Summary
지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC)에 의해 수행 지질 지질 분석은 다양한 분석을 비교적 간단하고 비용 효율적인 방법이다. (호스트 병원체 상호 작용 또는 호스트 항목에서 예를 들면) 지질의 기능은 세포 과정에 중요한 역할을하는 것으로보고되고있다. 여기서, 우리는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 비교하여 기본 HPTLC 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준에 초점 지질 조성의 결정 방법을 도시한다. 목표는 호중구 세포 트랩 (그물)의 형성에 지질 / 콜레스테롤 변화의 역할을 알아보고자 하였다. NET 해제는 호스트 내에 병원균 확산을 방지하기 위해 호스트 방어 메커니즘으로 알려져있다. 따라서, 혈액 유래의 인간 호중구 세포 지질 변형을 유도 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)으로 처리 하였다. HPTLC 및 HPLC를 사용하여, 우리는 세포의 MβCD 처리가 지질에 이르게하는 것으로 나타났습니다셀의 콜레스테롤 함량의 상당한 감소와 관련된 변경. 면역 형광 현미경 같이 동시에, 호중구의 MβCD 처리, 그물의 형성되었다. 요약하면, 우리가 지질 호중구의 변경 및 그물의 형성을 연구하는 구체적인 방법을 제시한다.
Introduction
지질은 세포의 항상성, 세포 사멸, 호스트 병원체 상호 작용 및 사이토 카인 릴리스 1에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 시간이 지남에 따라, 호스트 병원체 상호 작용이나 염증 지질의 영향에 대한 관심과 지식이 증가하고, 여러 출판물 세포 반응의 특정 지질의 중심 역할, 특히 스테로이드 콜레스테롤을 확인합니다. 3- 히드 록시 -3- 메틸 - 조효소-A 환원을 차단하여 콜레스테롤 생합성 억제제로 사용되는 스타틴과 약리 치료 (HMG-CoA를 환원)은 인터류킨의 혈중 농도를 낮춤으로써 같은 항염증제를 작동 할 도 6 및 C 반응성 단백질 2. 및 콜레스테롤 - 글리 풍부한 구조는 호스트 (3), (4), (5)에 대한 게이트웨이로서, 세균 및 바이러스와 같은 여러 병원체에 의해 사용될 수있다클래스 = "외부 참조"> 6. (예를 들어, 스 핑고 마이 엘린)가 도시되어 스핑 고리 피드는 병원성 7을 촉진하는 병원균에 의해 사용된다. 대 식세포에서 마이코 박테리아의 사용 세포를 입력하는 도메인을 콜레스테롤이 풍부한; 콜레스테롤의 고갈은 마이코 박테리아 흡수 8을 억제한다. 또한, Francisella 야토 (또한 토끼 열이라고도 함) 야토 병을 담당하는 동물 매개 제 (9)와 대 식세포가 감염 콜레스테롤 멤브레인 (10)로부터 고갈 될 때 폐지되었다 감염되었다. 유사하게, 지질 과다 구조를 통해 대장균에 의한 숙주 세포의 침윤 콜레스테롤 의존 4 것으로 입증되었다. 또한, 상피 세포의 살모넬라 균 감염 실험 콜레스테롤은 세포 (11)에 병원균 항목에 대한 필수적이라는 것을 보여 주었다. 콜레스테롤 고갈 inhibite살모넬라 (11)의 D 섭취. 또한, Gilk 등의 등의 최근 연구. 콜레스테롤은 Coxiella의 burnetti (12)의 흡수에 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 또한, 투옹 등. 25 hydroxycholesterol은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의한 식세포 작용에 중요한 역할을한다는 것을 발견 식세포 (13) 전혈. 대 식세포는 약리학 콜레스테롤 (14)을 고갈 처리했을 때 식균 작용이 감소되었다. 따라서, 콜레스테롤 등의 지질은 고갈 여러 병원균 10, 11, 12에서 침략의 위험을 줄일 수 있기 때문에, 감염과 염증에 중요한 역할을 할 것으로 보인다.
최근에, 우리는 호중구 extracellula의 형성, 즉 지질 변화, 세포에서 콜레스테롤 특히 고갈을 보여 유도 할 수 있었다인간 혈액 유래 호중구 15 R 트랩 (네트). 2004 년에 그물의 발견 때문에, 세균 함정 수사에 중요한 역할을하는 것으로, 따라서 감염 (16), (17)의 확산을 방해에있다. 그물 히스톤, 프로테아제, 및 항균 펩타이드 16와 연관된 DNA 골격 구성. 호중구 그물의 릴리스는 예컨대 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 또는 스타틴 16, 20와 같은 병원균 (18, 19) 및 화학 물질이 침입하여 유도 될 수있다. 그러나, 자세한 세포 메커니즘과이 과정에서 지질 특히 역할은 아직 완전히 명확하지 않다. 지질의 분석은 그물의 출시로 세포 프로세스와 상호 작용의 다양한에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해 될 수 있습니다. CholesteROL과 스 핑고 마이 엘린은 안정성을 추가하고 단백질 인신 매매 및 이벤트 (21) 신호 전달에 관여하는 단백질의 클러스터링을 촉진 세포막과 지질 마이크로 도메인의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 환상 올리고당 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)과 같은 특정 지질 양친되는 약물의 기전 역할을 조사하기 위해, 세포의 지질 성분을 변경하고, 시험관 (15) 콜레스테롤을 감소 시키는데 사용될 수있다. 여기서는 MβCD에 응답 호중구의 지질 조성 분석 HPTLC를 사용하는 방법을 제시한다. HPLC는 호중구 인구 콜레스테롤의 수준을 확인하는 데 사용되었다. 더욱이, 우리는 MβCD에 응답하여 인간 혈액 유래 호중구 면역 형광 현미경으로 그물의 형성을 시각화하는 방법을 설명한다.
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Protocol
이 프로토콜의 말초 혈액의 수집은 지역의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 사람을 대상으로 자신의 동의서를 제공했다.
밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 혈액 유래 호중구 1 격리
- 인간의 혈액 유래 호중구의 분리
- 층 ~ 불꽃 근처 혼합없이 나트륨 diatrizoate / 덱스 트란 용액의 20 mL의 혈액 상을 20㎖.
- 브레이크없이 470 XG에서 30 분 동안 원심 분리기.
- 단핵 세포와 황색 플라즈마 층을 제거한다. (;도 1 및 2 셀을 집적하여 두 번째 단계) 새로운 50ml의 튜브 및 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 50 ㎖로 채워 다형 핵 세포 (PMN)의 위상을 옮긴다.
- 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상등액을 제거하고 멸균 5 ㎖ FO에 펠렛을 재현 탁R 5 초는 적혈구를 용균합니다.
- 즉시 470 X g에서 10 분 동안 50 ㎖의 1X PBS와 원심 분리기까지 채운다.
- 상층 액을 제거합니다. 펠렛은 흰색이어야한다. 여전히 빨간색이면 반복 1.1.5와 1.1.6 단계를 반복합니다.
- 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 매체의 1,000 μL에 펠렛을 재현 탁. 광학 현미경 하에서 혈구에 트리 판 블루 염색법을 이용하여 세포 수를 카운트.
- 2 × 106 / ㎖의 농도로 RPMI에 세포 현탁액을 준비한다. 약 2.5 × 10 7 호중구가 혈액을 20 ㎖에서 수확 될 수있다.
- 지질 분석을위한 호중구의 약리학적인 치료
- 단계 1.1.9에서 5 × 10 7 세포를 사용합니다. 1.5 mL의 반응 관에 300 μL의 총 부피의 10 mM의 MβCD 25 나노 PMA의 존재 또는 부재하에 순수한 Hank's 균형 염 용액 (HBSS) 배지에서 세포 수를 조정한다.
- 에서 샘플을 품어37 ° C에서 2 시간, 5 % CO 2의 반응 튜브.
- 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 HBSS 300 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
- 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 10 시간 및 종료 1 ml 주사기로 시료를 흡인함으로써, 26-G 캐 뉼러로 균질화하고, -20 ° C에서 샘플들을 저장하는 (1) 클로로포름 / 메탄올 1 mL 중 세포 펠렛을 재현 탁.
- 면역에 의해 NET 정량 호중구의 약리학적인 치료
- 준비 커버 글라스로 48 웰 플레이트를 폴리 -L- 라이신이 코팅.
- 각 웰에 한 8 mm 유리 커버 슬립을 배치 멸균 0.01 % 폴리 -L- 라이신의 55 μL를 추가 ~ 실온 (RT)에서 20 분 배양한다.
- 1X PBS 200 μL로 두 번 씻으십시오. 필요한 때까지 냉장고에 잘 당 1X PBS 200 μL와 접시를 저장합니다.
- 차efully 각 커버 슬립의 중심에 웰당 단계 1.1.9에서 세포 현탁액 (2 × 100분의 5 μL) 100 μL를 추가한다.
- 최종 10 mM의 MβCD 또는 최종 25 나노 PMA 중 하나를 잘 당 100 μL를 추가합니다.
- 브레이크 (370) XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 37 ° C에서 2 시간, 5 % CO 2 부화.
- 브레이크 (370) XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 4 %의 155 μL PFA로 세포를 고정 파라핀 플라스틱 필름들을 포장하고, 4 ℃ 또는 실온에서 10 분 동안 밤새 보관.
참고 : MβCD에 의해 유도 NET 형성에 데이터의 경우, 노이만 등의 알을 참조하십시오. 15.
- 준비 커버 글라스로 48 웰 플레이트를 폴리 -L- 라이신이 코팅.
2. 지질 분리 및 인간의 혈액 유래 호중구 분석
- 후 Bligh 및 다이어 22 Brogden 외에 기초하여 인간 말초 혈 유래 호중구로부터 지질을 분리. (23)
- 얼음에서 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)으로 봉합하여 15 ㎖의 스크류 캡 유리관 (메탄올, 클로로포름 용액에 존재) 호중구 피펫 1 분간 흔들어이를 균질화. 플라스틱 표면에 결합로부터 지질을 방지하기 위해, 유리 튜브를 사용한다. 사용 PTFE 고무 / 플라스틱 오염을 방지하기 위해 캡.
- 메탄올 2 mL를 넣고 클로로포름 1 ㎖를 1 분 후에 하였다. 1 분 동안 다시 흔든다.
- 유리 튜브 RT에서 30 분 동안 50 rpm으로 회전.
- 7 ℃에서 용액을 10 분 동안 1,952 XG 원심 분리하여 단백질 분획을 펠렛.
- 조심스럽게 뒤 단백질 함유 펠렛을 떠나, 새로운 15 ML 글래스 나사 캡 튜브에 뜨는을 가만히 따르다. 미래의 정량 -20 ° C에서 펠렛을 저장합니다.
- 클로로포름 1 mL를 넣고 1 분간 기다린 이중 증류수 1 mL를 첨가하고 30 초 동안 샘플 유리 스크류 캡 튜브를 반전.
- 필요한 경우, 단계 2.1.8을 반복하여 임의의 추가 정제 단계를 수행한다.
- 60 ℃에서 진공 농축기에서 샘플을 건조하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관.
- 다음 네 가지 실행 솔루션 및 염색 액을 준비합니다.
- 용액 1 : 에틸 아세테이트 (26.6 %), 1- 프로판올 (26.6 %), 클로로포름 (26.6 %), 메탄올 (26.6 %)과 염화 칼륨 (9.6 %)을 섞는다. HPLC 품질의 물 100 mL에 0.25 g의 KCl을 용해하여 KCl을 준비.
- 용액 2 : n- 헥산 (73 %), 디 에틸 에테르 (23 %) 시트르산 (2 %)을 섞는다.
- 용액을 3 : 100 % n- 헥산.
- 하여 염색 액을 준비황산동 7.5 g에 증류수 (90 ㎖)에 혼합 한 후 인산 10 mL를 첨가.
- 별도의 유리 용기 내의 각각의 용액을 5 mm로 채운다. 각 챔버의 실행 속도를 증가시키기 필터 종이의 종류를 추가합니다.
- 주행 용액 플레이트의 상단에 도달 할 때까지 제 1 실황 용액에 20 × 10cm HPTLC 실리카 겔 60 유리판 사전 부화. 이어서 110 ℃에서 10 분 동안 건조시킨다.
주의 : 이러한 플레이트는 알루미늄 호일에 나중에 사용하기 위해 저장하고 사용하기 전에 110 ℃에서 10 분간 건조시킬 수있다. - 1 : 1의 클로로포름 / 메탄올 200 μL 단계 2.1.10에 의한 지질 펠릿 녹인 용액을 용해하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양한다.
- 통치자와 원하는 샘플 수에 대한로드 지점을 표시하는 부드러운 연필, 플러스 적어도 하나 개의 표준을 사용합니다. 마크 주행 거리가 약 4cm 각각 제 1 및 제 2 주행 용액 용 6cm.
- 샘플을 로딩하기 위해, 클로로포름 / 메탄올 10 μL 주사기 3 회 반복한다 (1 : 1)에 앞서 각각의 새로운 샘플을 로딩한다. 로드 가능한 작은 영역에 샘플을 농축하려는 각각의 샘플 적가 10 μL. 샘플은 중복 적어도로드해야합니다.
- 용액 1 (단계 2.2.1.1)을 실행하여 상기 제 1 챔버로 수직 플레이트를 놓는다. 플레이트를 일정한 이동 속도를 달성하기 위해 유리 챔버의 벽에 평행인지 확인.
- 용매 라인이 제 1 마크에 도달하면, 상기 플레이트를 제거하여 건조하고, 제 2 용액에 배치. 두 번째 및 세 번째 실행 솔루션에 대한 유사한 단계를 반복; 용매를 전면 판의 상부에 도달 할 때까지, 상기 용액에두고 판을 1 분 동안 RT에서 제거하고 건조.
- 7 초 동안 황산동 용액 플레이트를 놓는다. 철저하게 건조, 플레이트를 제거하고, 170 ℃에서 7 분간 오븐에서 굽는다. 플레이트가 식을 때까지 기다리십시오.
- USING 박층 크로마토 그래피 및 겔 분석 소프트웨어뿐만 아니라, 화상 처리 소프트웨어는, 스캔 Brogden 등에 의해 전술 한 바와 같이 분석한다. (23).
- 5㎛의 / 4.6 mm 가드 카트리지에 100 × 4.6 mm 칼럼을 연결하고 32 ℃로 가열한다. 각 샘플에서 콜레스테롤의 양을 정량하기 위해 65 바에서 1 mL / 분의 유속, 202 nm에서 UV 검출기로 측정 이동상으로서 메탄올을 사용한다.
- 펌프를 청소 바늘을 세척, 냄비를 세척, 주사기를 정화, 펌프 퍼지 세척 : 샘플을 분석하고 다음 단계를 수행 철저히 전에 HPLC 시스템을 씻으십시오. 물을 모두 씻어. 마지막 5 분 동안 5 ㎖ / min의 유속으로 메탄올 시스템 퍼지를 수행한다.
- 콜레스테롤 표준 곡선을 설정하려면 이르기까지 최소 4 개 농도를 준비0.05 mg 내지 / ㎖로 2 밀리그램 / ㎖의 클로로포름 / 메탄올 콜레스테롤 (1 : 1) 24.
- 클로로포름 / 메탄올 500 μL 단계 2.1.10에서 얻어진 샘플 재현 탁 (1 : 1) 스크류 탑 레드 PTFE / 화이트 실리콘 뚜껑 호박색 1.5 ML 글래스 병이다.
- 단계 2.3.3에서 제조 한 표준을 사용하여 콜레스테롤 농도를 정량화.
참고 : 샘플 다음에 적어도 표준 하나는 음성 대조군을 시작으로 샘플링 프로토콜을 입력합니다. - 곡선 아래의 면적으로서 표현 결과 및 통계 소프트웨어를 사용하여 적절한 샘플 간의 비교.
주 : 결과는 표준 곡선에 대해 정량화 될 수 있고, 총 콜레스테롤 mL의 양, g, 또는 세포의 숫자로 표시 될 수있다. 표준 곡선의 방정식은 단계 2.3.3에서 얻은 값을 사용하여 계산한다.
그물 3. 시각화 및 정량화
- 마주그물의 ualization
참고 : 뉴저지 네츠의 시각화는 노이만 등으로 이전에 출판 작업을 기반으로한다. 15.- 1X PBS 200 μL와 단계 1.3.8에서 3 회 고정 샘플을 씻는다.
- 블록 및 RT에서 45 분 동안 웰 당 PBS로 2 % BSA 100 μL, 0.2 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면.
- 일차 항체 100 ㎕를 추가 마우스 단일 클론 항 DNA 히스톤 1 항체 (2.2 Mg를 재고 희석 / ㎖ 1 : PBS는 2 % BSA 0.2 %를 함유하는 5,000 트리톤 X-100) 또는 마이 엘 로퍼 옥시 다제에 대한 다 클론 항체 (MPO; 토끼 항 MPO 1 희석 : PBS (300)는 2 % BSA 및 0.2 % 트리톤 X-100)을 함유한다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션.
- 1X PBS 200 μL로 3 회 반복한다.
- 이차 항체의 100 μL 추가 (1 형광 표지 염소 항 마우스 : BSA-PBS - 트리톤 X-100 및 염소 항 - 토끼에 1000을 1 : 1,000 BSA-PBS - 트리톤 X-100) 1 시간에 대한 어둠 속에서 RT.
- 200 & #로 3 회 세척181; 1X PBS의 L.
- 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거하고 유리 슬라이드에 DAPI를 포함하는 설치 매체의 3 μL 내려 놓는다.
- HCX PL APO 40X 0.75 ~ 1.25 오일 침지 대물 (15)를 구비 한 공 초점 반전 계 형광 현미경을 사용하여 샘플을 조사한다.
- 순수한 개방 핵 정량
- 이미지 처리 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에) 드래그를 열고 도구 모음에 관심이 사진을 놓습니다.
- "플러그인", "분석"및 "셀 카운터를 클릭하십시오."
- 대향 창에서 "초기화"버튼을 누르고 이의 종류를 선택 (도에 표시되는 예를 들면, 비 방출 셀 황색 8 NET 개방 셀 레드 7 클릭 6B-I 및 II).
참고 : NET 양성 세포에 대한 기준 : 긍정적으로 얼룩진 녹색 핵 + 덜 조밀 한 nucleuS (분엽 손실) 또는 핵의 원형 + 핵의 증가 된 크기 또는 오프 촬영 뚜렷한 세포의 발생 손실. - 위의 기준에 모든 세포의 부착을 클릭하고 분석 소프트웨어의 데이터 시트로 계산 휴대폰 번호를 작성합니다.
- NET-해제 비 방출 셀 카운트 셀 번호를 사용 NET 분비 세포의 비율을 계산한다.
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Representative Results
인간 혈액 유래 호중구는 밀도 구배 원심 분리 (도 2)에 의해 단리 하였다. 호중구 지질 변화의 영향을 조사하기 위해, 세포를 세포로부터 콜레스테롤을 고갈 된 10 mM MβCD로 처리 하였다. Brogden 등에 의해 기술 된 바와 같이 계속해서, 지질, 및 후 Bligh 다이어 (도 1, 왼쪽 패널)에 의해 샘플로부터 분리 하였다. (23). 준비된 지질 시료를 분리하여 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 스 핑고 미엘린, 인지질 및 triacylglycerides, 유리 지방산을 포함한 리피드의 넓은 범위를 시각화하기 위해 최적화 된 세 용액 프로토콜을 사용하여 실리카 겔 HPTLC 플레이트 및 실행에로드 된 , 모노 아실 글리세롤, 포스파티딜 에탄올 아민, 카디오 리핀, 포스파티딜 세린, 및 포스파티딜콜린 (도 3A). 콜레스테롤 유도체 산소 (옥시 스테롤)을 검출하지 w이 방법은 i 번째. 콜레스테롤의 추가적인 정량적 HPLC 분석은 (도 3B)을 사용 하였다. HPLC (도 4a)을 사용할 때 콜레스테롤 회귀 HPTLC 값 (도 4b)에 비해 현저하게 개선되었다. 그물을 가시화하기 위해, 셀은 상기 자극 자극 고정하고 DNA / 히스톤 1 (녹색), MPO (적색), 그리고 DNA (블루)와 같은 전형적인 NET 마커 (도 5A)에 대해 염색 하였다. 도 5a, MPO, DNA / 히스톤 1 맑은 발생에 표시하고, 세포를 2 시간 동안 10 mM의 MβCD로 처리 할 때 DNA가 그물에서 발생한다. 이어서, 콜레스테롤 저하 효과를 현미경으로 분석 하였다. 따라서, 세포를 DNA (청색) 및 DNA / 히스톤 1 (녹색)에 대한 염색 및 NET 개방 핵 화상 처리 소프트웨어 ImageJ에 (도 5b)에서 셀 카운터 플러그인을 사용하여 계산 하였다. 처리되지 않은 호중구는 spontaneou에 대한 제어 역할을NET 형성 (도 5b-I 형) S. 10 mM의 MβCD와 세포의 치료는 35.17 % NET 형성 (도 5b)의 결과를 표시하는 반면도에서는 배양 2 시간 후 미처리 호중구에서 NET 방출은 3.89 %였다.
도 1 : 도식 보여주는 인간 혈액 유래 호중구에서 지질 조성 및 트랩 외 방출을 결정하는 단계. 호중구는 밀도 구배를 이용하여 분리 및 지질 변경 및 NET 형성을 유도하는 β 메틸 시클로 덱스트린 (MβCD)으로 처리된다. 그 후, 지질 단리 HPTLC 또는 HPLC를 사용하여 분석하고, 그물 시각화 면역 형광에 의해 정량화된다.
그림 3 : 호중구에서 분리 한 지질의 HPTLC 및 HPLC 분석. (A) 표준 HPTLC (좌측 레인)로 호중구에 존재하는 지질을 식별하는 데 사용된다. CE : 콜레스테롤 에스테르, TG : Triacylglycerides, FFA : 무료 지방산, Chol을 : 콜레스테롤, MG : 모노 아실 글리세롤, PE : 포스파티딜, CL : 카디오 리핀, PS : 포스파티딜 세린, PC : 포스파티딜콜린, 및 SM : 스 핑고 마이 엘린. (B)는 여기에 기술 된 HPLC 프로토콜을 사용하여 4.980 분에 2 mg을위한 콜레스테롤 특정 피크 / ㎖를 나타내는 대표적인 결과.
그림 4 : HPLC 및 HPTLC 콜레스테롤의 분석. HPTLC (B)로 측정 한 HPLC (A)와 밴드의 강도에 의해 측정되는, 콜레스테롤 농도와 면적 사이의 관계를 나타내는 그래프. HPLC 최소 검출 한계는 0.998 N = 3, SEM (A)의 표준 곡선 회귀 값, 0.0016 ㎎ / ㎖이었다. 2 mg의 범위 콜레스테롤 / ㎖ 아래로 0.05 mg의 / mL의 0.05 ㎎ / ㎖ N = 3, SEM의 최소 검출 한계와 반 정량 HPTLC (B)를 사용하고있을 수있다. HPTLC 표준 곡선 회귀 값은 0.918이다.
그림 5 : NET 구조와 subseq를 표시하는 대표적인 형광 현미경NET 정량화를 uent. 2 시간 (Ⅱ) MPO (적색), (ⅲ) DNA / 히스톤 1 (녹색)에 대한 염색 및 (ⅳ) DNA (청색) 한 경우 (A) 10 mM의 호중구 MβCD 자극. 의 (ⅰ) 오버레이 (Ⅱ), (Ⅲ) 및 (Ⅳ). (B)가 셀 (I) HBSS 매체 또는 (ⅱ) 10mM의 MβCD 및 해제 그물 2 시간 동안 인큐베이션 하였다는 핵 (파란색)와 DNA / 히스톤 1 (녹색)에 대해 염색 하였다. NET-제외 핵 계수기 8 (황색) 및 NET 양성 카운터 (7) (적색)을 핵으로 표시 하였다.
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Discussion
여기에 설명 된 방법은 HPTLC 또는 HPLC에 의해 콜레스테롤과 같은 특정 지질을 분석하고, 네트의 형성에 약리 지질 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다 (노이만 등. 15 참조).
HPTLC 샘플의 다수의 지질의 광범위한 분석을 비교적 비용 효과적인 간단한 방법이다. 이 방법은 항생제 정량화 25, 리소좀 저장 질환 26 지질 저장소 및 상피 세포에서 콜레스테롤 및 27 cholesterylglucoside 수준의 결정을 포함하여 많은 연구 분야에서 사용되고있다. 여기에 설명 된 방법은 수정 및 정제 호중구 모집단 지질을 분리하기 위해 최적화시켰다 그러나, 약간 수정 된 버전은 또한 조직 샘플에서 지질 (Brogden 외. 23 참조)를 분리하기 위해 사용될 수있다. 이 충족 사용HOD 지질을 효과적으로 분리, 확인, 및 공지 된 표준에 대해 반 - 정량을 할 수있다. 버퍼 또는 임의의 다른 매체를 사용 지질 오염 시료에서 지질 불특정 대역을 초래할 수 있으므로이 방법에서 중요한 단계는 각각의 명명 된 버퍼의 사용이다. 감도 HPTLC으로 한정되기 때문에, HPLC는 절대 정량보다 정확한 방법으로 사용한다.
HPLC 알려진 지질에 대한 비교를 수행하여 콜레스테롤과 다양한 형태 또는 이의 유도체의 정량 및 확인을 용이하게한다. 전술 한 프로토콜을 이용하여, 확실하게 10 ㎎ / ㎖ (R = 0.990)에 대한 비 선형쪽으로, 0.0016 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 (도 4A)까지 정량화 할 수있다. HPTLC 방법은 0.05 ㎎ / ㎖까지 콜레스테롤 검출 할 수 있지만, S 자형 곡선과 R의 낮은 상관 계수 = 0.906 (도 4b)와. 높은 감도와 높은 상관 관계 따라서 계수 HPLC이어서 샘플 사이의 작은 차이를 검출 할 수 지질의 정확한 정량을위한 매우 우수한 방법한다. 그러나, 두 방법을 조합하여 사용할 수있다; HPTLC 지질이 변경 될 수있는에 대한 개요를 얻기 위해 사용될 수 있고, HPLC는 주어진 샘플에서 특정 지질의 차이를 정량화 더 타겟팅 방법으로 사용될 수있다. 등 (28) (29)에 의해 얻어진 값과의 측정치를 비교하면, 더 적은 총 콜레스테롤 호중구에서 정량 하였다. 이것은 사용 된 방법에 의해 설명 될 수 있습니다. 다른 연구들은 자유 cholesterylesters 콜레스테롤 양을 검출하는 효소 결합 반응에 기초한적인 형광 검출을 사용 하였다.
여기서, HPTLC 및 HPLC는 MβCD뿐만 아니라 이전 Gorudko 동부 등에 의해 도시 콜레스테롤의 현저한 감소를 유도하는지 확인하기 위해 조합하여 사용된다.SS = "외부 참조"> 28. 그들은 10 mM의 MβCD에 의한 호중구 콜레스테롤의 60 % 감소를 보여 주었다. MβCD 처리 할 때 또한 스 핑고 미엘린 레벨 아니지만 콜레스테롤 에스테르의 약간의 감소는 호중구에서 검출되었다 (노이만 등. 15 참조). 동시에, 콜레스테롤 공핍 그물 형성 (노이만 동부 등 참조. 15)로 이끈다. 이러한 스타틴 호중구의 처리에서, 3- 히드 록시 -3- 메틸 글 루타 릴 조효소 A의 억제제 (HMG-COA) 리덕 타제는 콜레스테롤 생합성에서 속도 제한 효소는, 그물 형성을 향상하는 현상과 상관 관계가 발견. 호중구 스타틴 치료 MβCD 처리에 비해 강한 NET 유도를 나타내고 있기 때문에, (참조 노이만 외. (15) 및 우 등. 20), 막 - 고정 prenylated 이펙터 보호 자전거에 예 스타틴 추가 효과인은 그물의 형성에 관여 할 수 있습니다.
네트의 형성은 비교적 새로운 기술 숙주 방어 메카니즘이다. 세포 외 DNA 섬유는 지금뿐만 아니라 포유 동물 (30), (31)에 설명하지만, 한 또한 닭고기, 생선, 새우, 식물 32, 33, 34, 삼십오인치 병원균이나 다른 자극과 호중구의 자극시, 그물은 함정에 빠뜨리 가능성이 침입하는 병원균 (36)을 죽일 세포 외 공간으로 방출된다. 활성화 된 호중구의 지질 구성을 공부하는 것은 그것의 항균 활성을 매개하는 세포 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 호중구의 총 지질 수준을 측정하기 때문에, 지질 함량이 다른 방법을 결정하기 위해 남아 있고 플라스틱으로 대 전체 셀에 MβCD에 의해 영향을 받는다MA 막과 다른 막 마이크로 도메인 중. 그러나, 이는 전술 한 바와 같은 특정 막 분리 절차 요구 (슈 등의 알.). (37)
염색질 외에, 인간의 그물은 MPO 등 여러 가지 호중구 단백질을 포함; 엘라 스타 제, 항균 펩티드 LL-37; 또는 17, 36 calgranulin. 최근의 연구는 시작하고 그물 15, 38, 39의 형성을 촉진하는 특정 단백질과 형태 학적 변화의 역할에 크게 초점을 맞추고있다. 그러나, 지금까지 만이 과정을 15, 20 중 특정 지질의 중요성에 대한 지식이 제한됩니다. 따라서이 미래에 더 자세히 탐구 할 특히 흥미로운 영역입니다. 지질 막 수정에 마지막으로 지식치료 방법은 감염에 대한 면역 체계를 강화하기위한 기반이 될 수 있습니다. 이 콜레스테롤 항생제 및 항균 펩타이드 (40)에 대해 해당 버그의 저항을 개선하는 것이 증명 되었기 때문에 예를 들어, 그것은, 콜레스테롤의 고갈은 H. 파이로리 같은 항생제 내성 병원체 싸움에 도움이되는 것으로 나타났다. 비슷한 연구는 서로 다른 박테리아 종 호스트 병원체 상호 작용을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 아리안 뉴만에게 제공 수의학, 하노버, 독일의 대학의 "동물 및 인수 공통 감염의"아카데미에 대 한 Tiergesundheit (AFT) 및 박사 과정에서 친교의 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
