Summary
הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של מחדש endothelialization בעקבות פציעת denudation העורקת היא בעלת חשיבות עליונה במניעה פקק restenosis של עורקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול בגין נזקי denudation עורקי לשחזור של אבי העורקים הבטני. הנוהל פותח כדי לחקור את המנגנונים מווסתים התחדשות האנדותל באמצעות מודלי עכבר.
Abstract
התערבויות וסקולרית מלעורית לגרום באופן אחיד פציעות denudation עורקים כי לאחר מכן לגרום לפקקת ו restenosis. סיבוכים אלה ניתן לייחס ליקויים מחדש endothelialization בתוך שולי הפצע. עם זאת, המנגנונים התאיים ומולקולריים של מחדש endothelialization להישאר שיוגדרו. בעוד כמה מודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחדש endothelialization לאחר denudation העורקים זמינים, כמה בוצע העכבר בשל מגבלות כירורגית. זה מערער את ההזדמנות לנצל קווי עכבר מהונדסים לחקור את התרומה של גנים ספציפיים לתהליך מחדש endothelialization. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול ליצירת מודל בעכברים לשחזור ביותר של פגיעת denudation עורק באב העורקים הבטני באמצעות הידוק וסקולרית חיצונית. מכתים Immunocytochemical של aortas פצוע פיברינוגן β-קטנין להדגים את החשיפה של משטח פרו-תרומבוטייםד גבול האנדותל שלם, בהתאמה. השיטה המוצגת כאן יש את היתרונות של מהירות, שיעור ההישרדות הכולל מעולה, וקלות טכנית יחסית, יצירת כלי מעשי ייחודי להטלת פציעה denudation עורקים במודלים עכבר מהונדס. באמצעות שיטה זו, החוקרים עשויים להבהיר את המנגנונים של מחדש endothelialization בתנאים רגילים או פתולוגי.
Introduction
פקקת ו restenosis הם סיבוכים בשלבים מוקדמים ומאוחרים רציני בחולים שעברו התערבויות וסקולרית מלעורית, כגון אנגיופלסטיקה בלון endovascular ו סטנט 1,2. אסטרטגיות כמה כבר מועסק על מנת לטפל סיבוכים אלה, במיוחד טיפול אנטי טסיות כפול סטנטים משחררי תרופה. עם זאת, התמקדות קצת הושמה על הסיבה הבסיסית של פקק restenosis, כלומר הפסד של כיסוי תא האנדותל (denudation). פציעת denudation היא תוצאה בלתי נמנעת של טיפולים פולשניים עקב טראומה מכאנית אל דפנות כלי דם. טראומה מכאנית זה יכול לגרום ניזק והסרה של שכבת האנדותל המגן וחשיפה של קרום מרתף שריר חלק בכלי דם כדי מחזורי דם 3. ההפסד של תאי אנדותל באזורים אלה יוצר סביבה פרו-תרומבוטיים ופרו-דלקתית שלא רק מקדם הידבקות טסיות פקק עוקבים, אלאסימפוני יוצר הגירה ושגשוגם של תאי שריר חלק בכלי דם וכתוצאה מכך עיבוי neointimal ו restenosis 4. סיבוכים אלה, וטיפולים הקשורים בהם, להוביל תחלואה משמעותית, רוב הישנות המחלה איסכמי בעיקר ואירועים דימום המשפיעים על בריאות האדם.
Re-endothelialization הפגיעה הערומה משולי הפצע הוא בעלת חשיבות עליונה במניעה פקק restenosis 5. תוצאות נתיחה ומודלים של בעלי החיים הוכיחו משיעורי מס מופחתים ביעילות של פקק עם כיסוי של סטנט תמוך 6,7. סמים משחררי סטנטים, המציאו כדי להקטין שיעורי restenosis ידי עיכוב התפשטות שרירי חלקי היפרפלזיה neointimal, לגרום ליקויים משמעותיים עורקים מחדש endothelialization ושיעורי גדל והולך של פקק מאוחר 3. למרבה הצער, בהבנת המנגנונים מחדש endothelialization כבר תהליך איטי, מוגבל במידה רבה על ידי חוסר apבמודלים של בעלי חיים propriate 8.
במודלים של בעלי חיים כמה להבנת התפקידים לתאי אנדותל ותאי שריר חלק בכלי דם בעקבות פציעת עורקים נוצרו 7,9,10. המודל פציעה בלון עורק התרדמה עכברוש הוא מאופיין הטוב הועסק כדי לחקור את ההשפעות של פגיעה denudation ברמה ברוטו, תאית ומולקולרית 11. אף על פי כן, מודל בעכברים לשחזור ביותר של פגיעת denudation עורקים עם שיעורי הישרדות מעולים חסר הרבה צורך לנצל קווים מהונדסים מרובים לרשות להבהיר התחדשות כלי דם טוב יותר במסגרות מרובות.
כתב יד זה מציג מודל Murine של פציעת denudation עורקים כי ניתנת לשחזור וקלות לביצוע. הגישה הוכיחה תחלואה ותמותה מינימאליות בכמה קווים מהונדסים. בגלל מספרם הרב רחב של קווי עכבר מהונדס גנטית, מודל זה עשוי לשמשמחדש endothelialization להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס לאחר פציעה denudation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.
1. הכנה לפני ואחרי ההרדמה
- הקפידו למלא אחר טכניקה סטרילית לאורך כל ההליך.
- לעקר את כל הציוד כירורגי באמצעות חיטוי קיטור.
- הפעל פלטפורמה כירורגית מכרסם מחומם לפני אינדוקצית הרדמה, כך שהוא עשוי לחמם לטמפרטורה המתאימה (37 מעלות צלזיוס) ומניח תחת סטראו להדמיה במהלך הליך הכירורגי.
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה ולגרום עם isoflurane 4% בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה.
- בזהירות לפקח על צבע עור קצב שודד הנשימה של עכבר במהלך אינדוקציה.
- לאחר ההאטה של קצב הנשימה, להסיר את העכבר מאולם האינדוקציה ומניח על משטח מחומם להכנה כירורגית עם פנים בריכוז isoflurane nosecone ותחזוקה נפרד של 2.5%.
- בצע קמצוץ הבוהן להעריך הלימות של הרדמה.
- החל משחת עיניים כדי הקרניות ולנהל carprofen לפני הניתוח (5 מ"ג / ק"ג) תת עורי.
- המקום העכבר קוצץ פרקדן ושימוש להסרת שיער מהבטן.
- מכינים את אזור הניתוח עם שלושה עלובי לסירוגין של יוד povidone ואלכוהול איזופרופיל 70% מיושם עם פדי גזה סטרילי.
- מקום עכבר פרקדן על פלטפורמה כירורגית מחוממת מכרסם עם פן nosecone ולאבטח את כל הגפיים ובזהירות מיקום עכבר כך הבטן גלויה עם סטראו.
- מניח תחבושות סטריליות, דבק לאורך כל קצה של אזור הניתוח המוכן.
- לכייל ריכוז isoflurane לשמור הרדמה נאותה במהלך ניתוח תוך שמירת נשימות ספונטניות.
Clamping 2. infrarenal אבי העורקים
- ביצוע חתך 3 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן באמצעות אזמל, החל approximately 0.5 סנטימטרים נחים בתהליך xiphoid.
- בעדינות לחזור בו העור עם מלקחיים לנתח עור מקיר הבטן באמצעות מספריים בסדר לחתוך את רקמת חיבור בסדר.
- החל 0.05-0.1 מ"ל של bupivacaine 0.5% אל הקיר שריר ולעשות חתך 2 ס"מ לתוך דופן הבטן לחשוף את אברי הבטן.
- אם הדימום מתרחש לאורך דופן הבטן, להפעיל לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצהו.
- הרם בעדינות את המעיים באמצעות applicators מלוחים ספוג כותנה שקצהו.
הערה: היזהר, כדי למנוע טראומה קהה אל jejunal ועורק ileal ומניח על ספוג גזה חם, סטרילית ספוגה מלוחה מחוץ חלל הבטן.- מכסה את המעיים עם אחר ספוג גזה חם, סטרילי מלוח ספוגה כדי למנוע אובדן לחות.
- מניחים מפשק כדי lateralize פי הטבעת ולחשוף את retroperitoneum.
- מניח פדה גזה קטנה לפי צורך להדמיה של retroperitoneאממ שמירה על מסלול של מספר בשימוש.
- ברמה של הקוטב הנח בכליה הימנית, להשתמש במלקחיים לנתח חדה לבצע retroperitonotomy לרוחב האאורטה.
הערה: היזהר שלא לפצוע את הווריד הנבוב הנח או כלי שמסביב.- בבוטות לנתח רקמות retroperitoneal את אבי העורקים נזהר שלא לנקב את הווריד הנבוב הנח או כלי דם שמסביב.
- מניחים את מהדק וסקולרית מעל האאורטה דקות לפחות 1, או זמן מוגדר אחר, ולאמת חסימה על ידי התבוננות ויזואלית חוסר pulsatility ב אבי העורקים דיסטלי.
- הסר את המהדק וסקולרית ולאמת המוסטאסיס. המוסטאסיס מושגת ומובטח כשאף extravasation פעיל דם נתפס.
- אשר extravasation על ידי הוספת מלח 0.5 מ"ל לתוך חלל הבטן והערכת אם מלוחים הופך יותר ויותר מעורב בדם. אם זה מקרה, להפעיל לחץ עדין באמצעות מוליך ספוג מלוח דקות 1 כדי להבטיחהמוסטאסיס.
- הסר פדי גזה להציב כדי לסייע להדמיה של retroperitoneum ולהחליף המעיים באתרו לתוך הבטן.
- להשקות את חלל הבטן באמצעות מי מלח מחומם מראש סטרילית.
סגירת 3. laparotomy ועור
- סגור את שכבת השריר בדופן הבטן באמצעות 5-0 קלוע, תפר ריצה אחת נספגים.
- עור הדוק עם 1-3 טיפות של דבק פולימרים ואז לאחר מכן עם קליפים פצע פעם הדבקה מוגדר.
שחזור 4. והערכה לאחר הניתוח
- מעבירים את העכבר לכלוב ההתאוששות על כרית חימום עם מזון ומים על רצפת הכלוב.
- לעקוב מקרוב אחר העכבר כדי לגלות סימני מצוקה נשימתית. נהל carprofen (5 מ"ג / ק"ג) על בסיס יומי במשך 48 שעות לאחר הניתוח בהתאם להנחיות המוסד.
- אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור recum sternalbency.
- החזר את העכבר בכלוב רגיל עם מזון ומים.
- אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
- להעריך פצע על בסיס יומי במשך בקיעה ולהסיר קליפים על יום לאחר ניתוח 14.
5. אבי העורקים דיסקציה מכתים
- עכברים בוחרים להקרבה מבוססת על נקודת הזמן הספציפית של עניין בעקבות פציעת denudation.
- קורבן עכברים באמצעות שאיפת isoflurane ומייד להזריק עם כלוריד methacholine 5 מ"ג לגרום הרפית שריר חלק בכלי דם.
- עם האישור למוות על ידי הפסקת נשימה, חוסר רפלקס המצמוץ וחוסר התנועה, perfuse עם 4% paraformaldehyde ב בופר פוספט בלחץ זלוף של 100 מ"מימ כספי דרך חדר הלב השמאלי למשך 10 דקות.
- השתמש סטראו לנתח כדי להפריד את אבי העורקים בבטן שלם בקפידה מתוךהרקמות הסובבות.
- Transect מקורה אב העורקים אל עורקי כליות ואת הזנב אל הסתעפות הכסל ופתח דרך חתך אורכי לאורך השטח הגבה.
- הצמד את אבי העורקים שטוח על צלחת מצופה סיליקון 35 מ"מ עם הצד luminal עד לקיבוע עבור לא פחות מ -2 שעות אך לא יותר מ -12 שעות. בהמשך לכך, הרקמה יכולה להיות מוטבע גם עבור חתך או בשימוש אן-פאס כל ההר immunocytochemistry.
- הר מוכתם aortas עם הצד luminal מול coverslip על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שמונים וחמש עכברים שעברו את טכניקת הישרדות כירורגית המתוארים בדוח זה עבור ההידוק אבי העורקים הבטני. שיעור ההישרדות הכולל עמד על 85.9%. סיבוכי Operative כללו דימום פנימי ו ניקוב כלי גדול, וכתוצאה מכך תמותת 5.9% ו -3.5% בהתאמה (לוח 1). לאחר התאוששות מן ההרדמה, עכברים ללכת כרגיל לא מראים סימנים של פגיעה איסכמית לגפיים הנחים. אין ירידה במשקל או חוסר התיאבון צוינה.
איורים 1 א ותמונות 1B המופע של אבי העורקים הבטני הבאים laparotomy ו לנתיחה retroperitoneal תחת סטראו ללא (א) ועם (B) clamping אבי העורקים. כפי שניתן לראות, הוא חיוני, כדי להדק את רוחב האאורטה בשלמותו על מנת להבטיח denudation לרוחב של אב העורקים. הפרוטוקול שלנו מצא כי באמצעות עיקול חד שוורץ מיקרו Serreקנסות עם רוחב לסת של 1.75 מ"מ ו 'חזקה' עיתונות מהדק הפיקו את הפצע הרציף הגדול לרוחב כל של אב העורקים עם זמן מהדק מינימאלי. עם זאת, מלחציים אחרים נבדקו במרווחי זמן כמה חסימה עם גדלים משתנים פציעה (איור 1 ג). שאר התוצאות שהוצגו הופקו באמצעות המהדק שהוזכר לעיל.
הערכה היסטולוגית של האאורטה מדגים denudation המלא של רירית האנדותל עם נזק בינוני עד שכבת התאים שריר חלק הבסיסית כפי שהוכח על ידי H & E מכתים. Denudation של האנדותל מתרחש הוא 10 שניות ו -10 דקות, אם כי בדרגות שונות (איור 2). כדי לקבוע את מרווח clamping זמן אאורטלי האופטימלי הנדרש עבור denudation עורקים מלא, עכברים שעברו clamping במשך 10 שניות, 1 דקות ו -10 דקות ו הוקרבו מייד לניתוח כמתואר בפרוטוקול לעיל. כולל אתא denudation גדל עם הגדלת תזמונים מהדקים (איור 3). ב 10 שניות, פציעה denudation שלם בלתי סדיר של כ 0.75 מ"מ 2 זוהה על ידי מכתים פיברינוגן בלתי סדיר, שבו פיברינוגן משמש כסמן בגין נזקי denudation. עשר דקות של clamping אבי העורקים מיוצר אזור אנדותל הערומים לחלוטין של כ 1.2 מ"מ 2, אולם זה משך הזמן של clamping נחשב בסיכון גבוה איסכמיה איבר ופציעה reperfusion. ככזה, אנו רואים 1 דקות של clamping אב העורקים מספיק, אשר מיוצר באזור 0.88 מ"מ 2 של denudation בממוצע, כדי לגרום לפגיעת denudation עורקי ליד שלמה בלי ראיות של פגיעה איסכמית.
מידת הפגיעה denudation עם 1 דקות של clamping אבי העורקים ניתנת לשחזור מאוד, ייצור בקוטר 600 מיקרומטר ו 0.88 מ"מ 2 אזור של denudation (איורים 3 ו -4). העוצמת מכתים פיברינוגן מספיקה כדי לזהות את הפציעה המקורית בנקודות זמן מאוחר יותר. איור 4 מראה מכתים פיברינוגן של שלושה עכברים שעברו 1 דק 'של אבי העורקים clamping 24 שעות לפני להקריב, יצירת פגיעה מאוד לשחזור. מדידה של פיברינוגן מכתים 24 שעות לאחר פציעה של שישה aortas הוא כ 0.81 מ"מ 2 (איור 5 א), סטטיסטית דומה הפגיעה 0.88 מ"מ 2 ציין מיד לאחר פציעה (p = 0.14). לעומת האנדותל וללא כל פגע, הפצע שולי 24 שעות אחרי מופעי פציעת תאים נודדים אנדותל עם מכסה מכתים פיברינוגן, סימון מחדש endothelialization לתוך פציעת denudation (איור 5). בממוצע, מחדש endothelialization המלא של פגיעת denudation 0.88 מ"מ 2 לקח בערך 3 ימים. עם זאת, גישה זו ניתן להתאים עוד יותר לייצר פציעות denudation גדולות עוד יותר. הידוק מספר פעמים, כלדקות 1, מ מקורי כדי הזנב לאורך האאורטה infrarenal מיוצר פגיעת denudation 2 3.7 מ"מ. למרות שגישה זו גם פוגעת תקשורת Tunica, אנחנו אף פעם לא הבחנו דיסקציה של אב העורקים בבטן כתוצאה של פגיעת המהדק.
פרוטוקול זה מוכיח כי ההידוק אבי העורקים הבטני יכול להתבצע בבטחה במודל בעכברים לצורך יצירת פציעה denudation עורקי ומדידת התחדשות האנדותל.
איור 1:. Isolated infrarenal בטן האאורטה אבי העורקים הבטני מבודד מוצג ללא (א) ועם (B) מלחציים וסקולרית. מלחציים כמה באורכים שונים וכוח העיתונות מהדק שימשו כדי לבחור את אחד המציע פגיעה עקבית (C). מיקרופון שוורץ ro Serrefine (חץ), העלה את הפצע רציף הגדול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: יעילות של האנדותל denudation H & E מכתים של קטע אבי העורקים הבטני בעכבר שאינו נפגע (א) ואחרי 10 שניות (ב) ו -10 דקות של clamping אבי העורקים (C).. דם clamping denudes אנדותל שכבת לחלוטין, כפי שניתן מאומת על ידי בהעדר מכתים גרעינים. גם אובדן של גרעיני תאי שריר חלק תערוכות ניזק לכלי תקשורת Tunica. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גיל = "1"> 
איור 3:. הקשר של קלאמפ זמן לפצוע אורך ההידוק אבי העורקים הבטני בוצע במשך 10 שניות, 1 דקות ו -10 דקות. מייד לאחר פציעה, immunocytochemistry בוצע אן-פאס עבור ניתוח דמה ונקודות זמן אלה כמוצגים (א) ו ברזולוציה גבוהה יותר (B). פיברינוגן (בסגול) מזהה את האזור של פציעה. β-קטנין (באדום) מזהה גבולות אנדותל. הכוכבית (*) מסמנת את מקום יישום מהדק. העדר β-קטנין מציין חוסר בתאי האנדותל באזור הפציעה. (C) משתמשת מכתים פיברינוגן כסמן של אזור הפציעה denudation להראות כי הגדלת זמן clamping מגביר אזור denudation (n = 2 עבור כל נקודת זמן). ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. אנא לחצו here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. זיהוי של פינת פגיעה שעות עשרים וארבע הבאים ההידוק אבי העורקים במשך דקה 1, אבי העורקים היה גזור ופצע לחשוף את הגלימה הפנימית. לאחר קיבוע paraformaldehyde 4%, immunocytochemistry בוצעה אן-פאס. פיברינוגן (בסגול) מזהה את האזור של פציעה (א). הגדלה גבוהה של שולי הפצע (B) ובתוך הפצע (C) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: שחזור של denudationפגיעה וזיהוי מחדש endothelialization. עשרים וארבע שעות לאחר הפגיעה, אבי העורקים היה גזור כמו immunocytochemistry כאמור ועבר אן-פאס. באמצעות פיברינוגן כסמן פציעה denudation, פגיעה לשחזור ביותר הוא ציין (א) עם פינת denudation ממוצעת של 0.81 מ"מ 2 (n = 6). בתמונות בעלות רזולוציה גבוהות להראות כי מכתים פיברינוגן מייצג שולי פצע ותאי האנדותל נודד (חיצים, מכתים סגול) (B) לעומת האנדותל וללא כל פגע (C). ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1:. Operative ולאחר הניתוח תמותה סך של 85 עכברים underwהידוק infrafrenal בטן אאורטלי הישרדות אף אוזן גרון עם שיעור הישרדות של 85.9%. שמונה עכברים (9.4%) לא שרדו ניתוח בשל דימום במערכת העיכול או ניקוב כלי נהדר. ארבעה עכברים מתו לאחר ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denudation עורקי פגיעה בגוף עקב התערבות מלעורית, כגון אנגיופלסטיקה בלון סטנט בכלי הדם, לגרום פקקת בכלי הדם המוקדמת והמאוחרת ו restenosis ותורם אירועים איסכמיים חוזרים 3,12. מעניין, clamping וסקולרית כירורגית גם היה מעורב כגורם denudation העורק, הרחבת היקף הבעיה לחולים שעברו כל הליך וסקולרית, אם מלעורית או פתוח 13. בעוד מחדש endothelialization הלקוי הוא גורם מוכר למדי של פקק restenosis, המנגנונים המולקולריים שמסביב מחדש endothelialization היו קשים להבהיר. במודלים של בעלי החיים הפכו הכרח להשיג הבנה נוספת של מחדש endothelialization בעקבות פציעת denudation עורקת.
קיימים מודלים של בעלי חיים כדי לחקור את ההשפעות התאיות ומולקולריות של פציעת denudation העורקת כוללים אלה חזירים, ארנב מכרסם 7,9-11. mod מכרסמיםאלס שימוש תכוף כוללים מודל פציעת בלון עורק תרדמת חולדה, מודל פציעת מניפולטורי עכבר, חולדה ומודלי עכבר קשירת 14,15. בעוד מודל פציעת בלון עורק תרדמת העכברוש הוא מאופיין ביותר והנפוץ ביותר, הליכי פציעת תרדמה שתארו לינדנר בעכברים הרחיבו את האפשרויות של שימוש זנים מהונדסים 16,17. גנטי במודלים של עכברים מהונדסים ירד שכיחות תופעות פוטנציאל מחוץ יעד ונושאים ספציפיים הקשורות מעכבים תרופתיים, ואולי ייאפשרו רקמות ספציפי אבלציה מותנית של אלמנטים ספציפיים של עניין. עם זאת, פגיעת תרדמה בתוך העכבר היא מאוד מאתגרת וקשה לבצע.
המודל denudation עורקים בעכברים של אבי העורקים הבטני המתואר כאן הוא יחסית קל ליישום מאפשר לימודים של מחדש endothelialization של עורק קליבר גדול in vivo. ניתוחים הציגו sur מקובלשיעור vival של 85.9%. אורך פצע תלוי ממד הלסת המהדקת, כוח של העיתונות מהדק, ואת משך הזמן מהדקים כלי הדם הוא הגורם לחסימת הספינה. מודל זה משתמש ממד לסת מ"מ 10 x 1.75 מהדק עיתונות 'חזקה' עבור 1 דקות כדי לייצר פגיעת denudation 0.88 מ"מ 2 כי הוא מאוד לשחזור. משתנה הן אורך פצע נצפה עם ממדי לסת שונים ואורך חסימת כלי. בנוסף, באזור של denudation ניתן להרחיב באופן סדרתי על ידי כיווץ אבי העורקים הבטני מ מקורי כדי הזנב. ככזה, דגם זה מציע צדדי בגודל פציעת denudation שעשוי להיות מניפולציות כדי להתאים המחקר של אחד שואף.
כדי להעריך היקף שיעורי סגירת פציעה אנדותל בעקבות פציעה, immunocytochemistry בוצע בנקודות זמן שונות עם נוגדנים שהועלו כנגד β-קטנין לזהות צמתי תא האנדותל או ERG לזהות גרעיני תאי האנדותל פיברינוגן לזהות tהוא נפגע באזור. כפי מחדש endothelialization התרחש, מכתים פיברינוגן שימש לזיהוי הפציעה המקורית בהשוואה להיקף מחדש endothelialization. בעוד המכתים החזק של פיברינוגן מוחלש באופן משמעותי לאחר לצמיחה מחודשת של האנדותל, נותר די עצמה כדי לזהות פציעה המקורית גם לאחר 4 ימים לאחר ניתוח לפחות.
מודל זה אינו נטול מגבלות. כמו בכל מודל חיה, ניתוח בעכברים דורש טכניקה כירורגית טובה כרוך עקומה למידה. עכברים יכולים להיכנע כלי ניקוב במהירות אם לנתיחה לא מבוצעת בזהירות, שהוא לפעמים בלתי אפשרי לשלוט. הסיבות השכיחות ביותר למוות פעיל כללו דימום מעי ניקוב כלי נהדר, על 5.9% ו -3.5%, בהתאמה. עם זאת, עם דיסקציה זהירה, דימום נדיר איבוד דם יכול בדרך כלל להיות כל הזמן מתחת ל 0.1 מ"ל מניסיוננו. בנוסף, דיסקציה נאותה של אבי העורקים ואת מהדק הולםמיקום המהווה חלק בלתי נפרד פגיעה לשחזור. תוך בחינת pulsatility דיסטלי אב העורקים ניתן להשתמש כדי לאשר חסימת אב עורקים מלאה, הסרת כל חסיד הרקמות retroperitoneal אל אב העורקים חיוני לקבלת פצע נקי, ללא הפרעה. כאמור, פגיעה בתקשורת Tunica יצוין עם הליך זה של clamping אבי העורקים. עם זאת, מותו של שריר חלק המדיאלי היא תוצאה ידועה של הרחבת כלי דם ממושך או כרונית עקב השתלת סטנט, ותוצאות היפרפלזיה עוקב neointimal 18. נזק המדיאלי במודל שלנו לא נראה שיש סיבוכים פתולוגיים, כמו שיש לנו לא מוות לאחר הניתוח ועכברים אלה שרדו עד 2 חודשים לאחר הניתוח.
אנו מציגים מודל בעכברים צדדי של פציעת denudation העורקת של האאורטה הבטני כי ניתנת לשחזור עם שיעורי הישרדות טובים. מודל זה ממלא צורך ללמוד פציעת עורקים עם שפע של דגמי עכבר מהונדסים. אימוץ of מודל בעכברים זו ניתן להשתמש על מנת להבהיר את המנגנונים המולקולריים של מחדש endothelialization בתנאים נורמליים פתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של אלי Edythe Broad מרכז לרפואה רגנרטיבית גזע המחקר בתאי ב תכנית אימונים UCLA כדי ASS ו- AIM, פיליפ ג 'Whitcome אחוות ל- AIM, ו- National Institutes of Health (HL130290) כדי MLIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Discovery.V12 Stereomicroscope | Zeiss | 495037-9904-000 | |
| Rodent Heated Surgical Platform | Protech International | RES4000 | Heated platform for body temperature maintenance with nosecone for anesthestic maintenance and on which surgical procedure is performed |
| Isoflurane | Henry Schein | 50033 | 4% Induction; 2.5% Maintenance |
| Isoflurane Vaporizer | Summit Medical Equipment | 470062 | |
| Stryker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Carprieve (Carprofen) | Norbrook Laboratories | NDC 55529-131-01 | |
| Oster™ A5 Professional Animal Clipper | M.Schneider & Sons Inc. | 78005010 | Use with animal clipper size 40 |
| Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | |
| Schwartz Micro Serrefines - Sharp Bend | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | sharp dissecting forceps, blunt forceps, fine scissors, spring scissors, hemostat | |
| 0.5% Marcaine | Hospira | 0409-1610-50 | |
| 5-0 Suture, Vicryl | Fisher Scientific | NC0189890 | tapered needle |
| Vetbond | Fisher Scientific | NC0304169 | |
| Falcon® 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Dissecting pins | Fisher Scientific | NC9681411 |
References
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4, 195-205 (2011).
- Tada, T., et al. Risk of stent thrombosis among bare-metal stents, first-generation drug-eluting stents, and second-generation drug-eluting stents: results from a registry of 18,334 patients. JACC Cardiovasc Interv. 6, 1267-1274 (2013).
- Otsuka, F., et al. The importance of the endothelium in atherothrombosis and coronary stenting. Nat Rev Cardiol. 9, 439-453 (2012).
- Kipshidze, N., et al. Role of the endothelium in modulating neointimal formation: vasculoprotective approaches to attenuate restenosis after percutaneous coronary interventions. J Am Coll Cardiol. 44, 733-739 (2004).
- Finn, A. V., et al. Pathological correlates of late drug-eluting stent thrombosis: strut coverage as a marker of endothelialization. Circulation. 115, 2435-2441 (2007).
- Joner, M., et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk. J Am Coll Cardiol. 48, 193-202 (2006).
- Joner, M., et al. Endothelial cell recovery between comparator polymer-based drug-eluting stents. J Am Coll Cardiol. 52, 333-342 (2008).
- McDonald, A. I., Iruela-Arispe, M. L. Healing arterial ulcers: Endothelial lining regeneration upon vascular denudation injury. Vascul Pharmacol. 72, 9-15 (2015).
- Fingerle, J., Tina Au, Y. P., Clowes, A. W., Reidy, M. A. Intimal Lesion Formation in Rat Carotid Arteries after Endothelial Denudation in Absence of Medial Injury. Arteriosclerosis. 10, 1082-1087 (1990).
- Granada, J. F., et al. Vascular response to zotarolimus-coated balloons in injured superficial femoral arteries of the familial hypercholesterolemic Swine. Circ Cardiovasc Interv. 4, 447-455 (2011).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods Mol Med. 139, 1-30 (2007).
- Bavry, A. A., Bhatt, D. L. Appropriate use of drug-eluting stents: balancing the reduction in restenosis with the concern of late thrombosis. Lancet (London, England). 371, 2134-2143 (2008).
- Gucu, A., et al. Effects of temporary vascular occluder poloxamer 407 Gel on the endothelium. J Cardiothorac Surg. 8, (2013).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297, 1535-1543 (2009).
- Lindner, V., Fingler, J., Reidy, M. A. Mouse Model of Arterial Injury. Circ Res. 73, 792-796 (1993).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hehrlein, C., Weinschenk, I., Metz, J. Long period of balloon inflation and the implantation of stents potentiate smooth muscle cell death. Possible role of chronic vascular injury in restenosis. Int J Cardiovasc Intervent. 2, 21-26 (1999).
