Abstract
Reporter möss har ofta använts för att observera lokaliseringen av expressionen av målinriktade gener. Detta protokoll är inriktat på en strategi för att etablera en ny transgen reporter musmodellen. Vi valde att visualisera interleukin (IL) 22 genuttryck, eftersom detta cytokin har viktiga verksamheter i tarmen, där det bidrar till att reparera vävnad som skadats av inflammation. Reporter system erbjuder betydande fördelar jämfört med andra metoder för att identifiera produkter in vivo. I fallet med IL-22, hade andra studier isolerades först celler från vävnader och sedan återstimulerade cellerna in vitro. IL-22, som normalt utsöndras, var instängd i celler med användning av ett läkemedel, och intracellulär färgning användes för att visualisera den. Denna metod identifierar celler med förmåga att producera IL-22, men det bestämmer inte om de gjorde så in vivo. Reportern designen inkluderar insättning av en gen för ett fluorescerande protein (tdTomato) in i den IL-22-genen i en sådan way att det fluorescerande proteinet inte kan utsöndras och därför förblir instängd i de producerande celler in vivo. Fluorescerande producenter kan sedan visualiseras i vävnadssnitt eller genom ex vivo analys genom flödescytometri. Själva byggprocessen för reportern ingår recombineering en bakteriell artificiell kromosom som innehöll IL-22-genen. Denna engineered kromosom infördes sedan i musgenomet. Homeostatiska IL-22 reporterexpression observerades i olika musvävnader, inklusive mjälte, tymus, lymfkörtlar, Peyers plaque, och tarmarna, genom flödescytometrianalys. Kolit inducerades genom T-cell (CD4 + CD45RBhigh) överföring, och reporterexpression visualiserades. Positiva T-celler var först närvarande i de mesenteriska lymfkörtlarna, och sedan de ackumuleras inuti lamina propria av de distala tunntarmen och kolon vävnader. Strategin använder BAC gav god trohet reporter uttryck jämfört med IL-22 expressionen, och det är enklare än knock-i försök.
Introduction
Celltyp-specifik expression av reportergener är användbara för att identifiera celler som aktivt uttrycker målet i vävnader under homeostatiska och störda tillstånd. Det möjliggör också för rening av dessa celler, som fortfarande är livskraftiga, för att studera deras andra egenskaper. Reporter möss har använts för att belysa verkningsmekanismen för specifika cytokiner, transkriptionsfaktorer, och regulatoriska element. Tidigare strategier 1, 2, har tre i stort sett förlitat sig på att knacka reportern in i mållokuset i mus kromosom, en tidsödande och kostsam procedur. Sålunda är det önskvärt med en enklare metod för generering av reporter möss.
Cytokiner är en bred klass av små, utsöndrade proteiner / peptider som reglerar immunsvar genom intercellulär signalering. Interleukin 22 (IL-22) är en cytokin med många rapporterade aktiviteter, inklusive spärr funktion, vävnadsreparation, och inflammation 4. Även IL-22 var ursprungligen upptäcktes som en T-cellprodukt 5, efterföljande rapporter visade sitt uttryck i naturliga mördarceller (NK) i människa 6 och möss 7 och i andra typer av medfödda lymfocyter 8. Trots omfattande observation av IL-22-producerande celler, visualisering av IL-22 tidigare krävdes ex vivo stimulering och permeabilisering till fläckar med antikroppar. Därför skulle nya IL-22 reporter möss vara ett mycket användbart verktyg för att undersöka funktionen av IL-22 i homeostatiska och patogena processer.
Här har vi tagit fram en förenklad transgen reporter musmodell att observera IL-22-producerande celler in vivo och in vitro. Med hjälp av en BAC recombineering metod 9, införas vi tdTomato cDNA-sekvensen med Poly en signal fragment i IL-22 locoss och ersatte exon 1. De andra oöversatta regioner, exoner och regulatoriska element inte störd, eftersom vi vill efterlikna den naturliga regleringen av IL-22 så mycket som möjligt. Platsen av reporter införing stör signalsekvensen, vilket resulterar i ansamling av reportern inuti de producerande cellerna, till skillnad från IL-22 i sig, som snabbt utsöndras. Denna nya metod kan också appliceras på genereringen av reporter möss för andra utsöndrade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur fick rätt vård i enlighet med de experimentella procedurer som anges i 2011 Guide för skötsel och användning av försöksdjur kommitté Frederick National Laboratory for Cancer Research.
1. Framställning av IL-22-tdTomato Reporter möss genom BAC Recombineering
OBS: Mössen bör vara medvetslös och inte röra sig som svar på en skadlig stimulans. Sterilisera kirurgiska området med 70% etanol och sterilisera alla kirurgiska verktyg som använder en glas pärla autoklav.
- Rena BAC DNA (RP23-401E11, klon längd 228391 bps) med användning av en alkalisk extraktion metod 10, 11. Karakterisera BAC-klon av Spel nedbrytning av 5 mikrogram av RP23-401E11 att bekräfta den korrekta storleken på målgenen. OBS: BAC-DNA digererades i 14 fragment.
- För in tdTomato reportergenen in i Not I / Sal I-stället i PLD53SC-A-GFP-B skyttelvektor11 och ersätta GFP-genen på samma plats. Sedan, med hjälp BAC RP23-401E11 som en mall, amplifiera homologi lådor (A och B) och den första översatt exonen av Il-22 (exon 1) genom PCR (95 ° C 2 min; 30 cykler av 95 ° C för 30 sekund, 55 ° C under 30 sekunder, och 72 ° C under 30 sek; och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min). I en 50 | il PCR-reaktionssystem, tillsätt 50 ng (1 | j, l) av BAC-DNA, 0,5 | il av primrar (10 | iM), 40 pl PCR SuperMix high fidelity, och 8 | il av H2O
OBS: Primers för A- och B-rutorna är följande: En ruta Framåt: 5'T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG och bakåt: 5'CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B rutan Forward: 5'G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA och bakåt: 5'T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Platserna för de restriktionsenzymer (Asc I och Pac I) är understrukna. - Ligera 500 ng av Asc I-digererad A och 500 ng av Pacl-digererad B fragmmedelsingredienser in i 50 ng av PLD53SC-ATB (tdTomato) vektorn vid 16 ° C under 1 timme.
- Omvandla den renade PLD53SC-ATB vektorn i BAC kompetenta celler 11 och kultur dem på Luria-Bertani (LB) agarplattor med kloramfenikol (20 | ig / ml) och ampicillin (30 | ig / ml) vid 37 ° C. Välj två till tre kolonier samarbets integrera från Ch / Amp förrådsplattorna.
- Inokulera varje koloni i 1 ml LB supplementerat med 20 pg / ml kloramfenikol och inkubera dem under 1 timme vid 37 ° C och 225 rpm. Sprid 100 pl av varje blandning på en LB-agarplatta (10 g Pepton 140, 5 g jästextrakt, 12 g agar och 1 liter vatten; pH 7,5) kompletterad med kloramfenikol och 4-4,5% sackaros. Inkubera kulturen över natten vid 37 ° C.
- Välj både stora och små kolonier och förnyad utbredning dem på två LB-agarplattor med kloramfenikol. Då, utsätta plattorna antingen med eller utan UV-ljus under 30 sek och plocka UV-känsliga kolonierna för ytterligare analys.
- Identifiera den modifierade BAC DNA genom PCR med användning av tdTomato / IL-22 heterozygot primer (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT, Omvänd: 5' TGT AAT CGG GGA TGT CGG C). Termocykler Betingelserna är följande: 95 ° C under 2 min; 30 cykler av 95 ° C under 30 sek, 56 ° C under 30 sekunder, och 72 ° C under 30 sek; och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min.
- Bekräfta sekvensen för den modifierade området av BAC genom direkt BAC sekvensering av stora-prep BAC-DNA 12.
- Söva en mottagare mus med en dos av 0,25% tribromoethanol in i peritonealhålan vid implantation av mikroinjicerade zygoter till pseudo-gravida C57BL / 6c möss.
- Linjärisera IL-22-tdTomato BAC konstruera (10 | j, g) genom digerering med 5 pl av restriktions endonucleasePi-SCEI i 100 ul av reaktionssystemet och mikroinjicera den linjäriserade BAC-DNA i befruktade ägg av C57BL / 6-honor vid pronukleär steget 13. scresv de transgena mössen genom Southern blot-analys av DNA som isolerats från svansbiopsi användning av standardförfaranden.
2. Single-cell Preparation från mjältar, bräss, lymfkörtlar och Peyer s Patch
OBS: IL-22-tdTomato reporter möss hölls vid det nationella cancerinstitutet (NCI, Frederick, MD). Dödshjälp metod överensstämmer med de senaste AVMA riktlinjer för dödshjälp. Alla möss avlivades med hjälp av CO 2 inandning 14.
- Avliva en IL-22-tdTomato mus i en CO 2 kammare och placera den på en ren pad. Sterilisera buken huden genom att spraya 70% alkohol och skär upp den. Avlägsna mjälten i den vänstra flanken och tymus bakom bröstbenet.
- Att skörda mesentericlymph noder (som ligger i mesenteriala vävnad) och Peyers plack (små lymphoidnodules hela ileum regionen av tunntarmen), ta pärlvita mesenteriska noder nära till tHan väggen i tunntarmen med hjälp av dissekera pincett med fin-punkt tandade tips först och sedan ta bort hela tunntarmen och tjocktarmen ut ur kroppen. Hitta de utvidgade ovala fläckar (Peyers plack) längs tarmen och skär dem med en sax. Slipa dessa lymfoida vävnader (lymfkörtlar och Peyers plack) individuellt mellan två frostade objektglas i en enda cellsuspension i PBS / 1% fetalt bovint serum (FBS) buffert på is.
- Finhacka mjälte eller tymus vävnader med användning av samma metod som i steg 2,2. Centrifugera mjälten suspensionen under 8 minuter vid 500 xg och 4 ° C. Tillsätt 1 ml ACK lyserande buffert per mjälte till cellpellets.
- Blanda väl och låt dem stå i 1 min. Lägga 9 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert till varje prov. Centrifugera ner genom centrifugering under 8 minuter vid 500 xg och 4 ° C för att avlägsna de röda blodkropparna.
OBS: Lägg inte till ACK lyseringsbuffert till tymusceller. - Resuspendera de resulterande leukocyter i 5 ml PBS och pass cellerna genom en 100 | j, m cellfilter. Samla in de cellpelletar genom centrifugering vid 500 x g under 8 min.
- Resuspendera cellerna i 5 ml RPMI-medium eller FACS-buffert och räkna livskraftiga celler med användning av 0,4% trypanblått färgämne / PBS-lösning.
3. Isolering av intraepitelial lymfocyter och lamina propria-celler från tarmen
- Öppna bukhuden som i steg 2,1, skär tunntarmen, från tolvfingertarmen (bredvid magsäcken) till ileum (nära till bilaga), och hela tjocktarmen, precis ovanför anus. Ta bort extra fett- och mesenteriska vävnad med pincett. Sätt tarmarna omedelbart i iskall PBS.
- Leta efter Peyers plack (små, grova knutor) längs den distala regionen av tunntarmen. Ta bort massorna med hjälp av pincett andopen tarmen på längden med en sax. Noggrant spola tarmen med 10 ml iskall PBS.
- Inkubera vävnaderna i 20 ml av pre-digereringsbuffert (5 mM EDTAoch 1 mM ditiotreitol i Hanks balanserade saltlösning (HBSS)) under 30 min vid 37 ° C med långsam rotation (50 varv per minut) i en shaker. Efter var och en av 2 inkubationer bort epitelceller skiktet, som innehåller de intraepitelial lymfocyter (IELs), genom intensiv virvelbildning (30 sekunder vid 12.000 rpm) och passera alla vävnader genom en 100 ìm cell sil.
- Tillsätt 20 ml ny EDTA-lösning till vävnad för andra inkubation under 30 min vid 37 ° C. Passera IEL fraktionerna genom en 100 ìm cell sil och samla dem med de tidigare fraktionerna. Håll återstående tarmfragment på is som ska behandlas i steg 3,9.
- Centrifugera de poolade IEL fraktioner vid 800 xg under 5 min vid 4 ° C. Tvätta de sammanslagna IEL fraktioner med 10 ml HBSS / 5% FBS och spinn ner dem under 5 minuter vid 800 xg och 4 ° C.
- Resuspendera cellerna i 8 ml 44% kolloidal kiseldioxid mediet 15 och överdraga dem med 5 ml av 67% kolloidal kiseldioxid medium. Centrifugera 44% / 670,5% cellblandningen gradient under 20 min vid rumstemperatur och 1500 x g.
- Samla IEL celler från bandet vid gränsytan. Först ta bort det översta lagret av supernatanten (ca 5 ml) med hjälp av en ml pipett. Sedan skörd IELs på inter av kolloidal kiseldioxid mediet gradient.
- Tvätta IELs genom tillsats av 10 ml av RPMI-medium. Snurra celler nedåt under 5 minuter vid 800 xg och 4 ° C. Resuspendera IELs i 5 ml RPMI för steg 3,15.
- För isolering av lamina propria lymfocyter (LPLs), finhacka tarmen vävnadsfragment från steg 3,4 i små bitar med hjälp av en sax (1 mm) och smälta bitarna med 10 ml uppslutningsbuffert (0,05 g av kollagenas, 0,05 g DNasI, och 0,3 g av dispas II i RPMI / 5% FBS) under 15-20 min vid 37 ° C.
- Filtrera blandningen genom ett 70 ^ m cellfilter. Genomflödes Supernatanten innehåller det frigjorda LPL.
- Helt smälta tarmen fragment genom steg normalt upprepa 3,9-3,10 (måste de varaupprepades 3 gånger). Varje gång, pool supernatanterna innehållande LPLs.
- Samla cellerna genom centrifugering under 5 min vid 1500 xg och rumstemperatur och återsuspendera pellet i RPMI / 5% FBS. Passera dem genom en 40 | im cellfilter.
- Resuspendera cellpelletarna i 10 ml av 40% av det totala av en 40:80 kolloidal kiseldioxid medel lutning och överlagra dem på 5 ml av 80% av det totala i en 15 ml tub.
- Utför densitetsgradient separation genom centrifugering under 20 min vid 1500 xg och rumstemperatur 15.
- Samla in LPLs, såsom beskrivs i steg 3,7. Tvätta dem en gång med 10 ml PBS och suspendera pellets i 1 ml PBS / 1% FBS buffert eller RPMI-medium.
- Räkna viabla celler (både IELs och LPLs) med användning av 0,4% trypanblått färgämne / PBS-lösning.
4. Expression av IL-22-tdTomato i Colitis
- Förbereda enstaka mjälten cellsuspensioner från IL-22-tdTomato möss vid en koncentration av 1 x 10 <sup> 7 celler / ml i steril PBS, som beskrivs i steg 2.1-2.4.
- Rena CD4 + T-celler genom att använda musen CD4-celler Negativ isoleringsmetoden 10. Märka dem med anti-CD4-APC (klon RM4-5, 0,5 pl / 1 x 10 6 celler i PBS / 1% FBS-buffert) och anti-CD45RB-FITC (klon 16A, 0,5 pl / 1 x 10 6 celler i PBS / 1% FBS-buffert) genom inkubering vid 4 ° C under 30 min.
- Snurra celler nedåt under 5 minuter vid 500 xg och 4 ° C. Tvätta cellerna med 2 ml PBS / 1% FBS-buffert och återsuspendera dem i 1 ml PBS / 1% FBS färgningsbuffert.
- Köra de märkta T-celler på en flödescytometri maskin 16. Grind cellerna på en T-cellpopulation och sorterings CD4 + CD45RB höga dubbelpositiva celler (våglängden detekteras vid 488 nm och 633 nm lasrar).
- Skörda sorterade cellerna genom centrifugering under 5 min vid 500 xg och 4 ° C. Resuspendera cellpellets i steril PBS-buffert vid 1 x 10 6 6) in i peritoneum ofeach Rag1 - / - mottagare mus.
- Offra de mottagande mössen under CO 2 vid olika tidpunkter. Skörda kröslymfknutor och de små och stora tarmar, som beskrivs i steg 2.1 och 2.2. Lägg varje mesenteriala lymfkörtel och skär öppna tarmen (papper / tarm / papper smörgås) i 4% paraformaldehyd (PFA, hantera under en huv) över natten för att fixa vävnaderna. Byt ut PFA med 18% sackaros under 16-24 timmar och sedan frysa vävnaderna för sektionering.
- Använda kryostat maskinen för att skära vävnaden 17, 18, 19. Värma sektionerna vävnads till rumstemperatur under ca 60 min och placera dem i aceton under 10 min vid rumstemperatur. Torka dem vid rumstemperatur i cirka 5 minuter.
- Lägg FBS i överskott, ta bort den med pipett och lägg anti-RFP vid en 1: 200 spädning i 0,1% BSA / 1 x PBS. Inkubera antikroppen vid 37 ° C under 60 min.
- Skölj sektionerna i 1 x PBS under 10 minuter och applicera motsvarande sekundära antikroppen (get-anti-kanin-568) till vävnaden, späddes 1: 300 i 1% BSA / 1 x PBS, under 30 min vid rumstemperatur.
- Skölj objektglasen i 1x PBS i 10 minuter, torka av dem och lägga täck.
- Visualisera alla prover med en fluorescerande mikroskop under konsekvent belysning (RFP: excitationsfilter 540-580 nm) med 40X objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En murin IL-22 reporter transgen skapades genom att använda recombineering att modifiera en bakteriell artificiell kromosom bär IL-22 locus. Figur 1 visar ett diagram av pBACe3.6 vektor innehållande sacBII gen, en positiv-selektionsmarkör, och kloramfenikol antibiotikaresistensgen 11. Efter att ha infört tdTomato i exon ett, ades signalpeptidsekvensen avbryts, såsom visas i figur 2. Således var tdTomato reporter fångade inne i IL-22-uttryckande celler, som gör det möjligt att upptäcka och isolering genom flödescytometri. De homozygota möss uppfödda från grundarlinjerna och screenades genom PCR, och att de inte behöver återkorsning för att uppnå avkomma med en genetisk identitet, vilket krävs i den vanliga knock-strategi. För att testa trohet av IL-22 reportrar, in vitro -generated splenocyter odlades enligt Th22 eller neutrala betingelser.
Figur 1: Site karta över pBACe3.6 vektor. pBACe3.6 kännetecknas av att den innehåller kloramfenikol antibiotikaresistens och en sacBII genen som en positiv selektionsmarkör. Under rekombination, de önskade klonerna är sackaros-resistenta genom deras uttrycker sacBII genen och tillåts växa på sackaros-innehållande media, medan de negativa BAC kolonierna är sackaros-känsliga.
Figur 2: Schematisk vy av den modifierade RP23-401E11 BAC-klon. En tdTomato reportergen infördes i Il-22 locus, som innefattar IL-22 och reglerande element i en murin bakteriell artificiell kromosom (BAC RP23-401E11), med användning recombineering teknik. Genom homolog rekombination, sekvensen för signalpeptiden av Il-22 i BAC stördes och exon 1 av Il-22 ersattes av den tdTomato reportergen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Identifiering av IL-22 reportrar i splenocyter odlade in vitro. CD4 T-celler renades från mjälten och stimulerades sedan med anti-CD28; anti-CD3 (neutralt tillstånd); eller anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, och 6-formylindolo (3,2-b) karbazol (FICZ) under 5 dagar. IL-22-tdTomato analyserades med flödescytometri (övre två) och fluorescensmikroskopi (två botten, skala bar: 100 ^ m). Siffrorna i kvadranterna indikerar procent av CD45 + celler.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Visualisering av IL-22-producerande celler i olika musvävnader. Single-cellsuspensioner bereddes från mjälten, tymus, lymfkörtlar, tarmar (IEL och LP), och Peyers plaque. De överfördes sedan yt-färgades med FITC-anti-CD3 och undersöktes med avseende tdTomato expression. MLN: mesenterial lymfkörtel, ALN: axillär lymfkörtel, PP: Peyers plaque, IEL: intraepitelial celler isolerade från tunntarmen, LP: lamina propria-celler renas från tunntarmen. Siffrorna i kvadranterna indikerar procent av CD45 + celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Lokalisering av IL-22 reportrar under utvecklingen av T-cellöverföring kolit. CD4CD45RBHigh T-celler från IL-22 reporter möss fördes till Rag1 - / - möss, och de tdTomato signaler utvärderades genom immunhistokemi i de olika vävnader vid olika tidpunkter under utvecklingen av kolit. Pilarna pekar på de IL-22-tdTomato signaler. Skalstrecken = 25 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IL-22 spelar en viktig roll i medfödda värdförsvar och vävnadsombildning. IL-22-producerande celler har identifierats ex vivo genom intracellulär färgning. Men fortfarande det svårt att spåra IL-22 expression in situ, antingen i det normala tillståndet eller inflammatoriska tillstånd. Detta protokoll beskriver en ny metod för att utveckla en IL-22 reporter musmodell som gör det möjligt för oss att lokalisera reporter-uttryckande celler in vivo. Reportergenen kodar för tdTomato sattes in i den IL-22-lokuset vid ett ställe som stör signalsekvensen. Denna strategi resulterar i reportern att bli instängd i den producerande cellen, till skillnad från IL-22, som snabbt utsöndras, vilket möjliggör visualisering av den producerande cellen. Den konstruerade IL-22-reporter innehölls inom ett stort BAC, i syfte att bevara de regulatoriska elementen, vilket vidare innebär trohet av uttryck av reporter som motsvarar den hos IL-22. Tarm vävnader i transgena mis visas homeostatisk reporter expression i CD4 T-celler och medfödda lymfocyter i lamina propria av tunntarmen. I inducerat kolit, CD4 T-celler uttryckte reportern i kolon.
Rollen för IL-22 vid inflammatorisk tarmsjukdom har varit oklar. Genom att delta i tarmslemhinnans försvar och vävnadsregenerering, är IL-22 förmåga att framkalla produktion av både skyddande 20, 21, 22 och proinflammatoriska mediatorer (t.ex. IL-8) 23, 24. Två modeller av T-cell-driven kolit visade ökningar i IL-22 i kolon, inklusive TCR α - / - möss 25, 26 och CD45RB hi överföringsmodell 27. Jämföra inflammatoriska modeller tarmsjukdom, IL-22 uttryck i tarmen var högre i en Crohn sjukdom modelthan i en modell av ulcerös kolit 21, 24 .Här överför vi CD4CD45RBhi T-celler från de reporter möss in Rag1 - / - mottagare och härma den patogena processen för Crohns sjukdom. Vi fann att, före kolit, var IL-22 reportrar visualiseras i tarm dränerande lymfkörtlar (MLN). Signalerna minskat sedan i MLN och flyttade till tarmarna, särskilt de distala tunntarmen och kolon, med utveckling av kolit. Flesta tdTomato reportrar var lokaliserade inuti lamina propria slemhinnan i tarmen.
En annan typ av reporter för IL-22 har tidigare beskrivits, i vilka celler är permanent märkta så att de och deras döttrar fortsätter att uttrycka reportern, om transkription av IL-22 eller inte har fortsatt 28. Som i vår studie, gut medfödda lymfocyter märkta enligt homeostatiska förhållanden, och i kolit, than reporter lokaliserades i T-celler från mesenteriska lymfkörtlar till tarmvävnaden.
De procedurer som beskrivs i detta protokoll skulle gälla för fastställandet av andra transgen reporter möss, såsom IL-17, IL-25, och så vidare. Emellertid är det viktigt att välja lämpliga BAC-kloner som bär distala regulatoriska element för att säkerställa återgivningen av reportergenuttryckning, eftersom transgener är slumpmässigt integrerad i musgenomet. Reportern musen tillåter för identifiering av celler som uttrycker in vivo, såväl som för rening och karaktärisering av levande celler. Vi använde tdTomato, en ovanligt röda fluorescerande protein, som en fluorescerande reporter gen att reportern som lämpar sig för levande djur imaging studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
