Summary
Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.
Abstract
Lipide-analyse uitgevoerd door hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) is een relatief eenvoudige, kosteneffectieve werkwijze voor het analyseren van een breed scala aan lipiden. De functie van lipiden (bijvoorbeeld in gastheer-pathogeen interacties of gastheer entry) is gemeld dat zij een cruciale rol in de cellulaire processen. Hier tonen wij een werkwijze voor lipidesamenstelling te bepalen, met een focus op het cholesterolgehalte primaire bloed afgeleide neutrofielen door HPTLC vergeleken met sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC). Het doel was om de rol van lipiden / cholesterol veranderingen in de vorming van neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) te onderzoeken. Nettovrijval is bekend als een afweer mechanisme om ziektekiemen te voorkomen verspreiding in de gastheer. Daarom werden bloed-afkomstige humane neutrofielen behandeld met methyl-β-cyclodextrine (MβCD) lipide veranderingen induceren in de cellen. Gebruik HPTLC en HPLC, hebben we aangetoond dat MβCD behandeling van de cellen leidt tot lipideveranderingen geassocieerd met een significante verlaging van het cholesterolgehalte van de cel. Tegelijkertijd, MβCD behandeling van neutrofielen leidde tot de vorming van NET, zoals getoond door immunofluorescentie microscopie. Kortom, hier presenteren we een gedetailleerde methode om lipide veranderingen in neutrofielen en de vorming van de netten te bestuderen.
Introduction
Lipiden is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in cel homeostase, celdood, gastheer-pathogeen interacties, en cytokine release 1. Na verloop van tijd, belangstelling voor en kennis over de impact van lipiden in gastheer-pathogeen interacties of ontsteking zijn toegenomen, en verschillende publicaties bevestigen de centrale rol van bepaalde lipiden, in het bijzonder de steroïde cholesterol, in cellulaire reacties. Farmacologische behandeling met statinen, die als remmers van cholesterol-biosynthese worden door blokkeren van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reductase (HMG-CoA-reductase), kan fungeren als anti-inflammatoire middelen door verlaging van de serumspiegels van interleukine 6 en C-reactief proteïne 2. Cholesterol en glycosphingolipide verrijkte structuren kan worden gebruikt door verschillende pathogenen, zoals bacteriën en virussen, als toegangspoort tot de host 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipiden (zoals sfingomyeline) bleken te gebruiken door ziekteverwekkers hun pathogeniciteit 7 bevorderen. In macrofagen, mycobacteriën gebruik cholesterol-verrijkte domeinen cellen binnendringt; een uitputting van cholesterol remt mycobacteriële opname 8. Bovendien infectie van macrofagen met Francisella tularensis, een zooenoseverwekker belast tularemie (ook bekend als konijn koorts) 9, geleid tot een infectie die werd afgeschaft toen cholesterol werd ontdaan van de membranen 10. Ook de invasie van gastheercellen door Escherichia coli via lipide-rijke structuren werd aangetoond dat cholesterol-afhankelijke 4 zijn. Bovendien Salmonella typhimurium besmettingsexperimenten epitheelcellen aangetoond dat cholesterol essentieel pathogeen binnenkomst in de cellen 11. Cholesterol uitputting inhibited de opname van Salmonella 11. Bovendien, een recente studie van Gilk et al. aangetoond dat cholesterol een belangrijke rol bij de opname van Coxiella burnetii 12 speelt. Bovendien Tuong et al. bleek dat 25-hydroxycholesterol een cruciale rol in fagocytose door lipopolysaccharide (LPS) speelt gestimuleerde macrofagen 13. Fagocytose werd verminderd wanneer macrofagen farmacologisch werden getrakteerd op cholesterol 14 afbreken. Zo, cholesterol en andere lipiden lijken een belangrijke rol bij infecties en ontstekingen te spelen, omdat hun uitputting het risico op invasie van een aantal ziekteverwekkers 10, 11, 12 kan verminderen.
Onlangs waren we in staat om aan te tonen dat Lipidenveranderingen, in het bijzonder de uitputting van cholesterol uit de cel, induceren de vorming van neutrofielen extracellular vallen (NET) in menselijk bloed afgeleide neutrofielen 15. Sinds de ontdekking van NET in 2004, hebben ze aangetoond dat cruciale rol spelen in bacteriële beknelling, en dus belemmeren de verspreiding van de infectie 16, 17. NET bestaan uit een DNA skelet geassocieerd met histonen, proteasen en antimicrobiële peptiden 16. De afgifte van het NET door neutrofielen kan worden geïnduceerd door binnendringende ziekteverwekkers 18, 19 en chemicaliën zoals forbol myristaat acetaat (PMA) of statines 16, 20. Echter, de gedetailleerde cellulaire mechanismen, en in het bijzonder de rol van lipiden in dit proces, zijn nog steeds niet helemaal duidelijk. De analyse van de lipiden kan leiden tot een beter begrip van de betrokken in een breed scala van cellulaire processen en interacties, zoals de vrijlating van de netten mechanismen. CholesteRol en sfingomyeline zijn vitale bestanddelen van het celmembraan en lipide microdomeinen, waar stabiliteit toe te voegen en het clusteren van de bij eiwittransport en signaleringsgebeurtenissen 21 eiwitten bevorderen. De mechanistische rol van bepaalde lipiden, amfifiele farmacologische middelen, zoals de cyclische oligosaccharide methyl-β-cyclodextrine (MβCD) onderzoeken kunnen worden toegepast om de lipidesamenstelling van een cel veranderen en cholesterol in vitro 15 verminderen. Hier presenteren we een methode om HPTLC gebruiken om de lipide samenstelling van neutrofielen te analyseren in reactie op MβCD. HPLC werd gebruikt om het niveau van cholesterol in de neutrofielen bevolking te bevestigen. Verder beschrijven we een werkwijze voor de vorming van NET door immuunfluorescentiemicroscopie in menselijk bloed afgeleide visualiseren neutrofielen als reactie op MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De collectie van het perifere bloed in dit protocol werd goedgekeurd door de lokale human onderzoek ethische commissie. Alle proefpersonen op voorwaarde dat hun informed consent.
1. Isolatie van Menselijk bloed afkomstige neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugeren
- Isolatie van humaan bloed afgeleide neutrofielen
- Laag ~ 20 ml bloed op 20 ml natrium diatrizoaat / dextran-oplossing bij een vlam en zonder menging.
- Centrifugeer 30 min bij 470 xg zonder rem.
- Verwijder de mononucleaire cellen en het gelige plasmalaag. Breng de polymorfonucleaire cellen (PMN) fase (tweede fase met accumulatie cellen; Figuren 1 en 2) naar een nieuwe buis van 50 ml en vul tot 50 ml met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml steriel water for5 en de erytrocyten te lyseren.
- Onmiddellijk vul tot 50 ml met 1x PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 470 x g.
- Verwijder het supernatant. De pellet moet wit zijn. Als het nog steeds rood, herhaalt u de stappen 1.1.5 en 1.1.6.
- Resuspendeer de pellet in 1000 pl Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Tel het aantal cellen met behulp van trypan blauw kleuring in een hemocytometer onder een lichtmicroscoop.
- Bereid een celsuspensie in RPMI bij een concentratie van 2 x 10 6 / ml. Ongeveer 2,5 x 10 7 neutrofielen kunnen worden geoogst uit 20 ml bloed.
- Farmacologische behandeling van neutrofielen op lipide analyses
- Met 5 x 10 7 cellen uit stap 1.1.9. Pas het aantal cellen in zuivere Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) medium in aanwezigheid of afwezigheid van 10 mM MβCD of 25 nM PMA in een totaal volume van 300 pl in een 1,5 ml reactiebuis.
- Incubeer de monsters in dereactiebuizen gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 300 ui HBSS.
- Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml chloroform / methanol (1: 1), gehomogeniseerd met een 26 G injectienaald door zuigen het monster in en uit in een 1 ml injectiespuit 10 keer, en de monsters bewaren bij -20 ° C.
- Farmacologische behandeling van neutrofielen voor NET kwantificering van immunofluorescentie
- Bereid poly-L-lysine-gecoate 48-well platen met glazen dekglaasjes.
- Plaats een 8-mm glazen dekglaasje in elk putje, voeg 55 ul steriel 0,01% poly-L-lysine en incubeer gedurende ~ 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Tweemaal wassen met 200 pi 1X PBS. Opslaan van de platen met 200 pi 1X PBS per putje in de koelkast totdat ze nodig.
- Autoefully 100 ul celsuspensie (2 x 10 5/100 ul) toe uit stap 1.1.9 per putje in het midden van elke dekglaasje.
- Voeg 100 ul per putje van hetzij de laatste 10 mM MβCD of de laatste 25 nM PMA.
- Centrifugeren gedurende 5 min bij 370 xg met rem.
- Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Centrifugeren gedurende 5 min bij 370 xg met rem.
- Fixeer de cellen met 155 pl 4% PFA, wikkel ze in plastic paraffinefilm en bewaar ze overnacht bij 4 ° C of gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Voor gegevens over het netto vorming geïnduceerd door MβCD, zie Neumann et al. 15.
- Bereid poly-L-lysine-gecoate 48-well platen met glazen dekglaasjes.
2. Lipide Isolatie en analyse van menselijk bloed afgeleide Neutrofielen
- Isoleer de lipiden van menselijk perifeer bloed neutrofielen afgeleide gebaseerd op Bligh en Dyer 22 en Brogden et al. 23
- Op ijs, pipet de neutrofielen (aanwezig in methanol en chloroform oplossing) aan een 15 ml glazen buis met schroefdop met een polytetrafluorethyleen (PTFE) afdichting en homogeniseer ze door gedurende 1 min. Met glazen buizen om te voorkomen dat de lipiden binden aan kunststof oppervlakken. Met PTFE caps om verontreiniging van rubber / kunststof te voorkomen.
- Voeg 2 ml methanol, gevolgd door 1 min later 1 ml chloroform. Weer schudden gedurende 1 min.
- Roteer de glazen buizen bij kamertemperatuur en 50 rpm gedurende 30 minuten.
- Pellet de eiwitfractie door centrifugeren van de oplossing bij 7 ° C en 1952 x g gedurende 10 min.
- Voorzichtig decanteren van het supernatans in een nieuwe 15 ml glazen buis met schroefdop, waarbij de proteïne bevattende pellet achteren. Bewaar de pellet bij -20 ° C voor toekomstig kwantificering.
- Voeg 1 ml chloroform, wacht 1 min, voeg 1 ml dubbel gedestilleerd water, en keren de glazen schroefdop buis met het monster gedurende 30 s.
- Eventueel uitvoeren van een eventuele verdere zuiveringsstap door het herhalen van stap 2.1.8.
- De monsters in een vacuümconcentrator bij 60 ° C en bewaar ze bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
- Bereid de volgende vier lopende oplossingen en kleuroplossing.
- Oplossing 1: Meng ethylacetaat (26,6%), 1-propanol (26,6%), chloroform (26,6%), methanol (26,6%) en kaliumchloride (9,6%). KCl bereid door het oplossen van 0,25 g KCl in 100 ml HPLC kwaliteit water.
- Oplossing 2: Mix n-hexaan (73%), diethylether (23%) en citroenzuur (2%).
- Oplossing 3: 100% n-hexaan.
- Bereid de kleuroplossing doormengen gedestilleerd water (90 ml) met 7,5 g kopersulfaat en voeg 10 ml fosforzuur.
- Vult tot 5 mm van elke oplossing in een afzonderlijke glazen kamer. Voeg eventueel soort filter papier om de loopsnelheid in elke kamer te verhogen.
- Pre-incubeer 20 x 10 cm HPTLC silicagel 60 glasplaat eerste running oplossing tot de oplossing running de bovenkant van de plaat bereikt. droog het vervolgens gedurende 10 minuten bij 110 ° C.
Opmerking: Deze platen kunnen worden opgeslagen voor toekomstig gebruik in aluminiumfolie en gedurende 10 minuten bij 110 ° C voorafgaand aan gebruik. - Los de lipide pellet verkregen uit stap 2.1.10 in 200 pl chloroform / methanol (1: 1) oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C op te lossen.
- Gebruik een liniaal en een viltstift om de belasting plekken voor het gewenste aantal monsters markeren, vermeerderd met ten minste één standaard. Markeer de afgelegde afstand bij benadering 4 cm en 6 cm voor de eerste en tweede lopende oplossing resp.
- De samples, was de 10 pi injectiespuit 3 maal in chloroform / methanol (1: 1) voorafgaande aan het laden van elk nieuw monster. Belasting 10 pi van elk monster druppelsgewijze en probeerde de monster zo klein mogelijk gebied te concentreren. De monsters moeten worden geladen ten minste in duplo.
- Plaats de plaat verticaal in de eerste kamer met stromend oplossing 1 (stap 2.2.1.1). Zorgen dat de plaat parallel aan de wand van de glazen kamer van een gelijkmatige migratie snelheid te bereiken.
- Zodra de oplosmiddelleiding de eerste markering heeft bereikt, verwijder de plaat, drogen en plaats deze in de tweede oplossing. Herhaal soortgelijke stappen voor de tweede en de derde lopende oplossingen; Laat de plaat in de oplossing tot het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat bereikt, verwijder en drogen bij KT gedurende 1 minuut.
- Plaats plaat kopersulfaatoplossing 7 s. Verwijderen van de plaat, het grondig te drogen en bakken in een oven gedurende 7 minuten bij 170 ° C. Wacht tot de plaat af te koelen.
- Using dunnelaagchromatografie en gel analyse software, en een beeldverwerkingssoftware, scannen en analyseren zoals eerder beschreven door Brogden et al. 23.
- Bevestig een 100 x 4,6 mm kolom tot 5 um / 4,6 mm guard cartridge en verwarm tot 32 ° C. Met methanol als de mobiele fase bij een stroomsnelheid van 1 ml / min bij 65 bar en een UV-detector bij 202 nm meet de hoeveelheid cholesterol in elk monster te kwantificeren.
- Was de HPLC machine grondig vóór analyse van de monsters, de volgende stappen: het reinigen van de pomp, het wassen van de naald, het spoelen van de pot, spoelen de spuit, en wassen van de pomp spoeling. Was alle met water. Tenslotte voeren een systeem spoelen met methanol bij een debiet van 5 ml / min gedurende 5 min.
- Een cholesterol standaardkromme vast, bereiden ten minste 4 concentraties0,05 mg / ml tot 2 mg / ml cholesterol in chloroform / methanol (1: 1) 24.
- Resuspendeer de verkregen uit stap 2.1.10 in 500 pl chloroform / methanol monsters (1: 1) in amberkleurige 1,5 ml glazen flesjes met schroefdop rode PTFE / wit silicone deksels.
- Kwantificeren cholesterol door gebruikmaking van de standaard bereid in stap 2.3.3.
OPMERKING: Vul het bemonsteringsprotocol, uitgaande van ten minste één standaard en één negatieve controle, gevolgd door de monsters. - De resultaten worden uitgedrukt als het oppervlak onder de curve en vergelijken tussen de nodige monsters met behulp van een statistische software.
Opmerking: De resultaten kunnen ook worden gekwantificeerd tegen een standaardcurve en kan worden weergegeven als de totale hoeveelheid cholesterol per ml, g of aantal cellen. De standaardkromme vergelijking worden berekend met de waarden verkregen bij stap 2.3.3.
3. visualisatie en kwantificering van NET
- Visualization van NET
LET OP: De visualisatie van de netten is gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Neumann et al. 15.- Was de vaste monsters uit stap 1.3.8 3 maal met 200 pi 1X PBS.
- Blok en permeabilize met 100 pl 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS per putje gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van primaire antilichamen: monoklonaal anti-DNA-histone 1-antilichaam (verdund de bouillon met 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS met 2% BSA en 0,2% Triton X-100) of polyklonaal antilichaam tegen myeloperoxidase (MPO; konijn anti-MPO, verdund 1: 300 in PBS met 2% BSA en 0,2% Triton X-100). Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Was 3 maal met 200 pi 1X PBS.
- Voeg 100 ul van het secundaire antilichaam (fluorescentie-gemerkt geit-anti-muis, 1: 1000 in BSA-PBS-Triton X-100 en geit anti-konijn, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) gedurende 1 uur bij RT in het donker.
- Was 3 maal met 200 & #181, l 1 x PBS.
- Dekglaasjes verwijderd met een pincet en leg ze neer met 3 ul van montage medium met DAPI op glasplaatjes.
- Onderzoek de monsters met behulp van een confocale omgekeerde base fluorescentiemicroscoop uitgerust met een HCX PL APO 40X 0,75-1,25 olie immersie objectief 15.
- Kwantificering van de-NET vrijgeven kernen
- Open een image processing software (bijvoorbeeld ImageJ) en sleep foto van belang in de werkbalk.
- Klik op "Plugins", "analyseren" en "Cell teller."
- Druk op de knop "Initialize" in de teller venster en kies een teller type (bijvoorbeeld, klik op 7 in rood voor-NET het vrijgeven van cellen en 8 in het geel voor niet-vrijgeven van cellen, zoals weergegeven in figuur 6B-i en ii).
LET OP: De criteria voor NET-positieve cellen: positief kleurden groen kern + een minder dicht nucleus (verlies van lobvorming) of een verlies van de ronde vorm van de kern + een toegenomen omvang van de kern of het optreden van een afzonderlijke extracellulair uitloper. - Klik op elke cel vast te houden aan de bovengenoemde criteria en schrijf het getelde aantal cellen in een data sheet van een analyse software.
- Bereken het percentage-NET het vrijgeven van cellen met behulp van het getelde aantal cellen van NET-vrijgeven en niet-vrijgeven van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humaan bloed afgeleide neutrofielen werden geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie (figuur 2). Om het effect van Lipidenveranderingen op neutrofielen te onderzoeken, werden de cellen behandeld met 10 mM MβCD die cholesterol put uit de cel. Vervolgens werden de lipiden geïsoleerd uit monsters van Bligh en Dyer (figuur 1, linker paneel), zoals beschreven door Brogden et al. 23. De bereide lipide monsters werden op silicagel HPTLC platen en uitgevoerd met een drie-oplossing protocol dat is geoptimaliseerd te scheiden en te visualiseren een breed scala van lipiden, zoals cholesterol, cholesterolesters, sfingomyeline, fosfolipiden en triacylglyceriden, vrije vetzuren geladen , monoacylglycerol, fosfatidylethanolamine, cardiolipine, fosfatidylserine en fosfatidylcholine (Figuur 3A). Geoxygeneerde derivaten van cholesterol (oxysterolen) niet detecteerbaar with deze werkwijze. Extra kwantitatieve analyse van cholesterol werd uitgevoerd met HPLC (Figuur 3B). De regressie waarde voor cholesterol was duidelijk beter bij gebruik van HPLC (Figuur 4A) in vergelijking met HPTLC (figuur 4B). De NET visualiseren, werden de cellen gestimuleerd met de hierboven genoemde stimuli, gefixeerd en gekleurd voor DNA / histon 1 (groen), MPO (rood) en DNA (blauw) typische NET merkers (Figuur 5A). Zoals weergegeven in figuur 5A, namelijk voorkomen van MPO, DNA / histon 1 en DNA optreedt in de NET wanneer de cellen werden behandeld met 10 mM MβCD gedurende 2 uur. Vervolgens werd het effect van cholesterolverlaging microscopisch geanalyseerd. Daarom werden de cellen gekleurd voor DNA (blauw) en DNA / histon 1 (groen) en NET-afgevende kernen werden geteld met de celtelinrichting plugin van de beeldverwerkingssoftware ImageJ (Figuur 5B). Onbehandelde neutrofielen diende als een controle voor spontaneounetto vorming (Figuur 5B-i). In de getoonde figuur, NET release in onbehandelde neutrofielen na 2 uur incubatie was 3,89%, terwijl de behandeling van de cellen met 10 mM MβCD leidde tot 35,17% netto vorming (Figuur 5B).
Figuur 1: schematische weergave van de stappen betrokken bij het bepalen van de lipidesamenstelling en extracellulaire inklembeveiliging uit menselijk bloed afgeleide neutrofielen. Neutrofielen worden geïsoleerd met behulp van een dichtheidsgradiënt en met Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) lipide wijzigingen en NET induceren. Daarna worden lipiden geïsoleerd en geanalyseerd met behulp van HPTLC of HPLC en NETs worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door immunofluorescentie.
Figuur 3: HPTLC en HPLC analyse van lipiden geïsoleerd uit neutrofielen. (A) standaard gebruikt om de lipiden aanwezig in neutrofielen worden geïdentificeerd aan de HPTLC (linker baan). CE: Cholesterol esters, TG: Triacylglyceriden, FFA: Vrije vetzuren, Chol: cholesterol, MG: monoacylglycerol, PE: fosfatidylethanolamine, CL: cardiolipine, PS: Fosfatidylserine, PC: fosfatidylcholine en SM: sfingomyeline. (B) Representatieve resultaat dat een cholesterol-specifieke piek voor 2 mg / ml bij 4.980 min volgens de HPLC-protocol beschreven.
Figuur 4: HPLC en HPTLC analyse van cholesterol. Grafieken die de relatie tussen cholesterol concentratie en omgeving, zoals gemeten met HPLC (A) en bandintensiteit, zoals gemeten met HPTLC (B). De minimale detectiegrens van HPLC was 0,0016 mg / ml, met een regressie waarde voor de standaardcurve van 0,998 N = 3, SEM (A). Cholesterol varieert van 2 mg / ml omlaag tot 0,05 mg / ml kan semi-gekwantificeerd met HPTLC (B) zijn, met een minimale detectiegrens van 0,05 mg / ml N = 3, SEM. De regressie waarde voor de HPTLC standaardcurve is 0,918.
Figuur 5: Vertegenwoordiger fluorescentie microfoto weergeven van NET structuren en subsequent NET kwantificering. (A) Neutrofielen gestimuleerd met 10 mM MβCD gedurende 2 uur werden gekleurd voor (ii) MPO (rood), (iii) DNA / histon 1 (groen), en (iv) DNA (blauw). (I) Overlay van (ii), (iii) en (iv). (B) De cellen werden gedurende 2 uur onder (i) HBSS medium of (ii) 10 mM MβCD en bezit NETs werden gekleurd voor kernen (blauw) en DNA / histon 1 (groen). NET-negatieve kernen werden gemerkt met teller 8 (geel) en NET-positieve kernen met teller 7 (rood).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke lipiden, zoals cholesterol, door HPTLC of HPLC analyseren en de effecten van farmacologische Lipidenveranderingen op de vorming van NET onderzoeken (zie Neumann et al. 15).
HPTLC is een relatief kosteneffectief en eenvoudige methode om een groot aantal lipiden analyseren van een groot aantal monsters. Deze werkwijze is gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder antibiotica kwantificering 25, lipideopslag in lysosomale stapelingsziekten 26, en de bepaling van cholesterol en cholesterylglucoside niveaus in epitheelcellen 27. De hier beschreven werkwijze werd gemodificeerd voor optimale lipiden uit een gezuiverde neutrofielen populatie te isoleren; echter kan een licht gewijzigde versie ook worden gebruikt om lipiden uit weefselmonsters (zie Brogden et al. 23) te isoleren. Met behulp van deze ontmoetinghod, lipiden kunnen ook effectief worden gescheiden, geïdentificeerd en semi-gekwantificeerd tegen een bekende standaard. Een kritische stap bij deze werkwijze is het gebruik van de respectievelijke genoemde buffer, aangezien het gebruik van elke andere buffer of medium kan leiden tot verontreiniging en lipide onspecifieke lipide banden in de monsters. Omdat gevoeligheid beperkt met HPTLC, HPLC moet worden gebruikt als nauwkeuriger worden absolute kwantificatie.
HPLC vergemakkelijkt de kwantificering en identificatie van cholesterol en zijn verschillende vormen of derivaten door het uitvoeren van een vergelijking met een bekend vet-. Met de hierboven beschreven protocol, is het mogelijk om betrouwbaar te kwantificeren tot op 0,0016 mg / ml cholesterol (figuur 4A), met een lineaire verhouding tot 10 mg / ml (r = 0,990). De HPTLC werkwijze maakt cholesterol detectie omlaag tot 0,05 mg / ml, maar met een sigmoïde curve en een lagere correlatiecoëfficiënt van R = 0,906 (figuur 4B). De hogere gevoeligheid en hogere correlatie coëfficiënt maakt aldus HPLC een veel betere werkwijze voor de nauwkeurige kwantificering van lipiden, die vervolgens mogelijk kleinere verschillen tussen de monsters te detecteren. Echter, beide methoden in combinatie worden gebruikt; HPTLC kan worden gebruikt om een overzicht waarin lipiden kunnen worden veranderd krijgen en HPLC kan worden gebruikt in een meer gerichte benadering van het verschil tussen een specifieke lipide in een bepaald monster te kwantificeren. Bij het vergelijken van onze metingen met de waarden die door anderen 28, 29, werd minder cholesterol gekwantificeerd in totaal neutrofielen. Dit kan worden verklaard door de gebruikte methodologie. Andere studies gebruikten een fluorimetrische detectie, die is gebaseerd op een enzym-gekoppelde reactie die zowel vrij cholesterol en cholesterylesters detecteert.
Hier HPTLC en HPLC in combinatie gebruikt om te controleren of MβCD leidt tot een aanzienlijke vermindering van cholesterol zoals ook eerder door Gorudko et al getoond.ss = "xref"> 28. Zij toonden een vermindering van 60% van de cholesterol in neutrofielen met 10 mM MβCD. Bovendien werd een lichte afname van sfingomyeline niveau, maar niet cholesterolesters was detecteerbaar in de neutrofielen bij behandeling met MβCD (zie Neumann et al. 15). Tegelijkertijd, de uitputting van cholesterol leidt tot de vorming van NET (zie Neumann et al. 15). Deze bevindingen correleren met het verschijnsel dat behandeling van neutrofielen met statines, remmers van 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A (HMG-CoA) reductase, het snelheidsbepalende enzym bij de biosynthese van cholesterol, verhoogt de vorming van NET. Aangezien statine behandeling van neutrofielen vertoont sterker NET inductie vergeleken met MβCD behandeling (zie Neumann et al. 15 en Chow et al. 20) extra effecten van statines bijvoorbeeld op geprenyleerde membraan-verankerd effector proteins kunnen ook worden betrokken bij de vorming van de netten.
De vorming van NET is een relatief nieuw beschreven gastheer afweermechanisme. Het extracellulaire DNA vezels nu beschreven niet alleen bij zoogdieren 30, 31, maar ook in kippen, vis, garnalen en installaties 32, 33, 34, 35. Na stimulering van neutrofielen met pathogenen of andere stimuli worden NET afgegeven in de extracellulaire ruimte waar ze vangen en eventueel doden binnendringende ziekteverwekkers 36. Het bestuderen van de lipide samenstelling van een geactiveerde neutrofielen kan helpen om de cellulaire mechanismen bemiddelen zijn antimicrobiële werking te begrijpen. Aangezien we enkel de totale lipide niveau van de neutrofielen gemeten, moet nog worden bepaald hoe de lipidegehalte verschillend en wordt beïnvloed door MβCD in volledige cellen versus plasma membranen en bij verschillende membraan microdomeinen. Dit vereist echter specifieke procedures membraanscheiding zoals eerder beschreven (Xu et al.). 37
Daarnaast chromatine, menselijke NET bevatten verscheidene neutrofiel eiwitten, zoals MPO; elastase, het antimicrobiële peptide LL-37; of calgranuline 17, 36. Uit recent onderzoek is sterk gericht op de rol van die specifieke eiwitten en morfologische veranderingen, die initiëren en de vorming van NET 15, 38, 39 te vergemakkelijken. Echter, tot nu toe, is er slechts beperkte kennis over het belang van bepaalde lipiden tijdens dit proces 15, 20. Daarom is dit een bijzonder interessant gebied om ontdekt te worden in meer detail in de toekomst. Tenslotte kennis lipidemembraan modificatieszou kunnen dienen als basis voor therapeutische benaderingen van het immuunsysteem tegen infecties. Als voorbeeld werd aangetoond dat de uitputting van cholesterol zou kunnen helpen in de strijd tegen antibiotica-resistente pathogenen zoals H. pylori, omdat werd aangetoond dat cholesterol verhoogt de weerstand van die bugs tegen antibiotica en antimicrobiële peptiden 40. Vergelijkbare studies kunnen nuttig voor het begrip van gastheer-pathogeen interacties met verschillende bacteriesoorten zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een beurs van de Akademie für Tiergesundheit (HvH) en een beurs van het promotietraject, "Animal and zoönotische infecties," van de Universiteit van Diergeneeskunde, Hannover, Duitsland, verstrekt aan Ariane Neumann.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
