Summary
die zellulären und molekularen Mechanismen der Reendothelialisierung nach einer arteriellen Verletzung Denudation zu verstehen, ist von größter Bedeutung, Thrombose und Restenose von Arterien zu verhindern. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare arterielle denudation Verletzung der infraBauchAorta. Das Verfahren wurde entwickelt, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die endotheliale Regeneration unter Verwendung von Maus-Modellen regulieren.
Abstract
Die perkutane vaskuläre Eingriffe führen gleichmäßig in arteriellen denudation Verletzungen, die anschließend zu Thrombose und Restenose führen. Diese Komplikationen können in Reendothelialisierung innerhalb der Wundränder zugeschrieben Beeinträchtigungen werden. Dennoch bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen der Re-Endothelialisierung definiert werden. Während verschiedene Tiermodelle Reendothelialisierung nach arterielle Denudation zu studieren verfügbar sind, einige sind wegen chirurgischer Einschränkungen in der Maus durchgeführt. Dies untergräbt die Möglichkeit, transgene Mauslinien zu nutzen und um den Beitrag spezifischer Gene auf den Prozess der Re-Endothelialisierung untersuchen. Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll eine hoch reproduzierbare Mausmodell der arteriellen denudation Verletzung in der infra abdominalen Aorta unter Verwendung externer Gefäßklemm zu schaffen. Immunzytochemische Färbung von verletzten Aorten für Fibrinogen und β-Catenin zeigen die Belichtung eines pro-thrombotischen Oberfläche eind die Grenze von intakten Endothel sind. Das hier vorgestellte Verfahren hat die Vorteile der Geschwindigkeit, hervorragende Gesamtüberlebensrate und die relative technische Einfachheit, ein einzigartig praktisches Werkzeug für die Verhängung von arteriellen denudation Verletzungen in transgenen Mausmodellen zu schaffen. Mit dieser Methode können Forscher die Mechanismen der Re-Endothelialisierung unter normalen oder pathologischen Zuständen aufzuklären.
Introduction
Thrombosis und Restenose sind ernst Früh- und Spätkomplikationen bei Patienten , die perkutane Gefäßinterventionen wie endovaskuläre Ballon - Angioplastie und Stenting 1,2 laufen. Mehrere Strategien wurden diese Komplikationen, insbesondere dualen Thrombozytenaggregationshemmer-Therapie und Medikamenten-freisetzende Stents zu adressieren eingesetzt. Jedoch wenig Aufmerksamkeit wurde auf der zugrunde liegenden Ursache der Thrombose und Restenose, nämlich den Verlust der endothelialen Zellabdeckung (Denudation) angeordnet ist. Denudation Verletzung ist eine unvermeidliche Folge der interventionellen Verfahren aufgrund von mechanischen Trauma der Blutgefäßwand. Diese mechanische Trauma kann zur Beschädigung und Entfernung der Schutz Endothelschicht und Belichtung der Basalmembran und der vaskulären glatten Muskulatur führen zu zirkulierenden Blut 3. Der Verlust von Endothelzellen in diesen Bereichen schafft eine pro-thrombotischen und proinflammatorische Umgebung, die nicht nur Thrombozytenadhäsion und anschließender Thrombose fördert, sondern einelso stimuliert Migration und Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen in die neointimale Verdickung und Restenose resultierenden 4. Diese Komplikationen und die damit verbundenen Therapien, führen zu einer erheblichen Morbidität, insbesondere rezidivierende ischämische Krankheit und Blutungsereignisse, die die menschliche Gesundheit auswirken.
Re-Endothelialisierung der denudierten Verletzung von den Wundrändern ist von überragender Bedeutung in 5 Thrombose und Restenose verhindert wird . Autopsy Ergebnisse und Tiermodellen effektiv verringert Raten Thrombose mit einer Deckungssumme von Stent 6,7 Streben. Drug-eluting Stents entwickelt Raten von Restenose zu verringern durch Proliferation der glatten Muskulatur und Neointimalhyperplasie Hemmung, führen zu erheblichen Beeinträchtigungen im arteriellen Reendothelialisierung und steigende Preise von späten Thrombose 3. Leider ist für Reendothelialisierung die Mechanismen zu verstehen, war ein langsamer Prozess, vor allem durch das Fehlen ap begrenztchenden Tiermodellen 8.
Mehrere Tiermodelle für das Verständnis der Rolle von Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen Arterienverletzung folgenden haben 7,9,10 geschaffen. Die Ratte A. carotis Ballonverletzung Modell ist am besten charakterisiert und wurde die Wirkung von Entblößung Verletzung am Brutto, zellulärer und molekularer Ebene 11 zu studieren eingesetzt. Dennoch ist ein in hohem Maße reproduzierbar Mausmodell der arteriellen denudation Verletzung mit ausgezeichneten Überlebensraten fehlen und dringend benötigte Vorteile von mehreren transgenen Linien zu nehmen zur Verfügung zu besseren vaskuläre Regeneration in mehreren Einstellungen aufzuklären.
Dieses Manuskript stellt ein Mausmodell der arteriellen denudation Verletzung, die reproduzierbar und einfach durchzuführen. Der Ansatz wurde in mehreren transgenen Linien minimale Morbidität und Mortalität. Wegen der breiten Anzahl von genetisch veränderten Mauslinien, dieses Modell kann verwendet werden,Aufklärung der molekularen Mechanismen Reendothelialisierung nach Abtragung Verletzung zugrunde liegt.
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Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Animal Research Committee an der University of California in Los Angeles genehmigt.
1. Die präoperative Vorbereitung und Anästhesie
- Achten Sie darauf, sterile Technik während des gesamten Verfahrens zu beobachten.
- Sterilisieren alle chirurgische Versorgung in einem Autoklav mit.
- Schalten Sie auf beheizten Nagetier chirurgische Plattform vor der Narkoseeinleitung, so dass es auf geeignete Temperatur (37 ° C) und unter Stereomikroskop für die Visualisierung während der chirurgischen Prozedur erwärmen kann.
- Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie Induktionskammer und induzieren mit 4% Isofluran bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min.
- sorgfältig überwachen, die Atemfrequenz und Fußballen Hautfarbe der Maus während der Induktion.
- Nach der Atemfrequenz verlangsamt, die Maus aus der Induktionskammer zu entfernen und für die chirurgische Vorbereitung mit dem Gesicht in getrennten nosecone und Wartung Isofluran Konzentration von 2,5% auf vorgewärmten Pad platzieren.
- Führen toe pinch Angemessenheit der Narkose zu beurteilen.
- Bewerben Augensalbe auf die Cornea und subkutan verabreichen präoperativen Carprofen (5 mg / kg).
- Bewegen Sie die Maus im Liegen und im Gebrauch Clippers Haar von Bauch zu entfernen.
- Bereiten Sie den OP-Bereich mit drei Wechsel scheuert von Povidonjodid und 70% Isopropylalkohol mit steriler Gaze-Pads aufgetragen.
- Bewegen Sie die Maus liegt auf dem Rücken beheizten Nagetier chirurgische Plattform mit dem Gesicht in nosecone und sichern Sie alle Extremitäten und sorgfältig Position der Maus, so dass der Bauch mit dem Stereomikroskop sichtbar ist.
- Platzieren sterile, Klebeverbände entlang jeder Kante des hergestellten chirurgischen Bereich.
- Titriere Isoflurankonzentration ausreichende Anästhesie während der Operation zu erhalten, während die spontane Atmung aufrechterhalten wird.
2. infrarenalen Spann
- Machen Sie eine 3 cm lange Inzision entlang der Mittellinie des Bauches mit einem Skalpell, beginnend approximately 0,5 cm schlechter als die Xiphoidbasis.
- einfahren sanft die Haut mit einer Pinzette und sezieren Haut weg von der Bauchdecke einer feinen Schere mit dem feinen Bindegewebe zu schneiden.
- Anwenden 0,05-0,1 ml 0,5% Bupivacain in die Muskelwand und bilden einen 2 cm Einschnitt in der Bauchdecke die Bauchorgane zu belichten.
- Wenn die Blutung entlang Bauchdecke tritt, gelten sanften Druck mit einem Wattestäbchen.
- Heben Sie vorsichtig den Darm mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen verwenden.
HINWEIS: Achten Sie darauf, stumpfes Trauma auf die jejunal und Ileum-Arterien und auf einem warmen, steriler Kochsalzlösung durchtränkt Gazeschwamm außerhalb der Bauchhöhle zu vermeiden.- Decken Sie die Eingeweide mit einem anderen warmen, steriler Kochsalzlösung durchtränkt Gazeschwamm Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden.
- Legen Sie einen Aufroller das Rektum und setzen die retroperitoneum zu lateralisieren.
- Legen Sie kleine Gazekompressen als notwendig für die Visualisierung von retroperitoneum die Verfolgung der Anzahl verwendet.
- Auf der Ebene der unteren Pol der rechten Niere, mit scharfen Dissektionszangen an der Aorta ein retroperitonotomy lateral zu machen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die untere Hohlvene oder der umgebenden Gefäße zu verletzen.- Unverblümt retroperitoneale Gewebe aus der Aorta sezieren wobei darauf geachtet, nicht die untere Hohlvene oder der umgebenden Gefäße zu perforieren.
- Legen Sie die Gefäßklemme über die Aorta für mindestens 1 min oder anderen bestimmten Zeit, und überprüfen Okklusion durch visuelle Beobachtung Mangel an Pulsatilitäts in distalen Aorta.
- Entfernen Sie die Gefäßklemme und Hämostase überprüfen. Hämostase wird erreicht und gewährleistet, wenn keine aktive Bluterguss zu sehen ist.
- Bestätigen Extravasation durch Zugabe von 0,5 ml Kochsalzlösung in Bauchhöhle und die Beurteilung, ob die Salz zunehmend blutigem wird. Wenn dies der Fall ist, wenden Sie sanften Druck mit der Kochsalzlösung getränkten Applikator für 1 min, um sicherzustellen,Hämostase.
- Entfernen Sie alle Gazekompressen platziert in der Visualisierung von retroperitoneum zu unterstützen und ersetzen Darm in situ in Bauch.
- Spülen Sie die Bauchhöhle mit vorgewärmten steriler Kochsalzlösung.
3. Schließung der Laparotomie und Haut
- Schließen Sie die Bauchdecke Muskelschicht mit einem 5-0 geflochten, resorbierbaren einzigen fortlaufende Naht.
- Schließen Haut mit 1-3 Tropfen Polymerklebstoff und dann anschließend mit Wundklammern, sobald der Klebstoff gesetzt.
4. Wiederherstellung und postoperative Beurteilung
- Übertragen Sie die Maus auf eine Erholung Käfig auf einem Heizkissen mit Nahrung und Wasser auf dem Boden des Käfigs.
- die Maus für Anzeichen von Atemnot genau überwachen. Verabreichen Carprofen (5 mg / kg) täglich für 48 Stunden postoperativ pro Institution Richtlinien.
- Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten sternal Recum wiedergewonnen hatBency.
- Bringen Sie die Maus zu einem normalen Käfig mit Futter und Wasser.
- Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
- Beurteilen Sie Wunde auf einer täglichen Basis für Aufplatzen und entfernen Clips am ersten postoperativen Tag 14.
5. Aortendissektion und Anfärben
- Wählen Mäuse für Opfer basierend auf dem bestimmten Zeitpunkt von Interesse folgende Abtragung Verletzung.
- Sacrifice Mäuse über Isofluran Inhalation und sofort mit 5 mg Methacholin Chlorid injizieren zu glatten Gefäßmuskelentspannung führen.
- Nach der Bestätigung des Todes durch Atmungs Aufhören, Mangel an Hornhautreflex und Mangel an Bewegung, perfundieren mit 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei einem Perfusionsdruck von 100 mm Hg über die linke Herzkammer für 10 min.
- Verwenden Sie ein Sezieren Stereo sorgfältig die intakte abdominalen Aorta getrennt vondie umliegenden Gewebe.
- Transekts die Aorta rostral zu den Nierenarterien und kaudal der iliakalen Bifurkation und über einen Längsschnitt entlang der dorsalen Oberfläche geöffnet.
- Pin der Aorta flach auf einem 35 mm Silikon beschichtete Schale mit der luminalen Seite bis zur Fixierung für nicht weniger als 2 Stunden, aber nicht mehr als 12 Stunden. Anschließend kann das Gewebe eingebettet werden entweder für das Schneiden oder in en face ganze-mount Immunzytochemie verwendet.
- Berg Aorten mit luminalen Seite mit Blick auf das Deckglas auf Glasobjektträger für die konfokale Mikroskopie gefärbt.
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Representative Results
Achtzig Mäuse haben das Überleben Operationstechnik in diesem Bericht für infra Bauch-Aorten-Spann beschrieben unterzogen. Die Gesamtüberlebensrate betrug 85,9%. Operative Komplikationen waren Darm - Blutungen und große Gefäßperforation, was zu 5,9% und 3,5% Mortalität (Tabelle 1). Nach der Erholung von der Anästhesie gehen, Mäuse normal und keine Anzeichen für eine ischämische Schädigung der minderwertigen Gliedmaßen zeigen. Kein Gewichtsverlust oder Appetitmangel festgestellt.
Die 1A und 1B zeigen Bilder der infra abdominalen Aorta folgenden Laparotomie und retroperitonealen Dissektion unter dem Stereomikroskop ohne (A) und mit (B) Aorten - Spannen. Wie gezeigt, ist es wichtig, die Aorten Breite in seiner Gesamtheit festzuklemmen Denudation entlang der Breite der Aorta sicherzustellen. Unser Protokoll festgestellt, dass unter Verwendung von scharfen Kurve Schwartz Micro SerreBußgelder mit einer Backenbreite von 1,75 mm und "starken" Klemmpresse produzierte die größte zusammenhängende Wunde über die gesamte Breite der Aorta mit minimaler Klemm Zeit. Allerdings wurden andere Klemmen an mehreren Okklusion Zeitintervallen mit variabler Verletzung Größen (1C) getestet. Der Rest der dargestellten Ergebnisse wurden unter Verwendung der oben genannten Klammer hergestellt.
Histologische Beurteilung der Aorta zeigt vollständige Abtragung der endothelialen Auskleidung mit mäßiger Beschädigung des darunterliegenden glatten Muskelzellschicht, wie durch H & E-Färbung nachgewiesen. Denudation des Endothels tritt sowohl bei 10 sec und 10 min, wenn auch in unterschiedlichem Grad (Abbildung 2). Um die optimale aortic Klemmzeitintervall bestimmen, für die vollständige arterielle Denudation erforderlich unterzog Mäuse für 10 sec Klemm, 1 min und 10 min und wurde sofort für die Analyse geopfert wie in dem oben beschriebenen Protokoll. Das AREa von Denudation erhöhte Klemm Timings mit zunehmender (Abbildung 3). Bei 10 sec, unvollständig und lückenhaft denudation Verletzung von ca. 0,75 mm 2 wurde durch lückenhaft Fibrinogen - Färbung identifiziert, wo Fibrinogen als Marker Verletzung für denudation dient. Zehn Minuten von Aorten - Spann erzeugt eine völlig entblößten endotheliale Fläche von etwa 1,2 mm 2, aber diese Zeit der Klemm wurde ein hohes Risiko für Extremitäten - Ischämie und Reperfusion betrachtet. Als solche gelten wir 1 min von Aorten - Klemm ausreichend, die eine 0,88 mm 2 Fläche von Entblößung im Durchschnitt produziert, ohne in eine nahezu vollständige arterielle denudation Verletzungen zur Folge haben evidenter ischämischer Verletzungen.
Das Ausmaß der Abtragung Verletzung mit 1 min von Aorten - Klemm ist extrem reproduzierbar, eine 600 & mgr; m Durchmesser und 0,88 mm 2 Fläche von Entblößung (3 und 4) zu erzeugen. DasIntensität von Fibrinogen Färbung ist ausreichend , um die ursprüngliche Verletzung zu späteren Zeitpunkten zu identifizieren. 4 zeigt Fibrinogen Färbung von drei Mäusen , die 1 min der Aorten wurde eine 24 Stunden vor Klemm zu opfern, eine hoch reproduzierbare Verletzungen kommen kann . Messung des Fibrinogen 24 h nach der Verletzung von sechs Aorten Färbung beträgt ca. 0,81 mm 2 (5A), statistisch ähnlich zu der Schädigung 0,88 mm 2 festgestellt , unmittelbar nach der Verletzung (p = 0,14). Im Vergleich zu unverletzten Endothel, Wundrand 24 h nach der Verletzung zeigt migrierenden Endothelzellen mit Fibrinogen Färbung liegt, Markierungs Reendothelialisierung in die Denudation Schädigung (5B). Im Durchschnitt komplettes Re-Endothelialisierung der Abtragung Verletzung 0,88 mm 2 dauerte ca. 3 Tage. Allerdings kann dieser Ansatz weiter noch größere Abtragung Verletzungen zu produzieren angepasst werden. Klemm mehrere Male, jedesfür 1 min, von rostral entlang der infrarenalen Aorta caudal erzeugte eine Denudation Verletzungs 3,7 mm 2. Obwohl dieser Ansatz auch Schäden, die Tunica media, haben wir beobachtet, nie Dissektion der abdominalen Aorta als Folge der Klemm Verletzung.
Dieses Protokoll zeigt, dass infra abdominal aortic Klemm kann sicher in einem Mausmodell für die Zwecke der Schaffung einer arteriellen Verletzung und Denudation Messung endothelial Regeneration durchgeführt werden.
Abb . 1: Isolierte Infrabauchaorta isoliert infra abdominalen Aorta ist eine Gefäßklemme ohne (A) und mit (B) gezeigt. Mehrere Klemmen verschiedener Längen und Klemmpressfestigkeit wurden verwendet , um die eine auszuwählen , die konsistente Verletzung (C) bietet. Die Schwartz Micro Serrefine (Pfeil) produziert die größte zusammenhängende Wunde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Effizienz von endothelialer Denudation H & E - Färbung eines infra abdominal aortic Abschnitt in einem nicht-verletzten Maus (A) und nach 10 sec (B) und 10 min der Aorten Klemm (C).. Vascular Spann entblößt vollständig die endotheliale Schicht, wie sie durch Abwesenheit von Keimen Färbung überprüft werden. Auch Verlust der glatten Muskulatur Zellkerne Schäden an der Tunica media zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Beziehung von Clamp Zeit Länge Wound Infra Bauch - Aorten - Klemm wurde für 10 sec, 1 min und 10 min durchgeführt. Unmittelbar nach der Verletzung, Immunzytochemie wurde en face für eine Scheinoperation und diesen Zeitpunkten , wie gezeigt (A) und mit höherer Auflösung (B) durchgeführt. Fibrinogen (in lila) kennzeichnet den Bereich der Verletzung. β-Catenin (in rot) identifiziert endothelialen Grenzen. Der Stern (*) markiert den Klemmanwendungsgebiet. Fehlen von β-Catenin an Mangel an Endothelzellen in den Bereich der Schädigung. (C) verwendet Fibrinogen - Färbung als Marker der Bereich Denudation Schädigung zeigen , dass zunehmende Klemmzeit Denudation Bereich erhöht (n = 2 für jeden Zeitpunkt). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken hehe eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Die Identifizierung der Verletzung Bereich Vierundzwanzig Stunden nach der Aorten - Spann für 1 Minute wurde die Aorta seziert und schneiden Sie die Intima zu belichten. Nach der Fixierung in 4% Paraformaldehyd, Immunzytochemie wurde en face durchgeführt. Fibrinogen (in lila) kennzeichnet den Bereich der Verletzung (A). Eine stärkere Vergrößerung der Wundrand (B) und in der Wunde (C) gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Die Reproduzierbarkeit der DenudationVerletzungen und Identifizierung von Re-Endothelialisierung. Vierundzwanzig Stunden nach der Verletzung wurde die Aorta wie angegeben und unterzog Immunzytochemie en face seziert. Verwendung von Fibrinogen als Marker für Denudation Verletzung, eine hoch reproduzierbare Verletzung wird in (A) beobachtet , mit einer mittleren Denudation Bereich von 0,81 mm 2 (n = 6). Bilder mit höherer Auflösung zeigen , dass die Wundrand weist Fibrinogen - Färbung und Migration von endothelialen Zellen (Pfeile, lila Färbung) (B) im Vergleich zu unbeschädigten Endothel (C). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1:. Operative und postoperative Mortalität Insgesamt 85 Mäuse Underwent Überleben infrafrenal Bauch-Aorten-Spannen mit einer Überlebensrate von 85,9%. Acht Mäuse (9,4%) nicht überlebt Operation wegen Darmblutungen oder große Gefäßperforation. Vier Mäuse starben postoperativ.
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Discussion
Arterielle denudation Verletzungen durch perkutane Eingriffe, wie der Ballon - Angioplastie und Gefäss - Stents, führen in der frühen und späten Gefäßthrombose und Restenose und trägt zur rezidivierende ischämische Ereignisse 3,12. Interessanterweise hat chirurgische Gefäßklemm auch als Ursache für arterielle denudation gebracht worden, das Ausmaß des Problems zu Patienten erweitern jede vaskuläre Verfahren unterziehen, ob die perkutane oder offen 13. Während beeinträchtigt Reendothelialisierung eine ziemlich anerkannte Ursache von Thrombose und Restenose ist, wurden die molekularen Mechanismen Reendothelialisierung umgebenden schwierig zu erläutern. Tiermodelle haben eine Notwendigkeit zu gewinnen weitergehendes Verständnis der Re-Endothelialisierung nach einer arteriellen denudation Verletzung werden.
Tiermodelle bestehenden die zellulären und molekularen Effekte der arteriellen Verletzung Denudation zu studieren , umfassen die in Schweinen, Kaninchen und Nagetier 7,9-11. nagetier models verwendet häufig die Ratte A. carotis Ballonverletzung Modell umfassen, 14,15 mit der Maus Draht Verletzungsmodell und Ratte und Maus Ligatur Modelle. Während die Ratte carotis ist Arterie Ballonverletzung Modell das am besten charakterisierte und am häufigsten verwendeten, haben die Carotis Verletzungen Verfahren , die von Lindner in Mäusen 16,17 die Möglichkeiten der Verwendung von transgenen Linien erweitert. Genetisch veränderte Mausmodelle verringert das Auftreten von potentiellen Nebeneffekte und Probleme Spezifität mit pharmakologischen Inhibitoren verbunden sind, und kann für gewebespezifische und bedingte Ablation bestimmter Elemente von Interesse erlauben. Dennoch in der Maus Carotis Verletzung ist äußerst anspruchsvoll und schwierig durchzuführen.
Das murine arterielle Denudation Modell der infrarenalen Abdominalaorta hier beschrieben ist relativ einfach anzuwenden und ermöglicht Untersuchungen der Reendothelialisierung eines großkalibrigen Arterie in vivo. Operationen zeigte eine akzeptable surLebensrate von 85,9%. Wundlänge ist abhängig von der Klemmbacke Dimension, Stärke der Klemme drücken, und die Länge der Zeit, die Gefäßklemme wird das Gefäß verschließt. Dieses Modell verwendet einen 10 x 1,75 mm Backen Dimension und "stark" Klammer drücken für 1 min ein 0,88 mm 2 denudation Verletzung zu erzeugen , die in hohem Maße reproduzierbar ist. Variability in Wundlänge wurde mit verschiedenen Backenmaß und Länge der Gefäßverschluss beobachtet. Darüber hinaus kann der Bereich der Abtragung durch serielles erweitert werden, um den infrarenalen Aorta abdominalis von rostral nach caudal festzuklemmen. Als solches bietet dieses Modell Vielseitigkeit in Größe denudation Verletzung, die einem die manipuliert werden können, um fit Studie soll.
Zum Ausmaß der Schädigung und endothelialen Raten Schließung nach einer Verletzung beurteilen, Immunzytochemie wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit Antikörpern, die gegen β-Catenin zu identifizieren endothelialen Zellverbindungen oder ERG zu identifizieren endothelialen Zellkerne und Fibrinogen zu identifizieren t durchgeführter verletzte Stelle. Wie Reendothelialisierung auftrat, wurde Fibrinogen-Färbung verwendet, um die ursprüngliche Verletzung im Vergleich zum Ausmaß der Re-Endothelialisierung zu identifizieren. Während die starke Färbung von Fibrinogen signifikant nach Nachwachsen des Endothels abgeschwächt wird, bleibt eine ausreichende Intensität der ursprünglichen Verletzung selbst nach mindestens 4 Tage nach der Operation zu identifizieren.
Dieses Modell ist nicht ohne Einschränkungen. Wie bei jedem Tiermodell erfordert murine Chirurgie gute chirurgische Technik und bringt eine Lernkurve. Mäuse können schnell Gefäßperforation erliegen, wenn dissection nicht mit Sorgfalt durchgeführt, die manchmal unmöglich ist, zu steuern. Die häufigsten Ursachen für operative Tod enthalten Darm-Blutungen und große Gefäßperforation, bei 5,9% bzw. 3,5% betragen. Doch mit sorgfältig seziert, Blutungen ist selten und Blutverlust kann in der Regel unter 0,1 ml in unserer Erfahrung gehalten werden. Darüber hinaus ausreichende Dissektion der Aorta und die richtige KlammerPlatzierung ist integral auf einer reproduzierbaren Verletzung. Während distale Aorten Pulsatilitäts Prüfung kann vollständig Aortenokklusionsvorrichtung bestätigen verwendet werden, die alle anhaftenden retroperitoneale Gewebe an der Aorta zu entfernen, ist von entscheidender Bedeutung für eine saubere, ununterbrochene Wunde zu erhalten. Wie bereits erwähnt, wird eine Beschädigung der Tunica media mit diesem Verfahren der Aorten Klemmfestgestellt. Jedoch ist medialen glatten Muskulatur Tod eine bekannte Folge der verlängerten oder chronischen Gefäß Ausdehnung durch Stent - Implantation, und die Ergebnisse in nachfolgenden neointimale Hyperplasie 18. Medial Schaden in unserem Modell nicht erscheint pathologische Folgen haben, da wir keine postoperativen Tod und diese Mäuse haben haben postoperativ zu 2 Monate überlebt auf.
Wir präsentieren ein vielseitiges Mausmodell der arteriellen denudation Verletzung der infraBauchAorta, die mit guten Überlebensraten reproduzierbar ist. Dieses Modell schließt eine Notwendigkeit für Arterienverletzung mit einer Vielzahl von transgenen Mausmodellen studiert. Adoption of murine diesem Modell kann die molekularen Mechanismen der Reendothelialisierung unter normalen und pathologischen Bedingungen zu erläutern verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Eli und Edythe Broad Center of Regenerative Medizin unterstützt und Zellforschung an der UCLA-Trainingsprogramm zu ASS und AIM, Philip J. Whitcome Fellowship AIM Stem und National Institutes of Health (HL130290) zu MLIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Discovery.V12 Stereomicroscope | Zeiss | 495037-9904-000 | |
| Rodent Heated Surgical Platform | Protech International | RES4000 | Heated platform for body temperature maintenance with nosecone for anesthestic maintenance and on which surgical procedure is performed |
| Isoflurane | Henry Schein | 50033 | 4% Induction; 2.5% Maintenance |
| Isoflurane Vaporizer | Summit Medical Equipment | 470062 | |
| Stryker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Carprieve (Carprofen) | Norbrook Laboratories | NDC 55529-131-01 | |
| Oster™ A5 Professional Animal Clipper | M.Schneider & Sons Inc. | 78005010 | Use with animal clipper size 40 |
| Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | |
| Schwartz Micro Serrefines - Sharp Bend | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | sharp dissecting forceps, blunt forceps, fine scissors, spring scissors, hemostat | |
| 0.5% Marcaine | Hospira | 0409-1610-50 | |
| 5-0 Suture, Vicryl | Fisher Scientific | NC0189890 | tapered needle |
| Vetbond | Fisher Scientific | NC0304169 | |
| Falcon® 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Dissecting pins | Fisher Scientific | NC9681411 |
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