiten Poly-L-Lysin beschichtete 48-Well-Platten mit Glasdeckgläschen.
- Legen Sie ein 8-mm-Glasdeckgläschen in jeder Vertiefung, fügen 55 ul sterilen 0,01% Poly-L-Lysin und inkubiere ~ 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Zweimal waschen mit 200 ul 1x PBS. Lagern Sie die Platten mit 200 ul 1x PBS pro Vertiefung in einem Kühlschrank, bis sie benötigt.
- Autoefully mit 100 ul Zellsuspension (2 x 10 5/100 & mgr; l) aus Schritt 1.1.9 pro Vertiefung in der Mitte jedes Deckglas.
- Je 100 & mgr; l pro Vertiefung entweder den letzten 10 mM MßCD oder den letzten 25 nM PMA.
- Zentrifuge 5 min bei 370 xg mit Bremse.
- Inkubieren für 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Zentrifuge 5 min bei 370 xg mit Bremse.
- Fixieren Sie die Zellen mit 155 ul 4% PFA, wickeln sie in Kunststoffparaffinfilm, und speichert sie über Nacht bei 4 ° C oder 10 min bei RT.
HINWEIS: Für Informationen über die NET Bildung von MßCD induziert, siehe Neumann et al. 15.
- Bereiten Poly-L-Lysin beschichtete 48-Well-Platten mit Glasdeckgläschen.
2. Lipid Isolierung und Analyse von menschlichem Blut abgeleiteten Neutrophile
- Isolieren der Lipide aus dem menschlichen peripheren Blut-Neutrophilen abgeleitet basierend auf Bligh und Dyer 22 und Brogden et al. 23
- Auf Eis, eine Pipette die Neutrophilen (in Methanol und Chloroform-Lösung) in ein 15 ml Schraubdeckel Glasrohr mit einer Polytetrafluorethylen (PTFE) Dichtung und homogenisieren sie für 1 min durch Schütteln. Verwenden Glasröhren, die Lipide zu verhindern, dass Kunststoffoberflächen zu binden. Verwendung PTFE Kappen Verunreinigungen aus Gummi / Kunststoff zu verhindern.
- 2 mL Methanol 1 min später von 1 ml Chloroform. Schütteln Sie wieder für 1 min.
- Drehen, um die Glasrohre bei RT und 50 rpm für 30 min.
- Pelle die Proteinfraktion von der Lösung bei 7 ° C und 1.952 × g für 10 min zentrifugiert.
- Sorgfältig dekantiert den Überstand in ein neues 15 ml-Glasrohr mit Schraubverschluß, hinter dem proteinhaltigen Pellets verlassen. Lagern Sie das Pellet bei -20 ° C für eine spätere Quantifizierung.
- 1 ml Chloroform warten, 1 min, 1 ml bidestilliertem Wasser, und invertieren das Glas mit Schraubverschluß Rohr mit der Probe für 30 s.
- Falls erforderlich, durchführt, indem einen optionalen weiteren Reinigungsschritt Schritt 2.1.8 wiederholen.
- Trocknen Sie die Proben in einem Vakuum-Konzentrator bei 60 ° C und im Kühlschrank bei -20 ° C, bis es benötigt.
- Bereiten Sie die folgenden vier Lauf Lösungen und Färbelösung.
- Lösung 1: Mischen Ethylacetat (26,6%), 1-propanol (26,6%), Chloroform (26,6%), Methanol (26,6%) und Kaliumchlorid (9,6%). Bereiten KCl durch Auflösen von 0,25 g KCl in 100 ml HPLC-Qualität Wasser.
- Lösung 2: Mischung von n-Hexan (73%), Diethylether (23%) und Citronensäure (2%).
- Lösung 3: 100% n-Hexan.
- Bereiten Sie die Färbelösung durchMischen von destilliertem Wasser (90 ml) mit 7,5 g Kupfersulfat, und dann werden 10 ml Phosphorsäure hinzuzufügen.
- Füllen bis zu 5 mm von jeder Lösung in einem separaten Glaskammer. Fügen Sie jede Art von Filterpapier, die Laufgeschwindigkeit in jeder Kammer zu erhöhen.
- Vorinkubieren eine 20 x 10 cm HPTLC Kieselgel 60 Glasplatte in der ersten Lauflösung, bis die Lösung, die die Lauf Oberseite der Platte erreicht. trocknet dann 10 min bei 110 ° C.
ANMERKUNG: Diese Platten können vor der Verwendung für die zukünftige Verwendung in Aluminiumfolie getrocknet und für 10 min bei 110 ° C gelagert werden. - Man löst die Lipid Pelle aus Schritt 2.1.10 in 200 ul Chloroform / Methanol (1: 1) -Lösung und inkubieren bei 37 ° C für 15 min zu lösen.
- Verwenden Sie ein Lineal und einen weichen Bleistift die Ladestellen für die gewünschte Anzahl von Proben, sowie mindestens eine Standard zu markieren. Mark der Fahrstrecke bei etwa 4 cm und 6 cm für die erste und zweite Lauflösung, respectively.
- Um die Proben zu laden, waschen die 10 & mgr; l-Spritze 3 mal in Chloroform / Methanol (1: 1) vor jede neue Probenbeladung. Last 10 & mgr; l jede Probe tropfenweise und versucht, die Probe zu konzentrieren sich auf möglichst kleines Gebiet wie möglich. Die Proben sollten mindestens in Duplikaten geladen werden.
- Die Platte wird senkrecht in die erste Kammer mit Lösung 1 ausgeführt (Schritt 2.2.1.1). Stellen Sie sicher, dass die Platte an der Wand der Glaskammer parallel ist, eine einheitliche Migrationsgeschwindigkeit zu erreichen.
- Sobald die Lösungsmittelleitung die erste Markierung erreicht hat, entfernen, die Platte, trocknet, und es in der zweiten Lösung platzieren. Wiederholen Sie ähnliche Schritte für die zweite und für den dritten Lauf Lösungen; verlassen, um die Platte in der Lösung, bis die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht hat, dann entfernen und bei RT für 1 min trocknen.
- Plazierungsplatte in Kupfersulfatlösung für 7 s. Entfernen Sie die Platte, gut trocknen, und backen in einem Ofen für 7 min bei 170 ° C. Warten für die Platte zu kühlen.
- Using eine Dünnschichtchromatographie und Gelanalyse - Software, sowie eine Bildverarbeitungssoftware, scannen und analysieren , wie zuvor von Brogden et al. 23.
- Anhängen einer 100 x 4,6 mm-Säule auf eine 5 & mgr; m / 4,6 mm guard Patrone und erhitzen Sie es auf 32 ° C. Verwenden von Methanol als mobile Phase bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min bei 65 bar und einem UV-Detektor bei 202 nm Mess die Menge des Cholesterins in jeder Probe zu quantifizieren.
- Waschen Sie die HPLC Maschine gründlich vor der Proben zu analysieren, die folgenden Schritte: Reinigen der Pumpe, um die Nadel Waschen, Spülen, den Topf, Spülen der Spritze, und Waschen des Pumpenspülung. Waschen Sie alle mit Wasser. Schließlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min für 5 min ein System Spülung mit Methanol durchzuführen.
- Um eine Cholesterin-Standardkurve herzustellen, bereiten mindestens 4 Konzentrationen im Bereichvon 0,05 mg / ml bis 2 mg / ml Cholesterin in Chloroform / Methanol (1: 1) 24.
- Resuspendieren der erhaltenen Proben von Schritt 2.1.10 in 500 ul Chloroform / Methanol (1: 1) in bernsteinfarbenen 1,5 ml Glasflaschen mit Schraubdeckel-rot PTFE / weiß Silikon Deckel.
- Quantifizierung der Cholesterinkonzentrationen des Standard in Schritt 2.3.3 unter Verwendung.
HINWEIS: Füllen Sie das Probenahmeprotokoll, beginnend mit mindestens einem Standard und eine Negativkontrolle, die von den Proben verfolgt wird. - Die Ergebnisse sind als die Fläche unter der Kurve und vergleichen Sie zwischen entsprechenden Proben jeder statistische Software.
HINWEIS: Die Ergebnisse können auch gegen eine Standardkurve quantifiziert werden und können als Gesamtcholesterinmenge pro ml, g, oder die Anzahl der Zellen gezeigt werden. Die Standardkurve sollte Gleichung unter Verwendung der Werte in Schritt 2.3.3 erhalten wurden, berechnet werden.
3. Visualisierung und Quantifizierung von NETs
- Visualization von NETs
HINWEIS: Die Visualisierung von NETs basiert auf zuvor veröffentlichte Arbeit von Neumann et al. 15.- Waschen der fixierten Proben aus Schritt 1.3.8 3-mal mit 200 ul 1x PBS.
- Block und Permeabilisierung mit 100 ul 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS pro Well für 45 min bei RT.
- Füge 100 & mgr; l primären Antikörper: monoklonaler Maus-anti-DNA-Histon-1-Antikörper (verdünnt das Lager mit 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS, enthaltend 2% BSA und 0,2% Triton X-100) oder polyklonalen Antikörper gegen Myeloperoxidase (MPO; anti-Kaninchen-MPO; verdünnt 1: 300 in PBS 2% BSA und 0,2% Triton X-100) enthält. Inkubiere über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen 3 mal mit 200 ul 1x PBS.
- Füge 100 & mgr; l des sekundären Antikörpers (Fluoreszenz-markierte Ziege-anti-Maus; 1: 1000 in BSA-PBS-Triton X-100 und Ziegen-anti-Kaninchen, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Waschen Sie 3-mal mit 200 & #181; l 1x PBS.
- Entfernen Sie Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie sie mit 3 & mgr; l Eindeckmedium enthält DAPI auf Glasplättchen Gesicht nach unten.
- Untersuchen der Proben eines konfokales invertiertes Basisfluoreszenzmikroskop mit einem HCX PL APO 40X 0,75-1,25 -Ölimmersionsobjektiv 15 ausgestattet ist .
- Quantifizierung des NET-freisetzenden Kern
- Öffnen Sie eine Bildbearbeitungssoftware (zB ImageJ) und per Drag & Drop Bild von Interesse in der Werkzeugleiste.
- Klicken Sie auf „Plugins“, „Analysieren“ und „Zellzähler.“
- Die Taste „Initialisieren“ in den Zählerfenstern und wählt einen Zählertyp (zB, klicken Sie auf 7 in rot für NET-Releasing - Zellen und 8 in gelb für nicht-Releasing - Zellen, wie dargestellt in 6B-I und II).
HINWEIS: Die Kriterien für die NET-positive Zellen: positiv gefärbter grüner Kern + ein weniger dicht nucleus (Verlust der Lobularität) oder ein Verlust der runden Form des Kerns + eine erhöhte Größe des Kerns oder ein Auftreten einer deutlichen extrazellulären off-shoot. - Klicken Sie auf jede Zelle der Einhaltung der oben genannten Kriterien und schreibt die gezählte Anzahl von Zellen in ein Datenblatt einer Analyse-Software.
- Berechnen des Prozentsatzes der NET-Releasing-Zellen unter Verwendung des gezählten Zellzahlen von NET-freisetzenden und nicht-freisetzende Zellen.
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Representative Results
Humanblut abgeleitetes Neutrophile wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 2) isoliert. Um die Wirkung von Lipid-Veränderungen auf Neutrophilen zu untersuchen, wurden die Zellen mit 10 mM MßCD behandelt, der Cholesterin aus der Zelle verarmt. Anschließend wurden die Lipide aus den Proben von Bligh und Dyer (1, linkes Feld) isoliert, wie von Brogden et al. 23. Die hergestellten Lipidproben wurden auf Kieselgel-HPTLC-Platten und Lauf geladen, um eine Drei-Lösung Protokoll, das ein breites Spektrum von Lipiden, einschließlich Cholesterin, Cholesterinester, Sphingomyelin, Phospholipide und Triacylglyceride, freie Fettsäuren zu trennen und zu visualisieren, wurde optimiert , Monoacylglycerin, Phosphatidylethanolamin, Cardiolipin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin (3A). Oxygenierten Derivaten von Cholesterin (Oxysterole) ist nicht nachweisbar with dieser Methode. Eine zusätzliche quantitative Analyse des Cholesterins wurde unter Verwendung von HPLC (3B) durchgeführt. Der Regressionswert für Cholesterin war deutlich besser , wenn HPLC (4A) unter Verwendung von im Vergleich zu HPTLC (4B). Um die NETs zu visualisieren, wurden die Zellen mit den oben genannten Reize stimuliert, fixiert und gefärbt DNA / Histon 1 (grün), MPO (rot) und DNA (blau) als typische NET Markierungen (5A). Wie dargestellt in 5A, eine klaren Auftreten von MPO, DNA / Histon - 1 und DNA tritt in dem NETs , wenn die Zellen mit 10 mM MßCD für 2 h behandelt. Anschließend wurde die Wirkung der Senkung des Cholesterinspiegels mikroskopisch analysiert. Daher wurden die Zellen für DNA (blau) und DNA / Histon - 1 (grün) gefärbt, und NET-Releasing - Kern wurde unter Verwendung der Zellenzähler Plugin von der Bildverarbeitungssoftware ImageJ (5B) gezählt. Unbehandelte Neutrophilen diente als Kontrolle für spontaneouNettobildung (5B-i). In der dargestellten Figur wurde das Netz Freisetzung in unbehandeltem Neutrophile nach 2 h Inkubation 3,89%, während die Behandlung der Zellen mit 10 mM MßCD in 35,17% Nettobildung (5B) geführt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte , die bei der Lipidzusammensetzung und die extrazellulären trap - Freisetzung aus humanem Blut gewonnenen Neutrophilen bestimmt wird . Neutrophile werden isoliert, mit einer Dichte-Gradienten und mit Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) Lipid behandelten Änderungen und NET-Bildung zu induzieren. Danach Lipide werden isoliert und analysiert, indem entweder HPTLC oder HPLC verwendet und NETs werden visualisiert und durch Immunofluoreszenz quantifiziert.
Abbildung 3: HPTLC und HPLC - Analyse von Lipiden aus Neutrophilen isoliert. (A) Standard verwendet , um die Lipide über HPTLC (linke Spur) , die in Neutrophilen zu identifizieren. CE: Cholesterinester, TG: Triacylglyceride, FFA: Freie Fettsäuren, Chol: Cholesterin, MG: Monoacylglycerol, PE: Phosphatidylethanolamin, CL: Cardiolipin, PS: Phosphatidylserin, PC: Phosphatidylcholin und SM: Sphingomyelin. (B) repräsentatives Ergebnis eine cholesterin spezifischen Peak für 2 mg / ml bei 4.980 min unter Verwendung des HPLC hier beschriebene Protokoll zeigt.
Abbildung 4: HPLC und HPTLC - Analysen von Cholesterin. Graphen , die die Beziehung zwischen der Cholesterinkonzentration und der Fläche, wie sie durch HPLC (A) gemessen, und die Bandenintensität, wie sie durch HPTLC (B) gemessen. Die minimale Nachweisgrenze für HPLC betrug 0,0016 mg / ml, mit einem Regressionswert für die Standardkurve von 0,998 N = 3, SEM (A). Cholesterin im Bereich von 2 mg / ml bis 0,05 mg / ml kann semi-quantitativ bestimmt wird unter Verwendung von HPTLC (B), mit einer unteren Nachweisgrenze von 0,05 mg / mL N = 3, SEM. Der Regressionswert für die HPTLC Standardkurve ist 0,918.
Abbildung 5: Repräsentative Fluoreszenzaufnahmen Anzeige NET Strukturen und SUBSEQießend NET Quantifizierung. (A) Neutrophilen mit 10 mM MßCD stimulierte für 2 h für (ii) MPO (rot) gefärbt wurden, (iii) DNA / Histon 1 (grün), und (iv) DNA (blau). (I) Überlagerung von (ii), (iii) und (iv). (B) Die Zellen wurden für 2 h inkubiert mit (i) HBSS Medium oder (ii) 10 mM MßCD und freigegeben NETs wurden Kerne (blau) und DNA / Histon - 1 (grün) gefärbt. NET-negative Zellkerne wurden mit 8-Zähler (gelb) und NET-positiven Kerne mit Zählern 7 (rot) markiert.
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Discussion
Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden , um bestimmte Lipide zu analysieren, wie Cholesterin, durch HPTLC oder HPLC und die Auswirkungen der pharmakologischen Lipidveränderungen auf der Bildung von NETs zu untersuchen (siehe Neumann et al. 15).
HPTLC ist eine relativ kostengünstige und einfache Methode, ein breites Spektrum von Lipiden in einer großen Anzahl von Proben zu analysieren. Dieses Verfahren wurde in vielen Forschungsgebieten, einschließlich antibiotischer Quantifizierungs 25, Lipideinlagerung in lysosomalen Speicherkrankheiten 26 und die Bestimmung des Cholesterins und der cholesterylglucoside Ebenen in Epithelzellen 27 verwendet. Das hier beschriebene Verfahren wurde modifiziert und optimiert Lipide isolieren von einer gereinigten Neutrophilen-Population; jedoch kann eine leicht modifizierte Version auch Lipide verwendet werden , zu isolieren , aus Gewebeproben (siehe Brogden et al. 23). Mit diesem trafhod, Lipide können auch gegen einen bekannten Standard effektiv abgetrennt, identifiziert und semi-quantitativ bestimmt werden. Ein kritischer Schritt in diesem Verfahren ist die Verwendung des jeweiligen genannten Puffers, da die Verwendung von irgendeinem anderen Puffer oder Medium zu Lipid Kontamination und unspezifischer Lipidbanden in den Proben führen kann. Da die Empfindlichkeit mit HPTLC begrenzt ist, sollte HPLC als genauere Methode für die absolute Quantifizierung verwendet werden.
HPLC ermöglicht die Quantifizierung und Identifizierung von Cholesterin und seinen verschiedenen Formen oder Derivate, die durch einen Vergleich mit einem bekannten Lipid durchgeführt wird. Durch die Verwendung des oben beschriebenen Protokoll ist es möglich , zu quantifizieren unten zuverlässig auf 0,0016 mg / ml Cholesterin (4A), mit einem linearen Verhältnis von bis zu 10 mg / ml (R = 0,990). Die HPTLC Verfahren ermöglicht Cholesterinerkennung bis zu 0,05 mg / ml, aber mit einer sigmoiden Kurve und eine untere Korrelationskoeffizient von R = 0,906 (4B). Die höhere Empfindlichkeit und höhere Korrelation somit Koeffizient macht HPLC ein viel besseres Verfahren zur genauen Quantifizierung der Lipide, die anschließend kleinere Unterschiede zwischen den Proben ermöglicht, erkannt werden. Jedoch können beide Verfahren in Kombination verwendet werden; HPTLC kann verwendet werden, um einen Überblick zu verschaffen, in die Lipide verändert werden können, und die HPLC können in einem zielgerichteteren Ansatz verwendet werden, um den Unterschied eines bestimmten Lipids in einer gegebenen Probe zu quantifizieren. Wenn unsere Messungen mit den von anderen 28, 29, weniger Cholesterin wurde in insgesamt Neutrophilen quantifiziert erhaltenen Werten verglichen. Dies könnte durch die verwendete Methodik erläutert. Andere Studien verwendet, um eine fluorimetrische Detektion, die auf einem Enzym-gekoppelten Reaktion basiert, die sowohl freie Cholesterin und cholesterylesters erkennt.
Hier werden HPTLC und HPLC in Kombination verwendet , um sicherzustellen , dass MßCD zu einer deutlichen Reduzierung des Cholesterins führt , wie auch zuvor von Gorudko et al.ss = "xref"> 28. Sie zeigten eine 60% ige Reduktion des Cholesterins in Neutrophilen durch 10 mM MßCD. Zusätzlich ist eine leichte Reduzierung von Sphingomyelin Niveau aber nicht Cholesterinester nachweisbar war in den Neutrophilen , wenn sie mit MßCD behandelt (siehe Neumann et al. 15). Zugleich führt die Depletion von Cholesterin zur Bildung von NETs (siehe Neumann et al. 15). Diese finden korreliert gut mit dem Phänomen, dass die Behandlung von Neutrophilen mit Statinen, Inhibitoren der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A (HMG-CoA) Reduktase, das geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym bei der Cholesterinbiosynthese, steigert die Bildung von NETs. Da Statin - Behandlung von Neutrophilen jedoch stärker NET Induktion weist im Vergleich zu MßCD Behandlung (siehe Neumann et al. 15 und Chow et al. 20), zusätzliche Wirkungen auf prenylierten membranverankerten Effektor Prote beispielsweise StatinenIn könnte auch bei der Bildung von NETs beteiligt sein.
Die Bildung von NETs ist ein relativ neuer beschriebener Wirtsabwehrmechanismus. Die extrazelluläre DNA Fasern haben nun nicht nur bei Säugetieren , 30, 31, sondern auch in Huhn, Fisch, Garnelen beschrieben wurden, und Pflanzen , 32, 33, 34, 35. Bei der Stimulierung der Neutrophilen mit Krankheitserregern oder anderen Reizen sind NETs in den extrazellulären Raum freigesetzt, wo sie einzufangen und töten möglicherweise eingedrungene Krankheitserreger 36. Die Untersuchung der Lipidzusammensetzung einer aktivierten Neutrophilen helfen kann, die zellulären Mechanismen der Vermittlung seiner antimikrobiellen Aktivität zu verstehen. Da wir nur den Gesamtlipidspiegel der Neutrophilen gemessen, bleibt es bestimmt werden, wie der Lipidgehalt unterscheidet und wird von MßCD in ganzer Zelle im Vergleich zu Plas betroffenma Membranen und zwischen verschiedenen Membranmikrodomänen. Dies erfordert jedoch spezifische Membrantrennverfahren wie zuvor beschrieben (Xu et al.). 37
Neben Chromatin enthalten menschliche neutrophile NETs mehrere Proteine, wie MPO; Elastase, das antimikrobielle Peptid LL-37; oder Calgranulin 17, 36. Die neuere Forschung hat die Rolle dieser spezifischen Proteine und morphologische Veränderungen stark konzentriert, die zu initiieren und erleichtern die Bildung von NETs 15, 38, 39. Doch bisher ist es nur das Wissen über die Bedeutung bestimmter Lipide beschränkt während dieses Prozesses 15, 20. Daher ist dies ein besonders interessantes Gebiet im Detail in der Zukunft erforscht werden. Schließlich Wissen über Lipidmembran Modifikationenkönnte als Grundlage dienen für therapeutische Ansätze des Immunsystems gegen Infektionen zu erhöhen. Als Beispiel wurde gezeigt , dass die Depletion von Cholesterin im Kampf gegen antibiotikaresistente Krankheitserreger wie H. pylori helfen könnte, da es sich gezeigt hat , dass Cholesterin 40 den Widerstand dieser Fehler gegen Antibiotika und antimikrobielle Peptide verbessert. Ähnliche Studien könnten für das Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen mit verschiedenen Bakterienart hilfreich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Akademie für Tiergesundheit (HbH) und ein Stipendiums aus dem PhD-Programm „Tiere und Zoonosen“ der Universität für Veterinärmedizin, Hannover, Deutschland, zur Verfügung gestellt zu Ariane Neumann unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
