Summary
Lipidler hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Burada, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması için HPTLC ve HPLC birlikte kullanarak, kolesterol seviyesi üzerinde durularak, nötrofillerin lipit bileşimini belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) tarafından gerçekleştirilen Lipit analizi lipid geniş bir analiz nispeten basit ve maliyet-etkin bir yöntemdir. (Evsahibi-patojen etkileşimlerinin ya da konakçı girişinde, örneğin) lipidlerin fonksiyonu hücresel süreçlerde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir. Burada, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile karşılaştırıldığında HPTLC ile birincil kan türevi nötrofil kolesterol seviyesi, odaklanarak, lipid bileşimin belirlenmesi için bir yöntem göstermektedir. Amaç nötrofil hücre dışı tuzakları (NET) oluşumunda lipit / kolesterol değişikliklerin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. NET salma konakçı içinde yayılmasını patojenlerin önlenmesinde bir konakçı savunma mekanizması olarak da bilinir. Bu nedenle, kan-türevi insan nötrofil hücrelerde lipid değişiklikleri indükleme metil-β-siklodekstrin (MβCD) ile muamele edildi. HPTLC ve HPLC kullanarak, hücrelerin MβCD tedavi lipid yol açtığını göstermiştirHücrenin kolesterol içeriğinde önemli bir azalma ile ilişkili değişiklikler. mikroskobik inceleme ile gösterildiği gibi aynı zamanda, nötrofillerin MβCD tedavisi, NET'ler oluşumuna yol açtı. Özetle, burada lipit nötrofillerin de değiştirmiş ve NET'ler oluşumunu incelemek için detaylı bir yöntem mevcut.
Introduction
Lipidler, hücre homeostazı, hücre ölümü, konukçu-patojen etkileşimlerine ve sitokin salınımı 1 'de önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Zamanla,-konak ilişkilerinin veya inflamasyon lipitlerin etkisi hakkında faiz ve bilgi artmıştır ve çeşitli yayınlar hücresel yanıtlarda bazı lipidlerin merkezi bir rol, özellikle steroid kolesterol, teyit etmektedir. 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A-redüktaz engelleyerek kolesterol biyosentezi inhibitörleri olarak kullanılan statinlerin, farmakolojik tedavi (HMG-CoA-redüktaz), interlökin serum seviyelerinin düşürülmesi ile olduğu gibi, anti-inflamatuar ajanlar olarak hareket edebilmeleri 6 ve C-reaktif protein 2. Kolesterin ve glikosfingolipid zenginleştirilmiş yapıları, ev sahibi 3, 4, 5 içine bir geçit olarak, bakteri ve virüs gibi çeşitli patojenleri tarafından kullanılabilirclass = "xref"> 6. (Örneğin, sfingomiyelin) gösterilmiştir sfingolipitler kendi patojenik 7 desteklemek için patojenler tarafından kullanılır. makrofajlar olarak, mikobakteri kullanımı hücrelerine girmesi için etki kolesterol ile zenginleştirilmiş; kolesterol tükenmesi mikobakteri alımını 8 engeller. Bundan başka, Francisella tularensis, (tavşan ateş olarak da bilinir) tularemi sorumlu zoonotik madde 9, makrofajların enfeksiyon kolesterol membranları 10 tükendiği zaman kaldırılmış bir enfeksiyon yol açtı. Benzer bir şekilde, lipid bakımından zengin yapılar ile Escherichia coli konakçı hücrelerin istilası kolesterol bağımlı 4 olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, epitel hücrelerinin, Salmonella typhimurium enfeksiyon deneyleri kolesterol hücreleri 11 içine patojen giriş için gerekli olduğunu göstermiştir. Kolesterol tükenmesi inhibitör yönde etkiSalmonella 11 d alımı. Ayrıca, Gilk ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. Kolesterol Coxiella burnetti 12 alımında önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Buna ek olarak, Tuong ve diğ. 25-hidroksikolesterol lipopolisakarit (LPS) tarafından fagositosis çok önemli bir rol oynadığı bulunmuştur makrofajlar 13 ile uyarılmış. Makrofajlar farmakolojik olarak kolesterol 14 tüketmek için tedavi edildi fagositoz düşürülmüştür. Böylece, kolesterol ve diğer lipidler kendi tükenmesi birçok patojenler 10, 11, 12 ila istilası riskini azaltabilir, çünkü enfeksiyon ve enflamasyon önemli bir rol oynamaktadır.
Son zamanlarda, nötrofil extracellula oluşumunu, yani lipid değişiklikleri, hücreden kolesterol özellikle tüketilmesi göstermektedir uyarabilirİnsan kan türevi nötrofil 15 r trans (NET). 2004 yılında NET'ler keşfinden beri, bunlar bakteri tuzak kritik roller oynadığı gösterilmiştir ve bu nedenle enfeksiyon 16, 17 yayılmasını engelleyen içinde edilmiştir. NET'ler histonlar, proteazlar ve antimikrobiyal peptitler 16 ile bağlantılı bir DNA omurgasından oluşur. Nötrofiller tarafından NET'ler salım, forbol-miristat-asetat (PMA) veya 16 statinler, 20 patojenleri 18, 19 ve kimyasal madde işgal tarafından indüklenebilir. Bununla birlikte, detaylı hücresel mekanizmalar, ve bu işlem lipidlerin özellikle rolü, yine de, tamamen açık değildir. lipidlerin analizi bu tür NET'ler sürümü olarak hücresel süreçleri ve etkileşimleri, çeşitli karışan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. Cholesterol ve sfingomiyelin ve istikrar ekleyin ve protein göçünü ve olayları 21 sinyal yer alan proteinlerin kümelenme kolaylaştırmak hücre zarı ve lipit mikro bölgeleri, hayati bir bileşenidir. Bu tür siklik oligosakarit metil-β-siklodekstrin (MβCD) gibi bazı lipid, amfifilik farmakolojik maddeler, mekanistik rolünü araştırmak için, bir hücrenin lipit bileşimini değiştirmek için ve in vitro 15 kolesterolü düşürmek için kullanılabilir. Burada, MβCD yanıt olarak nötrofillerin lipid bileşiminin analiz edilmesi için HPTLC kullanmak için bir yöntem sunulmaktadır. HPLC nötrofil popülasyonunda kolesterol seviyesini onaylamak için kullanılmıştır. Ayrıca, MβCD yanıt olarak insan kan türevi nötrofillerde mikroskobi ile NET'ler oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem tarif eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde periferik kan toplama yerel insan araştırma etik komisyon tarafından onaylanmıştır. Bütün insan denekler yazılı bilgilendirilmiş onam sağladı.
Yoğunluk gradyan santrifüjü ile İnsan Kan türevi nötrofil 1. izolasyonu
- İnsan kan türevi nötrofil izolasyonu
- Katman ~ bir alev yakın ve karıştırma olmadan sodyum diatrizoate / dekstran çözeltisinin 20 mL üzerine 20 ml kan.
- Frensiz 470 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj.
- mononükleer hücreler ve sarımsı plazma katmanı kaldırın. (; Şekiller 1 ve 2 hücreleri biriken ikinci faz), yeni bir 50 ml tüp içine ve 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 50 mL doldurmak polimorfonükleer hücreleri (PMN) faz transfer.
- fren 470 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
- Süpernatantı ve steril 5 mL su fo peletR5 s, eritrositleri lizise uğratmak üzere.
- Hemen 470 x g'de 10 dakika boyunca 50 1 x PBS ile mL santrifüj kadar doldurun.
- süpernatantı. pelet beyaz olmalıdır. Hala kırmızıysa, tekrar 1.1.5 ve 1.1.6 adımları tekrarlayın.
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında, 1000 uL pelletini. bir ışık mikroskobu altında bir hemositometrede tripan mavi boya kullanılarak hücre sayısı.
- 2 x 10 6 / mL'lik bir konsantrasyonda RPMI, bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Yaklaşık olarak 2.5 x 10 7, nötrofiller kan 20 mL hasat edilebilir.
- Lipit analizi için nötrofillerin farmakolojik tedavisi
- Adım 1.1.9, 5 x 10 7 hücre kullanın. 1.5 ml bir reaksiyon tüpü içerisinde 300 uL toplam hacim içinde 10 mM MβCD veya 25 nM PMA varlığında ya da yokluğunda, saf Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), ortam içinde hücrelerin sayısını ayarlayın.
- örnekleri inkübe37 ° C'de 2 saat ve% 5 CO2 için reaksiyon tüpleri.
- fren 470 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
- Süpernatantı ve HBSS 300 uL hücre pelletini.
- fren 470 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
- 10 kez ve dışarı 1 ml şırınga içine örnek emerek, bir 26-G kanülle homojenize ve -20 ° C'de örnekleri saklamak (1: 1) kloroform / metanol 1 mL hücre pelletini.
- Immünofloresans ile NET ölçümü için nötrofillerin Farmakolojik tedavi
- Hazırlama cam kapak ile 48 oyuklu plakalar, poli-L-lizin kaplı.
- , Her bir göze bir 8 mm cam lamel steril% 0.01 Poli-L-Lizin 55 uL ekleyin ve ~ boyunca oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edilir.
- 1x PBS 200 uL iki kez yıkayın. gerekene kadar bir buzdolabı içinde oyuk başına 1 x 200 ul PBS ile plakaları saklayın.
- arabaefully her lamel merkezinde oyuk başına aşama 1.1.9 hücre süspansiyonu (2 x 10 5/100 uL), 100 uL ilave edin.
- Son 10 mM MβCD veya son 25 nM PMA ya oyuk başına 100 uL ekleyin.
- Frenli 370 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- 37 ° C'de 2 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
- Frenli 370 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- % 4, 155 uL PFA hücreleri saptamak plastik parafin film sarılmasıdır ve 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 10 dakika süre ile bir gece boyunca muhafaza edin.
Not: MβCD ile indüklenen NET oluşumu veriler için, Neumann ve diğ. 15.
- Hazırlama cam kapak ile 48 oyuklu plakalar, poli-L-lizin kaplı.
2. lipid izolasyonu ve İnsan Kan türevi nötrofilleri analizi
- Bligh ve Dyer 22 ve Brogden ve arkadaşları göre insan periferal kandan alınan nötrofil lipitleri izole edin. 23
- Buz üzerinde, bir politetrafloroetilen (PTFE) contalı bir 15 mL vida kapaklı bir cam tüpe (metanol ve kloroform çözeltisi içinde mevcut olan) nötrofilleri pipet ve 1 dakika süre ile çalkalanarak bunları homojenleştirin. plastik yüzeylere bağlanma lipitleri önlemek için cam tüpler kullanın. Kullanım PTFE kauçuk / plastik kirlenmeyi önlemek için kapatılabilir.
- 2 ml metanol ekle 1 mL kloroform ile 1 dakika sonra takip etti. 1 dakika süre ile çalkalanır.
- Cam oda sıcaklığında boruları ve 30 dakika için 50 rpm'de döndürün.
- 7 ° C 'de çözeltisi ve 10 dakika boyunca 1,952 x g'de santrifüj ile protein fraksiyonu pelet.
- Dikkatle arkasında protein içeren topak bırakarak, yeni bir 15 mL glass vida kapaklı bir tüp içine süpernatant süzün. Gelecekteki ölçümü için -20 ° C'de pelet saklayın.
- Kloroform solüsyonu 1 mL 1 dakika bekleyin, iki kez damıtılmış suyun 1 mL ekleyin ve 30 s için numune ile cam vida kapaklı tüp ters.
- Eğer gerekirse, adım 2.1.8 tekrarlayarak bir seçime bağlı daha ileri saflaştırma adımı gerçekleştirmek.
- 60 ° C'de bir vakum konsantratör örnekleri kurutun ve gerekene kadar -20 ° C'de saklayın.
- Aşağıdaki dört çalışma çözeltileri ve renklendirme çözeltisi hazırlayın.
- Çözelti 1: etil asetat (% 26.6), 1-propanol (26.6%), kloroform (% 26.6), metanol (% 26.6), ve potasyum klorid (% 9.6) karıştırın. HPLC kalitesi 100 mL su içinde KCI 0.25 g çözülmesiyle KCI hazırlayın.
- Çözelti 2: n-heksan (% 73), dietil eter (% 23) ve sitrik asit (% 2) karıştırın.
- Çözelti 3: 100%, n-heksan.
- ile boyama çözeltisi hazırlayınbakır sülfat 7.5 g damıtılmış su (90 mL) karıştırarak ve daha sonra fosforik asit, 10 ml.
- Ayrı bir cam bölme her bir çözeltinin 5 mm'ye kadar doldurun. Her odasında çalışan hızını artırmak için filtre kağıdı her türlü ekleyin.
- çalışma çözeltisi plakasının üst ulaşana kadar birincil hareket çözeltisi içinde bir 20 x 10 cm HPTLC silika jel 60, cam plaka önceden inkübe edin. Daha sonra 110 ° C'de 10 dakika süre ile kurutulur.
NOT: Bu plakalar alüminyum folyo içinde daha sonra kullanmak için saklanabilir ve kullanımdan önce, 110 ° C'de 10 dakika boyunca kurutulabilir. - (1: 1) kloroform / metanol 200 uL adım 2.1.10 elde edilen lipit pelet çözülür çözeltisi ve çözünmesi için 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
- Bir cetvel numune istenen sayıda yükleme yeri işaretlemek için yumuşak bir kalem, artı en azından bir standart kullanır. Mark çalışma mesafesi yaklaşık 4 cm, sırasıyla birinci ve ikinci çalışma çözeltisi, 6 cm.
- örnekleri yüklemek için, kloroform / metanol içinde 10 uL şırıngayı 3 kere yıkayın (1: 1) Daha önce, her yeni bir numune yükleme için. Yük mümkün olduğu kadar küçük bir alana örnek konsantre olmaya çalışıyorum her bir örnek açılan bilge 10 uL. Örnekler, iki kopya halinde en azından yüklenmelidir.
- çözeltisi 1 (adım 2.2.1.1) çalışan birinci odaya dikey plaka koyun. plakası düzgün bir geçiş hızı elde etmek için camlı odanın duvarına paralel olduğundan emin olun.
- Çözücü çizgisi ilk işareti ulaştığında, plaka kaldırmak kurutun ve ikinci çözeltinin içine koyun. İkinci ve üçüncü çalışma çözeltileri benzer adımlar tekrar; Çözücü ön plakanın üst ulaşana kadar, çözelti içinde plaka bırakın, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında kaldırmak ve kurutun.
- 7 sn için bakır sülfat çözeltisi içinde plaka koyun. iyice kuruması, plaka çıkarın ve 170 ° C 'de, 7 dakika için bir fırın içinde pişirmeye. Plaka soğumasını bekleyin.
- using, ince tabaka kromatografisi ve jel analizi yazılımı, hem de bir görüntü işleme yazılımı, tarama ve Brogden ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi analiz edin. 23.
- 5 um / 4.6 mm muhafaza kartuşu, 100 x 4.6 mm kolon takın ve 32 ° C'ye ısıtın. Her bir örnek içinde kolesterol miktarını ölçmek için 65 bar altındaki 1 ml / dakikalık bir akış oranı ve 202 nm'de bir UV detektör ölçme mobil faz olarak metanol kullanın.
- pompa, temizleme iğne yıkama, kap durulama, şırınga temizleme ve pompa tasfiye yıkama: örneklerin analiz aşağıdaki adımları gerçekleştirmek üzere önce iyice HPLC makinesi yıkayın. Su ile bütün yıkayın. Son olarak, 5 dakika boyunca 5 ml / dk'lık bir akış oranında, metanol ile bir sistem temizliği gerçekleştirmek.
- bir kolesterol standart bir eğri oluşturmak için, değişen en az 4 konsantrasyonları hazırlandı0.05 mg / ml ila 2 mg / ml kloroform / metanol içinde kolesterol (1: 1) 24.
- kloroform / metanol 500 uL adım 2.1.10 elde edilen numuneler yeniden süspanse edin (1: 1), vidalı kapaklı bir kırmızı PTFE / beyaz silikon kapaklı amber renkli 1.5 mL glass şişe içinde.
- Adım 2.3.3 hazırlanan standart kullanılarak kolesterol konsantrasyonları ölçmek.
Not: numune, ardından en az bir standart ve negatif kontrol ile başlayarak, örnekleme protokolü doldurun. - eğri altında kalan alan olarak sonuçları ifade ve herhangi bir istatistiksel yazılım kullanılarak uygun örnekler arasında karşılaştırma.
Not: Sonuçlar, aynı zamanda, standart bir eğriye karşı tayin edilebilir ve total kolesterol mL başına miktar, g, veya hücre sayısı olarak gösterilebilir. Standart eğri, denklem aşama 2.3.3 'de elde edilen değerler kullanılarak hesaplanır.
NET'ler 3. Görselleştirme ve
- VisNET'ler ualization
Not: NET'ler görselleştirme Neumann ve ark, daha önceden yayınlanmış çalışmanın dayanır. 15.- 1x PBS 200 uL aşama 1.3.8 3 kez sabit örnekleri yıkayın.
- Blok ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca oyuk başına PBS içinde% 2 BSA, 100 uL,% 0.2 Triton X-100 ile geçirgenliği.
- Primer antikor, 100 ul ekle fare monoklonal anti DNA histon 1-antikor (2.2 mg stok seyreltik / ml 1: PBS,% 2 BSA ve% 0.2 ihtiva eden 5.000 Triton X-100) veya miyeloperoksidaz karşı poliklonal antikor (MPO; tavşan anti-MPO; 1 seyreltin: 300 PBS,% 2 BSA ve% 0.2 Triton X-100) ihtiva eden. 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- 1x PBS 200 uL 3 kez yıkayın.
- ikincil antikor, 100 uL ekleyin (1; floresan-etiketli keçi anti-fare: BSA-PBS-Triton X-100 ve keçi anti-tavşan 1000; 1: 1,000 BSA-PBS-Triton X-100) 1 saatte için karanlıkta RT.
- 200 & # 3 kez yıkayın181; 1x PBS L.
- cımbız kullanarak lamelleri çıkarın ve onları cam slaytlar DAPI içeren montaj orta 3 mcL ile aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Bir HCX PL APO 40X, 0.75-1.25 yağ batırma objektifi 15 ile donatılmış bir eş odaklı ters-baz floresan mikroskobu kullanarak örnekleri inceleyin.
- NET salan çekirdeklerin kantifikasyonu
- Bir görüntü işleme yazılımı (örneğin ImageJ) ve sürükle açın ve alet çubuğuna ilgi resmini bırakın.
- "Eklentiler", "Analiz" ve "Hücre tezgahın üzerine tıklayın."
- Sayaç penceresinde "Başlat" butonuna basın ve bir karşı türü seçin (Şekil görüntülenen olarak örneğin, sigara bırakma hücreler için sarı 8 NET salan hücreler için kırmızı 7 tıklayıp 6B-ı ve ıı).
NOT: NET-pozitif hücreler için kriterleri: Olumlu lekeli yeşil çekirdek + daha az yoğun nucleus (lobulasyonu kaybı) veya çekirdeğin yuvarlak şekli + çekirdeğin artan bir boyutu veya dışı ateş belirgin bir hücre dışı bir olayda kaybı. - Yukarıdaki kriterlere her hücre yapışmasının tıklayın ve bir analiz yazılımı veri tabaka halinde sayılan hücre sayısı mal.
- NET salan ve non-salgılayan hücrelerin sayılan hücre sayıları NET-salgılayan hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan kan türevi nötrofilleri dansite gradyanlı santrifugasyon (Şekil 2) ile izole edilmiştir. nötrofiller üzerinde lipit değişikliklerin etkisini incelemek için hücreler, hücreden kolesterol tüketen 10 mM MβCD, ile tedavi edildi. Brogden ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi Daha sonra, lipitler, Bligh ve Dyer (Şekil 1, sol panel) ile örneklerinden izole edilmiştir. 23. hazırlanmış lipid örnekleri ayrılması ve kolesterol, kolesterol esterleri, sfingomiyelin, fosfolipidler ve triasilgliseritler, serbest yağ asitleri de dahil olmak üzere bir lipit geniş, görselleştirmek için optimize edilmiş üç çözelti protokolü kullanılarak silis jel HPTLC plakaları ve çalışma üzerine yüklendi , monoasilgliserol, fosfatidiletanolamin, kardiyolipin, fosfatidilserin ve fosfatidilkolin (Şekil 3A). kolesterol oksijenli türevleri (oksisteroller) ağırlık algılanamazBu yöntem i. Kolesterol ilave bir miktarı, HPLC (Şekil 3B) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HPLC (Şekil 4A) kullanıldığında kolesterol regresyon değeri HPTLC (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde daha iyi oldu. NET'leri görselleştirmek için, hücreler, yukarıda bahsedilen uyaranlara ile uyarılmış sabit ve DNA / histon 1 (yeşil), MPO (kırmızı) ve DNA (mavi) gibi tipik NET belirteçleri (Şekil 5A) için boyandı. Şekil 5A, MPO, DNA / histon 1 açık bir oluşum içinde görüntülenir ve hücreler, 2 saat boyunca 10 mM MβCD ile muamele edildiği zaman, DNA NET'ler sakıncaları vardır. Daha sonra, kolesterol azaltma etkisi, mikroskobik olarak analiz edildi. Bu nedenle, hücreleri DNA (mavi) ve DNA / histon 1 (yeşil) için boyandı ve NET salan çekirdekler görüntü işleme yazılımı ImageJ (Şekil 5B) hücre sayacı eklentisi kullanarak sayıldı. İşlenmemiş nötrofiller spontaneou için bir kontrol olarak görev yaptıNET formasyonu (Şekil 5B-i) s. 10 mM MβCD hücrelerin tedavisi 35.17% NET oluşumu (Şekil 5B) olduğu tespit edildi gösterilen şekilde, kuluçkadan 2 saat sonra muamele edilmemiş nötrofiller NET salım,% 3.89 idi.
Şekil 1: Şematik gösteren insan kan türevi nötrofil lipit bileşimi ve hücre dışı tuzak salınmasının saptanması ilgili adımlar görülecektir. Nötrofiller bir yoğunluk gradyanı kullanılarak izole edilmiş ve lipit değişiklikleri ve NET oluşumunu uyarmak için Metil-β-siklodekstrin (MβCD) ile muamele edilir. Bundan sonra, lipid izole edilmiş ve HPTLC veya HPLC kullanılarak analiz ve NET'ler görüntülenmiştir ve immünofloresans ile nicelendirilir edilir.
Şekil 3: nötrofiller izole lipidlerin HPTLC ve HPLC ile analizi. (A) Standart HPTLC (sol şerit) ile nötrofillerde, bu lipidler tanımlamak için kullanılır. CE: Kolesterol esterleri, TG: Triacylglycerid, FFA: Serbest yağ asitleri, Chol: Kolesterol, MG: monoaçilgliserol PE: Fosfatidiletanolamin, CL: Cardiolipin PS: Fosfatidilserin, PC: Fosfatidilkolin ve SM: Sfingomiyelin. (B), burada tarif edilen HPLC protokolü kullanılarak 4.980 dk 2 mg kolesterol spesifik pik / ml Örnek teşkil eden sonuçları.
Şekil 4: HPLC ve HPTLC kolesterol analiz eder. HPTLC (B) ile ölçüldüğü gibi, HPLC (A), ve bant yoğunluğu ile ölçüldüğü gibi, kolesterol konsantrasyonu ve alan arasındaki ilişkiyi gösteren grafiklerdir. HPLC için minimum tespit sınırı 0.998 N = 3, SEM (A) 'nın, standart eğri için bir regresyon değeri ile, 0.0016 mg / mL idi. 2 mg arasında değişen Kolesterol / mL değeri aşağı 0.05 mg / mL, 0.05 mg / ml N = 3, SEM bir saptama sınırının ile, yarı-nicel HPTLC (B) ile olabilir. HPTLC Standart eğri için regresyon değeri 0.918 olup.
Şekil 5: NET yapılar ve subseq gösteren Örnek floresan mikrograflarıNET kantifikasyonunu uent. 2 saat sonra (ii) MPO (kırmızı), (iii) DNA / histon 1 (yeşil) için boyandı ve (iv) bir DNA (mavi) edildi (A) Nötrofiller, 10 mM MβCD ile uyarılır. (i) paylaşımlı, (ii), (iii) ve (iv). (B) hücreler, (i) HBSS ortamı ya da (ii), 10 mM MβCD ve serbest NET'ler 2 saat daha inkübe edildi çekirdekler (mavi) ve DNA / histon 1 (yeşil) için boyandı. NET-negatif çekirdekler sayaç 8 (sarı) ve net pozitif sayaç 7 (kırmızı) ile çekirdekler ile işaretlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen yöntemler, HPTLC veya HPLC ile kolesterol gibi belirli lipidler, analiz etmek ve NET'ler oluşumu farmakolojik lipit değişikliklerin etkisini incelemek için kullanılabilir (Neumann ve ark., 15).
HPTLC örneklerin çok sayıda lipid geniş bir analiz etmek için nispeten düşük maliyetli ve basit bir yöntemdir. Bu yöntem, antibiyotik miktarının 25, lizozomal depo hastalıkları 26 lipid depolama ve epitel hücreleri 27 kolesterol ve cholesterylglucoside seviyelerinin belirlenmesi de dahil olmak üzere pek çok araştırma alanı, kullanılmıştır. Burada tarif edilen yöntem modifiye edilerek saflaştırılmış nötrofil popülasyonundan lipitleri izole etmek için optimize edilmiş; Bununla birlikte, biraz değiştirilmiş bir versiyonu da doku örneklerinden lipidler (Brogden ve ark. 23) izole etmek için kullanılabilir. Bu buluştu kullanmainşaat işçisi, lipidler de etkili bir şekilde ayrılır, tespit ve bilinen standarda göre yarı-nicel olabilir. başka bir tampon maddesi ya da ortam kullanımı lipit kontaminasyon ve örneklerde spesifik olmayan lipit bantları yol açabileceği için, bu yöntemde kritik bir safha,, ilgili adı tampon kullanımıdır. duyarlılığı HPTLC ile sınırlı olduğu için, HPLC ile saf miktar tayini için daha kesin bir yöntem olarak kullanılmalıdır.
HPLC bilinen bir lipide bir karşılaştırma yapılarak, kolesterol ve çeşitli formları veya türevlerini ölçümü ve tespit edilir. Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, güvenilir bir şekilde, 10 mg / ml (R = 0.990) bir doğrusal oranı kadar olan, 0.0016 mg / ml kolesterol (Şekil 4A) aşağı doğru ölçmek mümkündür. HPTLC yöntemi 0.05 mg / mL kadar kolesterol tespit edilmesini sağlar, fakat bir sigmoid eğrisi ve R bir düşük seviyede bir korelasyon katsayısı = 0.906 (Şekil 4B) ile yıkanmıştır. Daha yüksek hassasiyet ve daha yüksek korelasyon katsayısı dolayısıyla HPLC sonra numuneler arasında küçük farklar tespit sağlayan lipid tam bir kantifikasyonu için, çok üstün bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, her iki yöntem de kombinasyon halinde kullanılabilir; HPTLC lipidler değiştirilebilir içine bir bakış sağlamak için kullanılabilir, ve HPLC ile, belirli bir örnek içinde belli bir lipid farkını ölçmek için daha uygun bir yaklaşım kullanılabilir. Diğerleri 28, 29 ile elde edilen değerlerle bizim ölçümleri karşılaştırıldığında, daha az kolesterol toplam nötrofillerin sayıldı. Bu, kullanılan metodoloji ile açıklanabilir. Diğer çalışmalar, serbest kolesterol ve cholesterylesters hem saptayan bir enzim-bağlı reaksiyonuna dayanan bir florimetrik algılama, kullanmıştır.
Burada, HPTLC HPLC MβCD aynı zamanda, daha önce Gorudko ve diğerleri tarafından gösterilmiştir kolesterol önemli bir azalmaya neden olduğunu doğrulamak için bir arada kullanılır.ss = "xref"> 28. Bu, 10 mM MβCD tarafından nötrofil kolesterolden% 60'lık bir azalma göstermiştir. MβCD ile muamele Ayrıca, sfingomiyelin düzeyinde değil, kolesterol esterleri, hafif bir azalma nötrofiller bulgulanabilmiştir (Neumann ve ark., 15). Aynı zamanda, kolesterol tükenme NET'ler oluşumu (Neumann ve diğ. 15) neden olur. Bu statinlerle nötrofillerin tedavisi, 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A önleyicileri (HMG-CoA) redüktaz, kolesterol biyosentezinde hız sınırlayıcı bir enzim, NET'ler oluşumunu artırır bu olgu ile iyi bir korelasyon bulmak. Nötrofillerin statin tedavisi ile MβCD muamele ile karşılaştırıldığında daha güçlü NET indüksiyon sergiler Ancak, (bkz Neumann ve ark., 15 ve Chow ve diğ. 20), prenillenmiş membran-bağlantılı efektör prote üzerinde, örneğin statinler ilave etkileriins da NET'ler oluşumunda rol oynayabilir.
NET'ler oluşumu nispeten yeni tarif edilen bir ev sahibi savunma mekanizmasıdır. Hücre-dışı DNA lifler artık sadece memelilere 30, 31 tarif edilmiştir ancak, aynı zamanda, tavuk, balık, karides, ve bitki 32, 33, 34, 35. Patojenler veya diğer uyaranlara ile nötrofillerin uyarılması üzerine, NET'ler onlar tuzağa düşürmek ve muhtemelen istila patojenleri 36 öldürmek hücre dışı alanı, içine salınmaktadır. aktive edilmiş bir nötrofil lipid bileşimi incelenmesi antimikrobiyal aktiviteye aracılık eden hücre mekanizmalarının anlaşılması için yardımcı olabilir. Biz nötrofillerin ancak toplam lipid düzeyleri ölçüldü için, bu lipit içeriği nasıl farklı belirlenecek kalır ve plas karşı bütün hücreye MβCD etkilenirma membranlar ve farklı zar mikro alan arasında. Bununla birlikte, bu, daha önce tarif edildiği gibi belirli bir membran ayırma prosedürleri gerektirir (Xu ve ark.). 37
Kromatin yanı sıra, insan ağlar, MPO gibi çeşitli nötrofil proteinleri içerir; elastaz, antimikrobiyal peptit LL-37; veya 17, 36 calgranulin. Son zamanlarda yapılan araştırmalar başlatmak ve NET'lerin 15, 38, 39 oluşumunu kolaylaştıran bu belirli proteinler ve morfolojik değişikliklerin rolü üzerine ağır odaklanmıştır. Ancak, şimdiye kadar, sadece bu sürecin 15, 20 sırasında belirli lipidlerin önemi hakkında bilgi sahibi orada sınırlıdır. Bu nedenle, bu ileride daha ayrıntılı olarak keşfedilmeyi özellikle ilginç bir alandır. lipid membran modifikasyonları ile ilgili son olarak, bilgiTerapötik yaklaşımlar enfeksiyonlarına karşı bağışıklık sistemini güçlendirmek için bir temel olarak hizmet edebilir. Kolesterol antibiyotik ve antimikrobiyal peptitlerin 40 karşı olan böcek direncini arttırdığı gösterilmiştir çünkü örnek olarak, bu kolesterol tükenmesi örneğin H. pylori gibi antibiyotik dirençli patojenlerin mücadelede yardımcı olabilir gösterilmiştir. Benzer çalışmalar farklı bakteri türleri ile konak-patojen anlamak için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ariane Neumann sağlanan Veterinerlik, Hannover, Almanya Üniversitesi, "Hayvan ve Zoonotik Enfeksiyonlar" Akademie für Tiergesundheit (AFT) ve doktora programı, bir burs bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
