Summary
Los lípidos se sabe que juegan un papel importante en las funciones celulares. A continuación, describimos un método para determinar la composición lipídica de los neutrófilos, con énfasis en el nivel de colesterol, mediante el uso de ambos HPTLC y HPLC para obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de la formación trampa extracelular de neutrófilos.
Abstract
Análisis de lípidos realizado por cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) es un método relativamente simple y rentable de análisis de una amplia gama de lípidos. La función de los lípidos (por ejemplo, en las interacciones huésped-patógeno o entrada de host) se ha informado a desempeñar un papel crucial en los procesos celulares. Aquí, se muestra un método para determinar la composición de los lípidos, con un enfoque en el nivel de colesterol de neutrófilos derivados de la sangre primarias, por HPTLC en comparación con la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El objetivo fue investigar el papel de las alteraciones de lípidos / colesterol en la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). liberación NET se conoce como un mecanismo de defensa del huésped para evitar la propagación de patógenos dentro del huésped. Por lo tanto, los neutrófilos humanos derivados de la sangre se trataron con metil-β-ciclodextrina (MβCD) para inducir alteraciones lipídicas en las células. Usando HPTLC y HPLC, hemos demostrado que el tratamiento MβCD de las células conduce a lípidosalteraciones asociadas con una reducción significativa en el contenido de colesterol de la célula. Al mismo tiempo, el tratamiento MβCD de los neutrófilos condujo a la formación de los TNE, como se muestra por microscopía de inmunofluorescencia. En resumen, aquí presentamos un método detallado para estudiar alteraciones lipídicas en los neutrófilos y la formación de los TNE.
Introduction
Los lípidos han sido demostrado que desempeñan papeles importantes en la homeostasis celular, la muerte celular, las interacciones huésped-patógeno, y la liberación de citoquinas 1. Con el tiempo, el interés y el conocimiento sobre el impacto de los lípidos en interacciones huésped-patógeno o la inflamación se han incrementado, y varias publicaciones confirmar el papel central de ciertos lípidos, especialmente el colesterol esteroide, en las respuestas celulares. El tratamiento farmacológico con estatinas, que se utilizan como inhibidores de la biosíntesis del colesterol mediante el bloqueo de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-reductasa (HMG-CoA-reductasa), puede actuar como agentes anti-inflamatorios mediante la reducción de los niveles séricos de interleucina 6 y la proteína C-reactiva 2. Colesterol y estructuras de glicoesfingolípidos enriquecido puede ser utilizado por varios patógenos, tales como bacterias y virus, tal como una puerta de entrada en el huésped 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Los esfingolípidos (por ejemplo, esfingomielina) se han mostrado para ser utilizados por patógenos para promover su patogenicidad 7. En los macrófagos, el uso de micobacterias dominios para entrar en las células enriquecida en colesterol; un agotamiento de colesterol inhibe la captación micobacteriana 8. Además, la infección de macrófagos con Francisella tularensis, un agente zoonótica responsable de la tularemia (también conocida como fiebre del conejo) 9, condujo a una infección que fue abolida cuando el colesterol se agotó de las membranas 10. Del mismo modo, la invasión de las células huésped por Escherichia coli a través de estructuras ricas en lípidos se demostró que el colesterol dependiente 4. Además, Salmonella typhimurium experimentos de infección de las células epiteliales demostraron que el colesterol es esencial para la entrada de patógenos en las células 11. El colesterol agotamiento inhiben estad la absorción de Salmonella 11. Además, un estudio reciente de Gilk et al. demostró que el colesterol juega un papel importante en la absorción de Coxiella burnetii 12. Además, Tuong et al. encontró que el 25-hidroxicolesterol juega un papel crucial en la fagocitosis por lipopolisacárido (LPS) estimulada por los macrófagos 13. La fagocitosis se redujo cuando los macrófagos fueron tratados farmacológicamente para agotar colesterol 14. Por lo tanto, el colesterol y otros lípidos parecen jugar un papel importante en la infección y la inflamación, ya que su agotamiento puede reducir el riesgo de invasión de varios patógenos 10, 11, 12.
Recientemente, hemos sido capaces de demostrar que las alteraciones lipídicas, especialmente el agotamiento de colesterol a partir de la célula, inducir la formación de extracellula neutrófilostrampas r (TNE) en neutrófilos derivados de sangre humana 15. Desde el descubrimiento de los TNE en 2004, que se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en el atrapamiento bacteriana, y por lo tanto en obstaculizar la propagación de la infección 16, 17. TNE consisten en una cadena principal de ADN asociado con histonas, proteasas, y péptidos antimicrobianos 16. La liberación de las redes por los neutrófilos puede ser inducida por patógenos invasores 18, 19 y sustancias químicas tales como de forbol-miristato-acetato (PMA) o estatinas 16, 20. Sin embargo, los mecanismos celulares detalladas, y especialmente el papel de los lípidos en este proceso, aún no están totalmente claras. El análisis de los lípidos puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos implicados en una amplia variedad de procesos y las interacciones celulares, tales como la liberación de TNE. CholesteLOD y esfingomielina son constituyentes esenciales de la membrana celular y lípidos microdominios, donde se añaden estabilidad y facilitan el agrupamiento de las proteínas implicadas en el tráfico de proteínas y eventos 21 de señalización. Para investigar el papel mecanicista de ciertos lípidos, agentes farmacológicos anfifílicos, tales como el oligosacárido cíclico metil-β-ciclodextrina (MβCD), se puede utilizar para alterar la composición lipídica de una célula y para reducir el colesterol in vitro 15. A continuación, presentamos un método para utilizar HPTLC para analizar la composición de lípidos de los neutrófilos en respuesta a MβCD. HPLC se utilizó para confirmar el nivel de colesterol en la población de neutrófilos. Además, se describe un método para visualizar la formación de los TNE por microscopía de inmunofluorescencia en los neutrófilos derivados de sangre humana en respuesta a MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La colección de la sangre periférica en este protocolo fue aprobado por la comisión local de ética de investigación en humanos. Todos los seres humanos siempre que su consentimiento informado por escrito.
1. Aislamiento de neutrófilos derivados de sangre humana por centrifugación en gradiente de densidad
- Aislamiento de neutrófilos derivados de sangre humana
- ~ Capa de 20 ml de sangre sobre 20 ml de diatrizoato de sodio / solución de dextrano cerca de una llama y sin mezclar.
- Centrifugar durante 30 min a 470 xg sin freno.
- Eliminar las células mononucleares y la capa de plasma de color amarillento. Transferir la fase de células polimorfonucleares (PMN) (segunda fase con la acumulación de células; Figuras 1 y 2) en un nuevo tubo de 50 ml y llenarlo hasta 50 ml con solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS).
- Centrifugar durante 10 min a 470 xg con freno.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 ml de agua estéril FOr 5 s para lisar los eritrocitos.
- Inmediatamente llenar hasta 50 ml con 1 x PBS y centrifugar durante 10 min a 470 x g.
- Eliminar el sobrenadante. El sedimento debe ser blanco. Si todavía es rojo, repita los pasos 1.1.5 y 1.1.6.
- Resuspender el precipitado en 1.000 l de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio. Contar el número de células mediante tinción con azul de tripano en un hemocitómetro bajo un microscopio óptico.
- Preparar una suspensión de células en medio RPMI a una concentración de 2 x 10 6 / ml. Aproximadamente 2,5 x 10 7 neutrófilos se pueden cosechar a partir de 20 ml de sangre.
- El tratamiento farmacológico de los neutrófilos para el análisis de lípidos
- Utilice 5 x 10 7 células de la etapa 1.1.9. Ajustar el número de células en puro salina equilibrada Solution (HBSS) medio Hank's en presencia o ausencia de MβCD mM 10 o 25 nM de PMA en un volumen total de 300! L en un tubo de reacción de 1,5 ml.
- Se incuban las muestras en eltubos de reacción durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- Centrifugar durante 10 min a 470 xg con freno.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 300 l de HBSS.
- Centrifugar durante 10 min a 470 xg con freno.
- Resuspender el sedimento celular en 1 ml de cloroformo / metanol (1: 1), homogeneizarla con una cánula de 26 G por succión la muestra dentro y fuera en una jeringa de 1 ml 10 veces, y almacenar las muestras a -20 ° C.
- El tratamiento farmacológico de los neutrófilos para la cuantificación NET por inmunofluorescencia
- Preparar poli-L-lisina placas de 48 pocillos con cubreobjetos de vidrio.
- Coloque un cubreobjetos de vidrio de 8 mm en cada pocillo, añadir 55 l de estéril 0,01% de poli-L-lisina, y se incuba durante ~ 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavar dos veces con 200? L de 1x PBS. Almacenar las placas con 200? L de 1x PBS por pocillo en un refrigerador hasta que se requiera.
- Cocheefully añadir 100 l de suspensión celular (2 x 10 5/100! l) de la etapa 1.1.9 por pocillo en el centro de cada cubreobjetos.
- Añadir 100! L por pocillo de la MβCD final de 10 mM o la final 25 nM PMA.
- Centrifugar durante 5 minutos a 370 xg con freno.
- Incubar durante 2 h a 37 ° C y 5% de CO2.
- Centrifugar durante 5 minutos a 370 xg con freno.
- Fijar las células con 155 l de PFA al 4%, se envuelven en película de parafina plástico, y almacenarlos durante la noche a 4 ° C o durante 10 min a RT.
NOTA: Para los datos sobre la formación de NET inducida por MβCD, véase Neumann et al. 15.
- Preparar poli-L-lisina placas de 48 pocillos con cubreobjetos de vidrio.
2. Aislamiento de lípidos y análisis de los neutrófilos de sangre humanos derivados
- Aislar los lípidos de los neutrófilos derivados de la sangre periférica humana a base de Bligh y Dyer 22 y Brogden et al. 23
- En el hielo, pipetear los neutrófilos (presentes en metanol y solución de cloroformo) a un tubo de vidrio con tapón de rosca 15 ml con una junta de politetrafluoroetileno (PTFE) y homogeneizar ellos por agitación durante 1 min. Utilice tubos de vidrio para evitar que los lípidos de la unión a las superficies de plástico. Uso PTFE tapas para evitar la contaminación a partir de caucho / plástico.
- Añadir 2 ml de metanol seguido 1 min más tarde por 1 ml de cloroformo. Agitar de nuevo durante 1 min.
- Girar los tubos de vidrio a temperatura ambiente y 50 rpm durante 30 min.
- Se precipitan la fracción de proteína por centrifugación de la solución a 7 ° C y 1.952 xg durante 10 min.
- Con cuidado, decantar el sobrenadante en un nuevo tubo con tapón de rosca 15 mL glass, dejando el sedimento que contiene proteína atrás. Almacenar el sedimento a -20 ° C para el futuro cuantificación.
- Añadir 1 ml de cloroformo, esperar 1 min, añadir 1 ml de agua bidestilada, y se invierte el tubo con tapón de rosca de vidrio con la muestra durante 30 s.
- Si es necesario, realizar una etapa de purificación adicional opcional repitiendo el paso 2.1.8.
- Secar las muestras en un concentrador de vacío a 60 ° C y almacenar a -20 ° C hasta su utilización.
- Preparar los siguientes cuatro soluciones de funcionamiento y solución de tinción.
- Solución 1: Mezclar acetato de etilo (26,6%), 1-propanol (26,6%), cloroformo (26,6%), metanol (26,6%), y cloruro de potasio (9.6%). Preparar KCl disolviendo 0,25 g de KCl en 100 ml de agua calidad HPLC.
- Solución 2: Mezclar n-hexano (73%), éter dietílico (23%), y ácido cítrico (2%).
- Solución 3: 100% de n-hexano.
- Preparar la solución de tinción pormezclando agua destilada (90 ml) con 7,5 g de sulfato de cobre, y a continuación, añadir 10 ml de ácido fosfórico.
- Llenar hasta 5 mm de cada solución en una cámara de vidrio separada. Añadir cualquier tipo de papel de filtro para aumentar la velocidad de paso en cada cámara.
- Pre-incubar una sílice HPTLC placa de vidrio 20 x 10 cm de gel 60 en la primera solución en funcionamiento hasta que la solución funcionamiento alcanza la parte superior de la placa. Luego se seca durante 10 min a 110 ° C.
NOTA: Estas placas se pueden almacenar para uso futuro en papel de aluminio y se secaron durante 10 min a 110 ° C antes de su uso. - Disolver el sedimento lípido obtenido de la etapa 2.1.10 en 200 l de cloroformo / metanol (1: 1) solución e incubar durante 15 min a 37 ° C para disolver.
- Use una regla y un lápiz blando para marcar los puntos de carga para el número deseado de muestras, más al menos un estándar. Marcar el funcionamiento de la distancia a aproximadamente 4 cm y 6 cm para la primera y segunda solución en funcionamiento, respectivamente.
- Para cargar las muestras, se lava la jeringa 10! L 3 veces en cloroformo / metanol (1: 1) antes de cargar cada nueva muestra. Carga de 10 l de cada gota a gota de la muestra, tratando de concentrar la muestra en un área tan pequeña como sea posible. Las muestras deben ser cargados al menos en duplicados.
- Colocar la placa verticalmente en la primera cámara con una solución de 1 (etapa 2.2.1.1) que se ejecuta. Asegúrese de que la placa es paralelo a la pared de la cámara de vidrio para conseguir una velocidad de migración uniforme.
- Una vez que la línea de disolvente ha alcanzado la primera marca, retirar la placa, se seca, y colocarlo en la segunda solución. Repita pasos similares para la segunda y para la tercera soluciones de funcionamiento; dejar la placa en la solución hasta que el frente del disolvente alcanza la parte superior de la placa, a continuación, eliminar y secar a TA durante 1 min.
- Colocar la placa en solución de sulfato de cobre durante 7 s. Retire la placa, se seca a fondo, y se hornea en un horno durante 7 min a 170 ° C. Espere a que la placa se enfríe.
- USIng una cromatografía en capa fina y software de análisis de gel, así como un software de procesamiento de imágenes, escanear y analizan como se ha descrito previamente por Brogden et al. 23.
- Adjuntar una columna de 100 x 4,6 mm a un cartucho mm guardia 5 m / 4.6 y calentar a 32 ° C. Utilice metanol como fase móvil a una velocidad de flujo de 1 ml / min a 65 bar y una medición detector UV a 202 nm para cuantificar la cantidad de colesterol en cada muestra.
- Lavar la máquina de HPLC a fondo antes de analizar las muestras, realizando los pasos siguientes: limpieza de la bomba, el lavado de la aguja, el enjuague de la olla, la purga de la jeringa, y el lavado de la purga de la bomba. Lavar todo con agua. Por último, realizar una purga de sistema con metanol a una velocidad de flujo de 5 ml / min durante 5 min.
- Para establecer una curva estándar de colesterol, preparar al menos 4 concentraciones que vande 0,05 mg / ml a 2 mg / ml de colesterol en cloroformo / metanol (1: 1) 24.
- Resuspender las muestras obtenidas de la etapa 2.1.10 en 500 l de cloroformo / metanol (1: 1) en botellas de vidrio de 1,5 ml de color ámbar con tapa de rosca PTFE rojo / tapas de silicona blanca.
- Cuantificar las concentraciones de colesterol utilizando el estándar preparada en la etapa 2.3.3.
NOTA: Complete el protocolo de muestreo, a partir de al menos un estándar y un control negativo, seguido de las muestras. - Los resultados se expresan como el área bajo la curva y comparar entre muestras apropiadas usando cualquier software estadístico.
Nota: Los resultados también pueden cuantificarse frente a una curva estándar y se pueden mostrar como la cantidad total de colesterol por ml, g, o el número de células. La ecuación de la curva estándar debe ser calculada usando los valores obtenidos en la etapa 2.3.3.
3. visualización y cuantificación de los TNE
- visualization de los TNE
NOTA: La visualización de los TNE se basa en el trabajo publicado previamente por Neumann et al. 15.- Lavar las muestras fijadas de la etapa 1.3.8 3 veces con 200 l de 1x PBS.
- Bloquear y permeabilizar con 100 l de 2% de BSA, 0,2% de Triton X-100 en PBS por pocillo durante 45 min a TA.
- Añadir 100! L de anticuerpos primarios: monoclonal de ratón anti ADN-histona 1-anticuerpo (diluir la solución madre con 2,2 mg / ml 1: 5000 en PBS que contenía 2% de BSA y 0,2% de Triton X-100) o anticuerpo policlonal contra la mieloperoxidasa (MPO; conejo anti-MPO; diluir 1: 300 en PBS que contenía 2% de BSA y 0,2% de Triton X-100). Incubar durante la noche a 4 ° C.
- Lavar 3 veces con 200? L de 1x PBS.
- Añadir 100! L del anticuerpo secundario (marcado con fluorescencia de cabra anti-ratón; 1: 1000 en BSA-PBS-Triton X-100 y de cabra anti-conejo, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) durante 1 h a TA en la oscuridad.
- Lavar 3 veces con 200 & #181; L de 1x PBS.
- Eliminar cubreobjetos con unas pinzas y las colocan boca abajo con 3 l de medio de montaje que contiene DAPI en portaobjetos de vidrio.
- Examine las muestras usando un microscopio de fluorescencia-base invertida confocal equipado con una 0,75-1,25 aceite HCX PL APO 40X objetivo de inmersión 15.
- La cuantificación de los núcleos NET liberadora
- Abrir un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ) y arrastrar y soltar la imagen de interés en la barra de herramientas.
- Haga clic en "plugins", "Analizar" y "contador de células".
- Pulsar el botón "Inicializar" en la ventana del contador y elija un tipo de contador (por ejemplo, hacer clic en 7 en rojo para las células NET-liberación y 8 en amarillo para células no de liberación, como se muestra en la Figura 6B-i y ii).
NOTA: Los criterios para las células NET-positivo: núcleo verde manchado positivamente + un nucleu menos densos (pérdida de lobulación) o una pérdida de la forma redonda del núcleo + un aumento del tamaño del núcleo, o una aparición de una extracelular distinta fuera de disparar. - Haga clic en cada adhesión celular a los criterios anteriores y escribir el número de células contadas en una hoja de datos de un software de análisis.
- Calcular el porcentaje de células NET-liberación usando los números de células contados de células NET-liberación y no de liberación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neutrófilos derivados de sangre humana se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad (Figura 2). Para investigar el efecto de las alteraciones de lípidos sobre los neutrófilos, las células se trataron con MβCD mM 10, que agota el colesterol de la célula. Posteriormente, los lípidos se aislaron de las muestras por Bligh y Dyer (Figura 1, panel izquierdo), como se describe por Brogden et al. 23. Las muestras de lípidos preparadas se cargaron en placas de HPTLC gel de sílice y se ejecutan utilizando un protocolo de tres solución, que ha sido optimizado para separar y visualizar una amplia gama de lípidos, incluyendo el colesterol, ésteres de colesterol, esfingomielina, fosfolípidos, y triacilglicéridos, ácidos grasos libres , monoacilglicerol, fosfatidiletanolamina, cardiolipina, fosfatidilserina, y fosfatidilcolina (Figura 3A). derivados oxigenados de colesterol (Oxisteroles) no son detectables wITH este método. Un análisis cuantitativo adicional de colesterol se realizó utilizando HPLC (Figura 3B). El valor de regresión para el colesterol era notablemente mejor cuando se utiliza HPLC (Figura 4A) en comparación con HPTLC (Figura 4B). Para visualizar las redes, las células se estimularon con los estímulos mencionados anteriormente, se fijaron y se tiñeron para ADN / histona 1 (verde), MPO (rojo), y el ADN (azul) marcadores de red como típicas (Figura 5A). Como se muestra en la Figura 5A, una clara aparición de MPO, ADN / histona 1, y el ADN se produce en las redes cuando las células fueron tratadas con MβCD 10 mM durante 2 h. Posteriormente, el efecto de reducción del colesterol se analizó microscópicamente. Por lo tanto, las células se tiñeron para el ADN (azul) y de ADN / histona 1 (verde), y los núcleos NET-liberación se contaron usando el plugin contador de células de la ImageJ software de procesamiento de imágenes (Figura 5B). neutrófilos tratados sirvieron como control para spontaneous formación NET (Figura 5B-i). En la figura mostrada, la liberación NET en los neutrófilos no tratadas después de 2 h de incubación fue de 3,89%, mientras que el tratamiento de las células con MβCD 10 mM resultó en 35,17% la formación de NET (Figura 5B).
Figura 1: vista esquemática que muestra las etapas implicadas en la determinación de la composición de lípidos y liberación trampa extracelular a partir de neutrófilos derivados de sangre humana. Los neutrófilos se aislaron utilizando un gradiente de densidad y se trataron con metil-β-ciclodextrina (MβCD) para inducir alteraciones de lípidos y la formación de NET. A partir de entonces, los lípidos se aíslan y se analizan mediante el uso de cualquiera de HPTLC o HPLC, y los TNE se visualizan y se cuantificaron por inmunofluorescencia.
Figura 3: HPTLC y HPLC análisis de los lípidos aislados a partir de los neutrófilos. (A) estándar utilizada para identificar los lípidos presentes en los neutrófilos a través de HPTLC (carril izquierdo). CE: Los ésteres de colesterol, TG: Triglicéridos, FFA: ácidos grasos libres, Chol: colesterol, MG: monoacilglicerol, PE: fosfatidiletanolamina, CL: cardiolipina, PS: fosfatidilserina, PC: fosfatidilcolina, y SM: esfingomielina. (B) resultado representativo que muestra un pico de colesterol específico para 2 mg / ml a 4,980 min usando el protocolo de HPLC descrito aquí.
Figura 4: HPLC y HPTLC análisis de colesterol. Gráficos que muestran la relación entre la concentración de colesterol y la zona, según lo medido por HPLC (A), y la intensidad de banda, medido por HPTLC (B). El límite de detección mínimo para HPLC fue de 0,0016 mg / ml, con un valor de regresión para la curva estándar de 0,998 N = 3, SEM (A). El colesterol que van desde 2 mg / ml a 0,05 mg / ml puede ser semi-cuantificado usando HPTLC (B), con un límite de detección mínimo de 0,05 mg / ml N = 3, SEM. El valor de regresión para la curva estándar HPTLC es 0.918.
Figura 5: micrografías de fluorescencia representativas que muestran estructuras de red y subsequente cuantificación NET. (A) Los neutrófilos estimulados con MβCD 10 mM durante 2 h se tiñeron para (ii) MPO (rojo), (iii) ADN / histona 1 (verde), y (iv) ADN (azul). (I) Superposición de (ii), (iii) y (iv). Se incubaron (B) Las células durante 2 h con (i) medio HBSS o (ii) MβCD 10 mM, y las redes liberadas se tiñeron para los núcleos (azul) y de ADN / histona 1 (verde). núcleos NET-negativas fueron marcados con el contador 8 (amarillo) y los núcleos con contador 7 (rojo) NET-positivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los métodos descritos aquí se pueden utilizar para analizar los lípidos específicos, tales como colesterol, por HPTLC o HPLC y para investigar los efectos de alteraciones lipídicas farmacológicos sobre la formación de redes (ver Neumann et al. 15).
HPTLC es un método relativamente rentable y simple para analizar una amplia gama de lípidos en un gran número de muestras. Este método se ha utilizado en muchas áreas de investigación, incluyendo la cuantificación antibiótico 25, el almacenamiento de lípidos en enfermedades de almacenamiento lisosomal 26, y la determinación de los niveles de colesterol y cholesterylglucoside en las células epiteliales 27. El método aquí descrito se modificó y optimizado para aislar lípidos de una población de neutrófilos purificados; sin embargo, una versión ligeramente modificada también se puede utilizar para aislar lípidos de muestras de tejido (véase Brogden et al. 23). El uso de este se reunióhod, los lípidos también se pueden separar de manera efectiva, identificados, y semi-cuantificados contra un estándar conocido. Un paso crítico en este método es el uso de la respectiva búfer llamado, ya que el uso de cualquier otro tampón o medio puede conducir a la contaminación de lípidos y bandas de lípidos no específicos en las muestras. Dado que la sensibilidad está limitada con HPTLC, HPLC se debe utilizar como un método más preciso para la cuantificación absoluta.
HPLC facilita la cuantificación e identificación de colesterol y sus diversas formas o derivados mediante la realización de una comparación a un lípido conocido. Al utilizar el protocolo descrito anteriormente, es posible cuantificar de manera fiable hasta 0,0016 mg / ml de colesterol (Figura 4A), con una relación lineal hasta 10 mg / ml (R = 0,990). El método permite la detección HPTLC colesterol abajo a 0,05 mg / ml, pero con una curva sigmoide y un coeficiente de correlación más bajo de R = 0,906 (Figura 4B). La mayor sensibilidad y mayor correlación así coeficiente hace HPLC un método muy superior para la cuantificación exacta de los lípidos, lo que permite posteriormente diferencias más pequeños entre las muestras a ser detectados. Sin embargo, ambos métodos se pueden utilizar en combinación; HPTLC se puede utilizar para obtener una visión general en la que se pueden alterar los lípidos, y HPLC puede ser usado en un enfoque más específico para cuantificar la diferencia de un lípido específico en una muestra dada. Al comparar nuestras mediciones con los valores obtenidos por otros 28, 29, menos colesterol se cuantificó en los neutrófilos totales. Esto podría explicarse por la metodología utilizada. Otros estudios utilizaron una detección fluorimétrica, que se basa en una reacción enzimática acoplada que detecta tanto el colesterol y cholesterylesters libre.
Aquí, HPTLC y HPLC se utilizan en combinación para verificar que MβCD conduce a una reducción significativa de colesterol como también se muestra anteriormente por Gorudko et al.ss = "xref"> 28. Ellos demostraron una reducción del 60% de colesterol en los neutrófilos por MβCD 10 mM. Además, una ligera reducción del nivel de esfingomielina pero no ésteres de colesterol era detectable en los neutrófilos cuando se tratan con MβCD (véase Neumann et al. 15). Al mismo tiempo, el agotamiento de colesterol conduce a la formación de los TNE (véase Neumann et al. 15). Estos hallazgos se correlacionan bien con el fenómeno de que el tratamiento de neutrófilos con estatinas, inhibidores de la 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de colesterol, aumenta la formación de TNE. Sin embargo, ya que el tratamiento con estatinas de neutrófilos exhibe fuerte inducción NET comparación con el tratamiento MβCD (véase Neumann et al. 15 y Chow et al. 20), los efectos adicionales de las estatinas, por ejemplo sobre prenylated prote efectora anclada a la membranains también podría estar involucrado en la formación de los TNE.
La formación de los TNE es relativamente un nuevo mecanismo de defensa del huésped descrita. Las fibras de ADN extracelular ahora se han descrito no sólo en los mamíferos 30, 31, sino también en pollo, pescado, camarones, y las plantas 32, 33, 34, 35. Tras la estimulación de los neutrófilos con agentes patógenos u otros estímulos, redes se liberan en el espacio extracelular, donde se atrapan y posiblemente matan patógenos invasores 36. El estudio de la composición de lípidos de un neutrófilo activado puede ayudar a comprender los mecanismos celulares que median su actividad antimicrobiana. Desde que mide sólo el nivel de lípidos totales de los neutrófilos, lo que queda por determinar cómo difiere el contenido de lípidos y es afectado por MβCD en células enteras frente plasmembranas mA y entre los diferentes dominios de la membrana micro. Sin embargo, esto requiere procedimientos de separación de membrana específico como se ha descrito previamente (Xu et al.). 37
Además de la cromatina, TNE humanos contienen varias proteínas de neutrófilos, tales como MPO; elastasa, el péptido antimicrobiano LL-37; o calgranulina 17, 36. La investigación reciente se ha centrado en gran medida en el papel de las proteínas específicas y cambios morfológicos, que inician y facilitan la formación de los TNE 15, 38, 39. Sin embargo, hasta el momento, sólo hay conocimiento acerca de la importancia de ciertos lípidos limitado durante este proceso 15, 20. Por lo tanto, esta es una zona particularmente interesante para ser explorado con más detalle en el futuro. Finalmente, el conocimiento sobre las modificaciones de la membrana de lípidospodría servir como base para los enfoques terapéuticos para estimular el sistema inmune contra las infecciones. Como un ejemplo, se ha demostrado que el agotamiento de colesterol podría ayudar en la lucha contra los patógenos resistentes a los antibióticos, tales como H. pylori, ya que se demostró que el colesterol aumenta la resistencia de esos insectos frente a los antibióticos y péptidos antimicrobianos 40. Estudios similares podrían ser útiles para la comprensión de la interacción huésped-patógeno con diferentes especies bacterianas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Akademie für Tiergesundheit (AFT) y una beca del programa de doctorado, "Animal y zoonóticas infecciones", de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Alemania, proporcionado a Ariane Neumann.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
