Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التمايز في المختبر من خلايا CD4 الإنسان + FOXP3 + المستحثة تنظيم الخلايا التائية (iTregs) من خلايا CD4 + T السذاجة باستخدام بروتوكول تحتوي على TGF-β-

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول الجيل استنساخه وphenotyping من صنع الإنسان خلايا T التنظيمية (iTregs) من خلايا CD4 + T ساذجة في المختبر. بروتوكولات مختلفة لتحريض FOXP3 تسمح لدراسة الظواهر iTreg محددة تم الحصول عليها مع البروتوكولات ذات الصلة.

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 + الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) قمع الخلايا المناعية الأخرى، وهي سطاء الحرجة من التسامح الطرفية، ومنع المناعة الذاتية والمفرط التهاب 1. ومن الأمثلة على أهمية Tregs من الأمراض التي تصيب البشر العاشر مرتبطة immunodysregulation polyendocrinopathy الأمعاء متلازمة (IPEX)، الذي فقدان Tregs بسبب طفرات في `master' Treg عامل النسخ مربع forkhead P3 (FOXP3) يؤدي إلى أمراض المناعة الذاتية النظامية شديد، قاتلة في سن مبكرة. ومع ذلك، Tregs بمثابة سيف ذو حدين في الجهاز المناعي لأنها يمكن أن تعرقل أيضا الحصانة المضادة للورم في بعض الإعدادات 2. التلاعب العلاجي لعدد Treg وظيفة وبالتالي خاضعة للعديد من التحقيقات السريرية. في السرطان، يمكن أن استنزاف Tregs يكون من المرغوب فيه وبعض نجاح النهج السريرية يشجع المزيد من البحوث 3. في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات، بالإضافة إلى الآثار العلاجية من Tregs في سفنماذج المرض الماوس راؤول، مؤخرا أول التجارب في الرجل نقل Treg بالتبني لمنع graft- مقابل -host المرض (GvHD) 4-7، وتقييم السلامة في علاج مرض السكري نوع 1 8 أظهر نتائج واعدة جدا.

طبيعيا Tregs (nTregs) تشمل tTregs المستمدة التوتة وpTregs الناجم عن محيطي، مع وظائف أساسية غير زائدة عن الحاجة في الحفاظ على صحة 9-11. ومع ذلك، أرقام nTreg محدودة، وتشجيع نهج متكامل من حمل Tregs (iTregs) في المختبر من السذاجة السلائف الخلايا التائية 12. لا يزال استقرار iTregs، ويفترض نظرا لعدم وجود نزع الميثيل في ما يسمى منطقة demethylated Treg محددة (TSDR) في موضع FOXP3 الجين 13، لا يزال مصدر قلق وتشير العديد من الدراسات أن في الجسم الحي الناجم Tregs هي أكثر استقرارا 14.

حتى الآن، لا تزال FOXP3 أفضل بروتين مarker لTregs لكنها ليست محددة تماما لأن خلايا CD4 + T CD25- التقليدية الإنسان التعبير عن عابر المستويات المتوسطة من FOXP3 على تفعيل 15،16. على الرغم من إحراز تقدم كبير في توضيح تنظيم التعبير FOXP3، لا يزال هناك الكثير ليتم اكتشافه بخصوص تحريض والاستقرار وظيفة FOXP3 خاصة في الخلايا البشرية. وعلى الرغم من الاختلافات إلى nTregs، في المختبر يسببها FOXP3 + خلايا CD4 + T يمكن استخدامها كنظام نموذج لدراسة الآليات الجزيئية للتحريض FOXP3 وكنقطة انطلاق لوضع بروتوكولات في المستقبل التي تسمح لجيل من iTregs التي هي أكثر شبها في فيفو ولدت Tregs، التي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لاستراتيجيات نقل بالتبني في المستقبل.

ليس هناك `بروتوكول الذهب standard' للحث على iTregs البشري، وتم البروتوكولات الحالية مبنية على محاكاة الظروف Treg الذي يحفز في الجسم الحي: انترلوكين 2 (IL-2) وتحويل β عامل النمو (TGF-β) إشارات حاسمة لتحريض FOXP3 في الجسم الحي 17، وجميع العابر حمض الريتينويك (atra) - كثيرا ما يستخدم لتعزيز FOXP3 الاستقراء - الذي يتم انتاجه في الجسم الحي بواسطة الخلايا الجذعية المرتبطة الأمعاء في المختبر 18-21. لقد قمنا بتطوير بروتوكولات بشرية إضافية Treg الذي يحفز استخدام الزبدات 22 عاما، وهو مشتق الجراثيم-الأمعاء القصيرة سلسلة الأحماض الدهنية التي تم عرضها مؤخرا لزيادة الفئران Treg تحريض 23،24. نحن أيضا أنشأت مؤخرا بروتوكول جديد لجيل من iTregs مع وظيفة القمعية متفوقة في المختبر باستخدام مزيج من TGF-β، ATRA وrapamycin 22، وهذا الأخير هو الهدف الثدييات وافق سريريا من rapamycin (mTOR س) المانع أن يعرف لتعزيز صيانة FOXP3 أثناء البشرية Treg التوسع 25،26.

يصف هذا الأسلوب استنساخه فيجيل المختبر من خلايا CD4 الإنسان + FOXP3 + iTregs باستخدام مجموعة من الظروف المختلفة، وphenotyping في وقت لاحق من قبل التدفق الخلوي والكمي رد فعل عكسي سلسلة النسخ البلمرة (QRT-PCR) للكشف عن أنماط بروتوكول معين من التعبير عن FOXP3 وغيرها من Treg توقيع جزيئات هذه كما CD25، CTLA-4، EOS، وكذلك قمع الإنترفيرون γ وSATB1 التعبير 22. السكان الخلايا المتولدة يمكن استخدامها لالمقايسات الفنية بشأن النشاط القمعية أو الدراسات الجزيئية، سواء ما يتعلق المنظمين FOXP3 العامة أو لدراسة آثار محددة لبعض المركبات مثل الزبدات أو rapamycin. للمزيد من فهم الآليات الجزيئية القيادة Treg التمايز هو ذات أهمية كبيرة للنهج علاجية مستقبلية في المناعة الذاتية أو سرطان خصيصا لاستهداف جزيئات تشارك في توليد Treg وظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى الإنسان (PBMCs) تم عزل حديثا من مجهولة المصدر متبرع سليم المعاطف الشهباء شراؤها من مستشفى جامعة كارولينسكا في السويد. تم الحصول على تصريح الأخلاقي للتجارب من المجلس الإقليمي الأخلاقي الاستعراضي في ستوكهولم (Regionala etikprövningsnämnden ط ستوكهولم)، السويد (عدد موافقة: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. تي عزل الخلايا من الدم المحيطي

  1. PBMC العزلة
    1. قبل وضع 15 مل متوسطة الكثافة الطرد المركزي (مثل Ficoll) حل في 50 مل أنابيب (5 أنابيب في معطف الشهباء). قبل الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. تملأ معطف الشهباء مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (درجة حرارة الغرفة) إلى 180 مل. إذا تم استخدام دماء جديدة، وتمييع الدم مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني.
    3. أنبوب الميل إلى الجانب وتراكب ببطء متوسطة الكثافة الطرد المركزي مع ~ 35 مل مخففة الدم في أنبوب. إضافة الدم بعناية فائقة، دون أي اختلاط الطرد المركزي كثافة ميدالمرحلة البوتاسيوم وطبقة الدم.
    4. الطرد المركزي 20 دقيقة في 1150 x ج في درجة حرارة الغرفة دون فرامل. تشغيل أجهزة الطرد المركزي دون الفرامل وإذا أمكن مع انخفاض في سرعة متوسطة لمنع الاختلاط بين الطبقات.
    5. اخراج حلقة بيضاء تحتوي على PBMCs بين متوسطة الكثافة الطرد المركزي والمرحلة البلازما. نقل إلى أنبوب 50 مل الجديد (1 مرة مع ماصة 5 مل و 2 مرات مع 2 مل بلاستيكية ماصة باستير). تأخذ أقل قدر ممكن البلازما والمتوسطة الكثافة الطرد المركزي. لا تلمس بيليه كرات الدم الحمراء الحمراء.
    6. غسل PBMCs. تقسيم PBMCs إلى 50 مل أنابيب (4 أنابيب في معطف الشهباء). ملء كل 50 مل مع برنامج تلفزيوني.
    7. الطرد المركزي 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. إزالة والتخلص طاف، تجمع الخلايا في 1 أنبوب مع 10 مل RPMI / 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) المتوسطة و resuspend جيدا. إذا كتل الخلايا موجودة، وخلايا سلالة من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون.
    9. نقل الخلايا في T175 قارورة الثقافة خلية للإعلانخلايا herent. شطف الأنابيب مع 40 مل المتوسطة وتتحد مع خلايا (50 مل المجموع). إذا لزم الأمر، وإزالة قسامة لتحليل التدفق الخلوي (انظر الخطوة 1.4). عادة، تتكون خلايا CD4 + T حوالي 30-40٪ من الخلايا في البوابة اللمفاويات، وتشكل الخلايا التائية الساذجة حوالي 30 إلى 60٪ من خلايا CD4 + T حسب الجهة المانحة.
    10. احتضان الخلايا في وضع قارورة من 45 إلى 90 دقيقة في 37 ° C / 5٪ CO 2. وهذه الخطوة تستنزف حيدات بالتمسك البلاستيك. انها ليست إلزامية، ولكن سوف تزيد من نسبة T العائد خلية في كمية PBMCs في الخطوات التالية.
    11. Resuspend الخلايا (في 50 مل يرد المتوسطة في قارورة) وشطف طبقة الخلايا في أسفل القارورة جيدا. توزيع الخلايا بالتساوي إلى مجموعتين 50 مل أنابيب (أنابيب السابقة يمكن إعادة استخدامها لنفس الجهات المانحة). شطف القارورة مع 50 مل الطازجة RPMI / 10٪ FCS متوسطة، ونقل على حد سواء في نفس 2 الأنابيب.
      قد يتم تخزين PBMCs بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع أنابيب زرع على ملاحظة:الجانب، أو من الناحية المثالية، وتستخدم مباشرة لتي العزلة الخلية.
  2. nTreg العزلة التي كتبها المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا
    1. إعداد عازلة العزلة: 0.5٪ (ث / ت) ألبومين المصل البشري و2 مم EDTA في برنامج تلفزيوني. تبقى دائما عازلة في 4 درجات مئوية. وبدلا من أن الألبومين البشري، استخدم بقري الزلال.
    2. و resuspend والاعتماد PBMCs مع عداد الخلايا التلقائية أو اليدوية في وجود الأزرق التريبان (لا تعول الصفائح الدموية الصغيرة). إذا لوحظ كتل الخلايا، والخلايا سلالة من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون.
    3. PBMCs أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. Resuspend الخلايا (مع الماصة 1 مل) في المخزن عزل 90 ميكرولتر في 10 7 PBMCs للحصول على تعليق خلية واحدة. إبقاء الخلايا في الاصل 50 مل أنابيب (2 أنابيب في معطف الشهباء).
    5. إضافة 2 حبات ميكرولتر CD25 في 10 7 خلايا، وخلط، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. ملء مع برنامج تلفزيوني إلى 30 مل. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 46؛ C.
    7. إعداد الأعمدة ليرة سورية (2 في معطف الشهباء): يوازن مع العازلة عزل 3 مل، وتتدفق من خلال تجاهل. يمكن أنابيب إعادة استخدامها لشطف المزيد من الأعمدة.
    8. خلايا Resuspend في 3 مل العازلة العزلة في أنبوب (مع 1 مل الماصة). نقل الخلايا إلى LS العمود، وجمع من خلال تدفق في جديدة 15 مل أنابيب.
    9. شطف 50 مل الأنابيب مع 2 مل عزل العازلة لكل منهما. نقل الشطف عازلة لالأعمدة.
    10. غسل العمود 2X مع 3 مل عزل العازلة لكل منهما. انتظر دائما حتى توقف العمود نازف، قبل أن يضيف أي سائل جديدة. متجر تتدفق من خلال عند 4 درجة مئوية لمدة خطوات لاحقة.
    11. إزالة عمود من المغناطيس. أزل 2X مع 3 مل العازلة العزلة في العمود إلى 15 مل أنبوب.
      ملاحظة: شطافة من 2 الأعمدة في المانحة يمكن الجمع. لا تراجع العمود في السائل.
    12. إعداد وتتوازن LS أعمدة جديدة (1 عمود في معطف الشهباء). نقل شطافة من 1.2.11 إلى العمود. تتدفق من خلال يمكن التخلص منها. بعد شطافة قد فاتد من خلال العمود، وشطف أنبوب وغسل العمود 3X مع العازلة عزل 3 مل.
      ملاحظة: هناك حاجة حاسم العمود الثاني لزيادة نقاء.
    13. إزالة عمود من المغناطيس. أزل CD25 + + "nTregs" 2X مع العازلة عزل 3 مل.
    14. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف تماما.
    15. غسل الخلايا مع 15 مل مستنبت الخلايا التائية، الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف تماما.
    16. Resuspend الخلايا في 0.5 مل مستنبت الخلايا التائية، على أن تستكمل مع 100 وحدة دولية / مل IL-2، لكل منهما. نقل الخلايا إلى 24 لوحة جيدا. أنبوب شطف مع 0.5 مل المتوسطة (+ 100 وحدة دولية / مل IL-2) والجمع في 24 لوحة جيدا.
    17. عدد nTregs (كما في الخطوة 1.2.2). العائد هو عادة حوالي 1-4 × 10 6 Tregs في معطف الشهباء. ضبط كثافة Tregs إلى 1-2 × 10 6 خلية / مل مع مستنبت خلايا T + 100 وحدة دولية / مل IL-2.
    18. احتضان Tregs عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حتى الاستخدام.
    السذاجة CD4 + T عزل الخلايا التي كتبها المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا
    ملاحظة: خذ من خلال تدفق من الخطوة 1.2.8-1.2.10 المضي قدما في عزل الخلايا. بدلا من ذلك، إذا تم عزل أي nTregs، والمضي قدما مباشرة من PBMCs.
    1. الجمع بين 2 أنابيب في المانحة من PBMCs المنضب Treg في أنبوب 50 مل. ملء مع برنامج تلفزيوني إلى 50 مل في درجة حرارة الغرفة.
    2. PBMCs أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة والتخلص طاف. Resuspend الخلايا في 50 مل برنامج تلفزيوني.
    3. كرر الخطوة 1.3.2 مرتين.
      ملاحظة: ويغسل PBS حاسمة لإزالة الصفائح الدموية، والتي لن تتم إزالة مع عدة العزلة السلبية التالية. لا تزال الصفائح الدموية في طاف في هذه السرعة المنخفضة الطرد المركزي. يمكن رصدها نضوب الصفائح الدموية في الخطوات الفردية على شريحة مجهرية. يجب أن تؤديها مع برنامج تلفزيوني وcentrifugations في درجة حرارة الغرفة الخطوات.
    4. و resuspend PBMCs في 50 مل برنامج تلفزيوني. عد الخلايا كما في الخطوة 1.2.2.
    5. PBMCs أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 40 العازلة عزل ميكرولتر (4 درجة مئوية) في 10 7 خلايا.
    6. إضافة 10 ميكرولتر من السذاجة CD4 + T الخلية كوكتيل البيوتين الضد الثاني في 10 7 خلايا.
    7. خلط، واحتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    8. غسل الخلايا بإضافة 40 مل برنامج تلفزيوني (4 درجات مئوية)، وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة الخلايا طاف و resuspend العازلة في عزلة 80 ميكرولتر في 10 7 خلايا.
    9. إضافة 20 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين في 10 7 خلايا. تخلط جيدا، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    10. ملء إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني الباردة، وأجهزة الطرد المركزي 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    11. إعداد الأعمدة ليرة سورية (تتوازن مع 3 مل العازلة العزلة). لتجنب العمود الزائد، استخدم عمود واحد عن الحد الأقصى 250 × 10 6 PBMCs، أو أقل إذا PBMCs تحتوي على العديد من خلايا الدم الحمراء.
    12. إزالة طاف و resuspend جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في المخزن 3 مل العزلة. نقل الخلايا إلى العمود ليرة سورية. جمع التدفق من خلال، والذي يحتوي على خلايا CD4 + T ساذجة، في 15 مل أنابيب.
    13. شطف أنبوب العازلة مع العزلة 2 مل. نقل إلى العمود.
    14. غسل العمود 3X مع العازلة عزل 3 مل. انتظر دائما حتى يتوقف العمود نازف، قبل أن يضيف أي سائل جديدة.
    15. خذ التدفق من خلال (خلايا CD4 + T ساذجة) وأجهزة الطرد المركزي 450 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. يمكن التخلص منها الأعمدة.
    16. إزالة طاف تماما. غسل الخلايا مع 15 مل المتوسطة، الطرد المركزي 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف تماما.
      ملاحظة: يحتوي عازلة عزل EDTA، الذي يخلب أيونات الكالسيوم وبالتالي يضعف تفعيل الخلايا التائية. قبل أي فحوصات التحفيز، وإزالة المنطقة العازلة العزلة تماما وغسل خلايا مرتين مع 15 مل المتوسطة.
    17. و resuspend الخلايا في تي خلية ثقافة المتوسط إلى 2-3 × 10 6 خلايا لكل مل. خلايا الراحة في قارورة المناسب سص جيدا خلال الليل في الحاضنة. إذا تم استخدام الخلايا مباشرة لفحوصات التحفيز، وغسلها واحدة لمزيد من الوقت مع المتوسط.
  3. نقاء تحكم تلطيخ
    1. خذ ~ 50000 الخلايا (Tnaïve، nTreg، PBMCs) لكل منهما، في 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: إذا كان كل من Tnaïve ولوحة nTreg هي أن تكون ملطخة، واتخاذ 2 عينات لكل منهما.
    2. إعداد 2X بريمكس الأجسام المضادة تتركز (في برنامج تلفزيوني) بما يتناسب مع الصك، على سبيل المثال: Tnaïve لوحة: CD4-PerCP 1: 5؛ CD45RA-FITC 01:10، CD45RO-PE 1: 5، CD8-eFlour450 1: 8. لوحة Treg، استبدال CD45RO-PE مع CD25-PE، 01:10.
      ملاحظة: فقط بعض الأجسام المضادة CD25، التي تعترف الحواتم مختلفة من CD25-ميكروبيدات، يمكن أن تستخدم لصبغ nTregs معزولة مع ميكروبيدات CD25.
    3. إضافة 20 ميكرولتر الضد بريمكس إلى 20 خلايا ميكرولتر. أيضا بإعداد stainings واحدة لكل تألقي (باستخدام عينة تحتوي على خلايا إيجابية، على سبيل المثال، PBMCs) وعينة غير ملوثين، لالتدفق الخلوي settinع والتعويض.
    4. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    5. ملء كل عينة مع 200 ميكرولتر PBS، وأجهزة الطرد المركزي 450 x ج لمدة 5-10 دقيقة.
    6. تناول الخلايا في مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) عازلة (= عازلة العزلة دون EDTA) وتحليل التدفق الخلوي. نقاء خلايا CD4 + T ساذجة عادة> 95٪ (انظر الشكل 2).

2. Treg التعريفي الثقافة

  1. إعداد تحفيز وسائل الإعلام ولوحات
    1. إعداد وقبل دافئ ثقافة الخلايا التائية المتوسطة: المصل خالية المتوسطة المكونة للدم تستكمل مع 2 مم L-ألانيل-L-الجلوتامين.
    2. إعداد خلوى، الأجسام المضادة التحفيز وتركيزات الأوراق المالية المركبة.
      1. إعداد IL-2 حل الأسهم: 400000 وحدة دولية / مل في 100 ملي حمض الخليك العقيمة التي تمت تصفيتها (مع فلتر مقاومة للحامض) (167 ميكروغرام / مل إذا النشاط من الكثير المستخدم هو 2400 وحدة دولية لكل 1 ميكروغرام، مع تأكيد مزود). قسامة لتعقيم منخفض البروتين ملزمة 0.5 مل أنابيب، ختم مع parafilm، وتجميد على الثلج الجاف ومخزن في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      2. إعداد TGF-β1 حل سهم (لمدة 10 ميكروغرام قارورة، خالية من الناقل): مسحوق الطرد المركزي TGF-β1 (1000 x ج 3 دقائق)، إضافة 100 ميكرولتر من 4 ملي حمض الهيدروكلوريك (العقيمة التي تمت تصفيتها مع مرشح مقاومة للحمض) لإعداد محلول المخزون مع 100 ميكروغرام / مل، والسماح لتذوب تماما. دوامة. قسامة 5 ميكرولتر كل لتعقيم منخفض البروتين ملزمة 0.5 مل أنابيب، ختم مع parafilm، وتجميد على الثلج الجاف ومخزن في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      3. إعداد ATRA حل الأسهم: حل مسحوق في 20 ملغ / مل (66.6 ملم) في DMSO. إعداد محلول المخزون من 10 ملي بمزيد من التخفيف في DMSO وتخزينها قسامات، محمية من الضوء، في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. ATRA حساسة للضوء والحرارة والهواء.
      4. إعداد محلول المخزون rapamycin: 1 ملغ / مل (1.11 ملم) في DMSO وتخزينها في aliquots في -80 درجة مئوية لمدةما يصل الى 1 سنة.
      5. إعداد الصوديوم محلول المخزون الزبدات: 0.908 M (0.1 ملغ / مل) الأسهم في العقيمة H نقي للغاية 2 O وتصفية العقيمة. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
    3. إعداد 4x والمركزات تتركز (50 ميكرولتر لكل بئر) في تي خلية ثقافة المتوسط كما في الجدول 1.
    4. في اليوم السابق، لوحات معطف مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3. معطف المرجوة عدد من الآبار من 96 لوحة U-جيدا مع 5 ميكروغرام / مل مكافحة CD3 الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني، 65 ميكرولتر / جيد. التفاف لوحة بورق واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لا تستخدم الآبار هامش 96 لوحات جيدا. ويمكن استخدام الآبار أكبر، ولكن على شكل حرف U الآبار تسهيل استخدام أعداد الخلايا نفسها في المنطقة عبر التجارب. إذا كانت هناك حاجة أكثر من الخلايا، تجميع المبلغ المطلوب من الآبار بعد الثقافة. عادة، بعد 4-6 أيام من التوسع، 2 الآبار كل عينة كافية لتحليل التدفق الخلوي وتحليل الحمض النووي الريبي.
      1. في يوم من الطلاء، والطلاء قبل فترة وجيزة، وإزالة المضادةحل -CD3 من الآبار. ملء الآبار مع 200 ميكرولتر / جيد في برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني. تكرار غسل 200 ميكرولتر / جيد في برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني تماما واستخدام لوحات على الفور.
    5. إعداد لوحات (لا تستخدم الآبار هامش):
      1. لكل بئر، إضافة 50 ميكرولتر من 4x ومكافحة CD28 / IL-2 بريمكس (باستثناء خلايا "unstimulated"، إضافة تي خلية ثقافة المتوسط)، 50 ميكرولتر 4X TGF-β1 بريمكس (لجميع iTregs) أو 50 ميكرولتر الثقافة الخلايا التائية متوسطة ل "التحفيز فقط" السيطرة وهمية، 50 ميكرولتر 4X ATRA، ATRA / rapamycin أو بريمكس الزبدات (إن وجد) أو المتوسطة
      2. ملء جميع الآبار فارغة، بما في ذلك الآبار الهامش، مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. لوحات ما قبل الدافئة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
  2. إعداد السذاجة الخلايا التائية لتصفيح
    1. بعد يستريح الخلايا، ونقل إلى أنبوب 15 مل، وشطف قارورة / بئرا قبل تحسنت T زراعة الخلايا المتوسطة وتجمع لأنبوب. ملء أنبوب إلى 15 مل مع مستنبت الخلايا التائية. </ لى>
    2. خلايا الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. إزالة المتوسطة ويستغرق الخلايا في الطازجة، تي خلية ثقافة المتوسط قبل تحسنت إلى كثافة 2،2-2،6 × 10 6 / مل. عد الخلايا كما في الخطوة 1.2.2 وضبط كثافة إذا لزم الأمر.
    4. إضافة الخلايا لوحات تحفيز المعدة (انظر 2.1)، 50 خلية ميكرولتر / جيد (110،000-130،000 خلايا / جيد). كل بئر الآن يجب أن تحتوي على الحجم الكلي 200 ميكرولتر.
    5. التفاف لوحات في رقائق الألومنيوم لحماية ATRA من الضوء. احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لفترات زمنية محددة.
  3. مراقبة Treg التعريفي الثقافة
    1. مراقبة الثقافات Treg بواسطة المجهر الضوئي (40X التكبير). من حول يوم 2-3، وينبغي أن مجموعات صغيرة من الخلايا المتكاثرة تصبح مرئية، الذي دمج في مجموعات أكبر في نقطة زمنية لاحقة. ثقافات نمت مع rapamycin تنمو عموما أقل. انظر أيضا الشكل 3.
    2. في نقاط الوقت المطلوب، أخذ عينات لRNA هxtraction أو التدفق الخلوي phenotyping (أنظر أدناه). للحصول على نقاط وقت لاحق مع تكاثر الخلايا، 1 جيدا كل يكفي، وإلا لقطة 1 × 10 5 -1 × 10 6 خلايا في كل من RNA و 3 × 10 5 -1 × 10 6 خلايا لالتدفق الخلوي.
  4. تقييم FOXP3 الاستقرار
    1. لتقييم استقرار النمط الظاهري iTreg كما هو موضح سابقا 22،27، وغسل iTregs مرتين مع مستنبت الخلايا التائية، وiTregs ثقافة أخرى في تي مستنبت الخلية إما بدون أو مع مكافحة CD3 وrestimulation مكافحة CD28 كما هو موضح في 2.1 و 2.2 . إضافة السيتوكينات، مثل 50 وحدة دولية / مل IL-2، لدراسة تأثيرها على الاستقرار FOXP3.
    2. في نقاط الوقت المطلوب، أخذ عينات لاستخراج الحمض النووي الريبي، التدفق الخلوي phenotyping (أنظر أدناه)، وتحليل TSDR مثيلة كما هو موضح 22،28.

3. تحليل المظهري من iTregs التي كتبها QRT-PCR

  1. التحضير لعينات
    1. في نقاط الوقت المطلوب، واتخاذ 1 × 05-1 أكتوبر × 10 6 خلايا لكل عينة لاستخراج الحمض النووي الريبي. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل ريبونوكلياز خالية، وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. إذا لزم الأمر، وإزالة جزء من طاف وتجميد لفحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) أو تحليل مماثل. إزالة ما تبقى طاف تماما من الخلايا. الانتقال مباشرة إلى استخراج الحمض النووي الريبي أو تجميد بيليه خلية على الثلج الجاف ومخزن في -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
    3. استخراج الحمض النووي الريبي وتنفيذ QRT-PCR لFOXP3 والجينات التدبير المنزلي (مثل RPL13A) وفقا لبروتوكولات موحدة. وبالإضافة إلى ذلك، قياس التعبير عن الجينات توقيع Treg أخرى (على سبيل المثال `Treg up' الجينات IL2RA، CTLA4، IKZF4، و` Treg down' الجينات IFNG، SATB1).

4. تحليل المظهري بواسطة التدفق الخلوي

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لوصمة عارجي في 96U شكل لوحة جيدا مع 3 × 10 5 -1 × 10 6 خلايا. إذا كان هناك أقل خلايا لكل بئر، وتبدأ مع العديد من الآبار وتجمع كما هو موضح أدناه.

  1. Restimulation الخلية (اختياري)
    1. إذا كان المطلوب تلطيخ لالسيتوكينات داخل الخلايا، والخلايا نبض مع Phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) / Ionomycin في وجود المانع النقل البروتين.
      ملاحظة: هذا الإجراء لا تؤثر على التعبير FOXP3 في الثقافات iTreg المذكورة أعلاه، ولكن علامات أخرى قد تتغير - على سبيل المثال، downregulated CD4.
    2. إعداد 10X Brefeldin A / سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin بريمكس (20 ميكرولتر لكل بئر) في تي خلية ثقافة المتوسط: Brefeldin حل الأوراق المالية 1: 100، Ionomycin (الأسهم 5 ميكروغرام / ميكرولتر) 1: 1300، سلطة النقد الفلسطينية (الأسهم 12.35 ميكروغرام / ميكرولتر، قبل -تمييع 1: 1235) 1: 100 من الأسهم المخفف مسبقا.
    3. قبل 4 ساعات تلطيخ، إضافة 20 ميكرولتر Brefeldin A / سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin 10X مزيج لكل بئر للحصول على تركيزات نهاية 1: 1000 Brefeldin A، 0.5 μM (375 نانوغرام / مل) Ionomycin، 10 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية.
    4. احتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2
  2. تلطيخ السطح
    ملاحظة: لوحة اقترح هنا هو اقتراح. ويمكن استخدام لوحات أخرى اعتمادا على المستضدات من الاهتمام والإعداد الصك.
    1. تهدئة في برنامج تلفزيوني على الجليد. إعداد FACS العازلة (PBS مع 0.5٪ ألبومين المصل البشري، HSA) وباردة على الجليد. BSA أو FBS يمكن استخدامها كبديل لهائل سعيد أنعم.
    2. خلايا إعادة لوحة في لوحة تلطيخ: Resuspend الخلايا مع ماصة ونقل الخلايا إلى لوحة جديدة أيضا 96U، وترك واحد مجانا جيدا حول كل بئر (لمنع انتشار في إجراء تلطيخ لاحق). إذا كانت أقل من أرقام الخلية المطلوبة موجودة في البئر الأصلي، وإزالة جزء من طاف قبل إعادة تعليق، وتجمع العديد من الآبار إلى تلطيخ جيدا.
    3. لوحة أجهزة الطرد المركزي 400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة طاف. اسكب طاف في مربع النفايات، وترك لوحة رأسا على عقبإلى أسفل وعلى الفور (دون عودة الى الوراء لوحة) الاستفادة من لوحة مرة واحدة على ورقة ماصة. ثم انتقل على الفور إلى الوراء لوحة. لوحة دوامة ل resuspend الخلايا في السائل المتبقي.
    5. إضافة 25 ميكرولتر بريمكس تلطيخ السطح (CD25-PE 01:20، CD4-PerCP 1: 5 في المخزن FACS) و resuspend.
      ملاحظة: وتشمل أيضا stainings واحدة لكل من fluorochromes استخدامها مع العينات التي تحتوي على خلايا إيجابية للمستضد المعنية؛ وتشمل عينة غير ملوثين. وستكون هناك حاجة لإعداد هذه تعويض الصك. بدلا من ذلك، استخدام الخرز التعويض.
    6. احتضان 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    7. إضافة 200 ميكرولتر PBS، لوحة أجهزة الطرد المركزي 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وإزالة طاف كما هو موضح في الخطوة 4.2.4. لوحة دوامة.
    8. كرر الخطوة 4.2.7 مرتين.
  3. الجدوى تلطيخ
    ملاحظة: الجدوى تلطيخ أمر لا غنى عنه، منذ بعد تثبيت / permeabilization لا بما فيه الكفاية استبعاد الخلايا الميتة عن طريقFSC / SSC وقد تؤدي إلى إشارات غير محددة. والجدوى صبغ قابل للتثبيت لابد من استخدامها.
    1. Resuspend الخلايا في 130 ميكرولتر الجدوى وصمة عار بريمكس (الملاءمة يمكن حلها صبغ eFlour780 1: 1400 في برنامج تلفزيوني) وResuspend الخلايا مباشرة مع الماصة متعدد القنوات.
      ملاحظة: تشمل أيضا تلطيخ واحد لصبغ الجدوى التي تحتوي على الخلايا الميتة، على سبيل المثال، خلايا تي unstimulated مثقف لعدة أيام أو قتل الخلايا عن طريق تطبيق الحرارة وبتعليمات الصانعين. وستكون هناك حاجة هؤلاء للحصول على تعويض.
    2. احتضان 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    3. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف كما في الخطوة 4.2.4. لوحة دوامة.
    4. ملء مع العازلة FACS 200 ميكرولتر. كرر الخطوة 4.3.3.
    5. ملء مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. كرر الخطوة 4.3.3.
  4. تلطيخ الخلايا مع FOXP3 تلطيخ العازلة مجموعة
    1. لكل بئر، وإعداد: 150 ميكرولتر فيكس عازلة / بيرم (تمييع فيكس / بيرم اضربentrate 1: 4 مع مخفف)؛ 850 العازلة permeabilization 1X ميكرولتر (تمييع عازلة 10X permeabilization 01:10 مع نقي للغاية H 2 O).
    2. بعد vortexing ل، وخلايا resuspend في 150 ميكرولتر فيكس عازلة / بيرم وعلى الفور و resuspend مع ماصة. من المهم ل resuspend على الفور لتجنب تثبيت من كتل الخلايا.
      تحذير: التثبيت عازلة يحتوي على امتصاص العرق، وينبغي أن يتم التعامل معها والتخلص منها بشكل مناسب.
    3. احتضان 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    4. إضافة 100 ميكرولتر الباردة برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 850 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: من هذه الخطوة هو زيادة فصاعدا سرعة الطرد المركزي لتجنب فقدان الخلايا. بعد التثبيت، تصبح الخلايا غير مرئية، ويجب الحرص على إزالة supernatants كما هو موضح في الخطوة 4.2.4 وعلى الفور بعد الانتهاء من الطرد المركزي للحد من فقدان الخلايا.
    5. إزالة طاف كما هو موضح في الخطوة 4.2.4. لوحة دوامة.
      ملاحظة: قد يكون مؤقتا وتلطيخ على هذه الخطوة. فيهذه الحالة، وغسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. ثم تناول في 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء. الخلايا ويمكن تخزينها لمدة أيام قليلة، ثم المضي قدما permeabilization. ومع ذلك، يتم تحقيق أفضل النتائج عندما واصل مباشرة إلى permeabilization.
    6. بعد vortexing ل، إضافة 200 العازلة Permeabilization ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي في 850 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف كما هو موضح في الخطوة 4.2.4. لوحة دوامة.
    7. إضافة 200 العازلة Permeabilization ميكرولتر ل resuspend.
      ملاحظة: هنا، وعينات يمكن تقسيمها إلى تلطيخ الخلايا وعينة isotype السيطرة (يسلب نصف من كل عينة). إذا أعداد الخلايا تحد، عينة نمط إسوي المجمعة يمكن إعداد (يسلب 10-20 ميكرولتر من كل عينة وبركة). أيضا، والعينات التي يمكن اتخاذها لضوابط الإسفار ناقص واحد (FMO).
    8. أجهزة الطرد المركزي في 850 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف كما هو موضح في الخطوة 4.2.4. لوحة دوامة.
    9. بيليه resuspend في44 ميكرولتر عازلة Permeabilization زائد 1 ميكرولتر الفأر العادي المصل (خلط) لمنع ملزم غير محددة.
      ملاحظة: هذا ينطبق إذا الأجسام المضادة المستخدمة في الخطوة التالية هي من نمط إسوي الفئران. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأخرى، مثل المستمدة من الفئران،، وتشمل المصل المناسب لمنع (على سبيل المثال، مصل الفئران).
    10. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    11. إضافة الأجسام المضادة:
      ملاحظة: استفسار تركيزات الأجسام المضادة للالحصص المحددة. إذا لم تفعل في الخطوة 4.2 مع الأجسام المضادة ضد المستضدات السطحية (على سبيل المثال، CD4) مع fluorochromes منها، وتشمل أيضا stainings واحدة لكل من fluorochromes استخدامها مع العينات التي تحتوي على خلايا إيجابية للتعويض.
      1. إضافة 15 ميكرولتر الضد بريمكس لعينات (باستثناء stainings واحدة، والعينات غير ملوثين، والعينات isotype السيطرة والتحكم FMO): خلائط جاهزة لكل عينة: 0.7 ميكرولتر (0.35 ميكروغرام) المضادة للانترفيرون جاما (IFN-γ) -FITC (إن وجد بعد restimulation )،2.3 ميكرولتر (0.115 ميكروغرام) CTLA-4 بريليانت البنفسج 421، 2 ميكرولتر (0.05 ميكروغرام) مكافحة FOXP3-APC، 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
      2. إلى نمط إسوي عينات السيطرة، إضافة 15 ميكرولتر نمط إسوي الأجسام المضادة بريمكس، وذلك باستخدام نفس الكميات من الأجسام المضادة كوسيلة لالأجسام المضادة المستخدمة في 4.4.11.1: خلائط جاهزة لكل عينة: 0.7 ميكرولتر (0.35 ميكروغرام) FITC الماوس IgG1 K isotype السيطرة (إن وجدت)، 0.58 ميكرولتر (0.115 ميكروغرام) الماوس IgG2a-BV421 نمط إسوي، 0.5 ميكرولتر (0.05 ميكروغرام) الفأر IgG1 K isotype السيطرة APC، 13.2 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
      3. لضوابط FMO، إضافة الأجسام المضادة كما في 4.4.11.1، لتحل محل الأجسام المضادة واحد مع كل برنامج تلفزيوني.
    12. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    13. إضافة 200 العازلة Permeabilization ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي، وإزالة طاف ودوامة كما في الخطوة 4.4.8. أكرر مرة واحدة.
    14. Resuspend الخلايا في المخزن FACS الباردة (حجم وفقا للأداة المستخدمة) والحصول، من الناحية المثالية على الفور، على قياس التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 مخطط من الإعداد التجريبية. ويبين الشكل 2 تلطيخ السيطرة نقاء التمثيلي للخلايا CD4 + T ساذجة معزولة مغناطيسيا وnTregs.

يظهر F igure 3A تدفق الخلوي استراتيجية المحاصرة والشكل 3B يظهر FOXP3 تمثيلا وCD25 قياس التدفق الخلوي stainings في يوم 6 من الثقافة تحت iTreg أو سيطرة الظروف المشار إليها. عليها في المختبر التحفيز، ومعظم الخلايا upregulate CD25، التي يتم تخفيض في وجود rapamycin. إلا في ظل إضافة عوامل iTreg الذي يحفز، والسكان واضح للFOXP3 + الخلايا يصبح واضحا، وهو ما أثرى أيضا ضمن CD25 + الخلايا تحت الظروف iTreg. الشكل 3C يصور ظهور المظهري من الثقافات iTreg في المجهر مع الخلايا المتكاثرة ينظر إليها على أنها كتل الظلام. كل ط معارض Treg حالة نمط معين وقابلة للتكرار من تكاثر الخلايا: في ظل هذه الظروف والثقافة، TGF-β يزيد انتشار قليلا، ويزيد ATRA مزيد من الانتشار. في نفس الوقت، وتثبيط تكاثر بواسطة rapamycin هو واضح من حجم الكتلة خفضت بشدة. مظهر المجهري للقوة انتشار يتوافق أيضا إلى إجمالي عدد الخلايا (بيانات غير المدرجة).

الرقم النتائج 4 يعرض تمثيلية من QRT-PCR تحليل الحث FOXP3 مرنا في iTreg (والرقابة) الثقافات في نقاط زمنية مختلفة. أما بالنسبة للبروتين FOXP3، FOXP3 مرنا التعبير هو أعلى في جميع iTregs مقارنة للسيطرة على الخلايا المنبهة، مع iTregs المعالجة rapamycin وجود مستويات منخفضة نسبيا بالمقارنة مع iTregs الآخرين. FOXP3 مرنا في nTregs هو أعلى منه في iTregs.

وفاق / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
الشكل 1: مخطط تجريبي لiTreg تحريض والعزلة nTreg، وتحليل Treg. تم عزل خلايا CD4 + T ساذجة الإنسان من المعاطف الشهباء وحفزت في المصل خالية المتوسطة مع 100 U / مل IL-2 لمدة تصل إلى 6 أيام، إما في غياب ( `الخلايا السيطرة وهمية لمكافحة CD3 وأضداد CD28 زائد ') أو وجود عوامل مختلفة Treg الذي يحفز ( `iTreg') كما هو مبين. يتم عزل nTregs ويعاير في وقت واحد. ويمكن أن يتم تحليل المظهري التدفق الخلوي وQRT-PCR. تعديل من شميت، A. وآخرون. 2016 (22). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: نقاء خلية من بدء السكان. CD الإنسان الساذج تم عزل 4 + الخلايا التائية من السذاجة CD4 T عزل الخلايا كيت الثانى والبشرية. اللوحة العليا: السذاجة CD4 + T الخلية نقاء، على أساس CD4، CD45RA وCD45RO، و94-98٪ ويظهر نقاء للمتبرع تمثيلية من أكثر من 30 ( `Tnaïve'). فيفو السابقين Tregs ( `nTreg') تم عزل باستخدام كميات محدودة من ميكروبيدات CD25 واستخدامها كأداة تحكم إيجابية لتجارب iTreg. nTreg نقاء متبرع تمثيلية، على أساس CD25 وCD4، ويرد. اللوحة السفلى: جواني تلطيخ FOXP3 (يؤديها كما في الشكل (3) وقبل بوابات على العيش خلايا CD4 +) ويظهر لخلايا CD4 + T ساذجة وnTregs على التوالي، وذلك باستخدام خلايا من نفس الجهات المانحة كما في اللوحة العليا. تعديل من شميت، A. وآخرون. 2016 (22). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ntent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (3)
الرقم 3: ظهور المظهري من iTregs وnTregs. كانت خلايا CD4 + T ساذجة البشرية المستزرعة في المصل خالية المتوسطة في ظل الظروف المشار إليها. وحفز خلايا T مع anti-CD3 والأجسام المضادة-CD28 بالإضافة إلى 100 U / مل IL-2 ( `Stim.'). حيث أشار، وأضيفت TGF-β1 ( `TGF')، rapamycin (` Rapa')، جميع العابر حمض الريتينويك ( `ATRA') أو الزبدات. nTregs (خارج الجسم الحي معزولة الطرفية CD25 خلايا الدم ++) تركت unstimulated ( `unstim.') واستخدامها كأداة مراقبة إيجابية. استخدمت خلايا T ساذجة Unstimulated كما المراقبة السلبية. (A) في يوم 6 من الثقافة، وكانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة السطحية بما في ذلك مكافحة CD25 ومكافحة CD4، ثم ملطخة صبغة الجدوى قابل للتثبيت وبعد ذلك ثابتة / permeabilized والملون داخل الخلية مع مكافحة FOXP3 ومكافحة CTLA-4 أو نمط إسوي تابع الأجسام المضادة رول. أجريت اقتناء والتعويض على تدفق السماوي ADP الكريات وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo. يشار إلى استراتيجية المحاصرة من السهام الحمراء، والمثال المعروض هو عينة iTreg الناجم مع TGF + ATRA. كانت ملطخة (ب) الخلايا كما هو الحال في (A)، وأظهرت FOXP3 وCD25 التعبير في خلايا T السيطرة وiTregs الناجم عن بروتوكولات مختلفة. تظهر المؤامرات pseudocolor FOXP3 وCD25 stainings تمثيلية للمانح واحد، قبل بوابات على القميص، ويعيش CD4 + الخلايا كما في الفقرة (أ). يظهر المثال نمط إسوي لiTreg (STIM. + TGF + ATRA) عينة. (C) التمثيلية الصور المجهر (التكبير 40X) من الآبار 96U لوحة الفردية من الخلايا المستنبتة لمدة 4 أيام. مجموعات المظلمة من خلايا تمثل الخلايا المتكاثرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ntent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (4)
الشكل 4: FOXP3 التعبير مرنا على استخدام بروتوكولات مختلفة لiTreg التمايز. تم إنشاؤها iTregs كما في الشكل (3) وفقا للشروط المشار إليها، وعند نقاط زمنية معينة، أخذت عينات من الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي. وأخذت عينات من Unstimulated خلايا T ساذجة، وnTregs unstimulated، يوم حللت 0. عينات من QRT-PCR، وكان FOXP3 مرنا التعبير تطبيع في التعبير RPL13A لكل عينة. تم تعيين FOXP3 مرنا التعبير في خلايا تي ساذجة unstimulated إلى 1، وأضعاف تغيير FOXP3 مرنا تم حسابها. المعروضة هي القيم المتوسطة ومجموعة من PCR تكرار الآبار للمتبرع تمثيلا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتيح بروتوكول صفها تحريض قوي من CD4 + البشري FOXP3 + iTregs من خلايا CD4 + T ساذجة الإنسان. ويتضمن البروتوكول الجديد الذي وصفنا في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام مزيج من TGF-β، ATRA وrapamycin، لتحريض iTregs مع متفوقة في المختبر القمعية وظيفة 22. مقارنة البروتوكولات الأخرى المنشورة، هناك ميزة أخرى هي تحريض مختلف السكان iTreg بالتوازي بواسطة بروتوكولات مختلفة، والتي تمكن من المقارنة المباشرة لتأثير بعض العوامل iTreg الذي يحفز، جنبا إلى جنب مع الخلايا السيطرة التي يتم تفعيلها في وجود IL-2 وحده . تمكن البروتوكولات المذكورة تحريض استنساخه من FOXP3 مع اختلاف المانحة منخفضة. يتم عزل ساذجة خلايا CD4 + T في هذا البروتوكول من قبل الفرز خلية المغناطيسي تنشيط، ولكن مضان تنشيط الفرز الخلية هو ممكن أيضا. العائد المتوقع من خلايا CD4 + T ساذجة مع هذا البروتوكول هو عادة بين 5-10٪، ولكن يعتمد بشدة على الجهات المانحة (العمر) ويبدو أيضا أقل عندما كسور عالية من كريات الدم الحمراء موجودة. إذا كانت هناك حاجة إلى تقدير، PBMCs يمكن الملون (راجع الخطوة 1.4) خلال الخطوة نضوب الوحيدات. عادة، العائد من خلايا CD4 + T ساذجة حوالي نصف "نسبة ساذجة خلايا CD4 + T من بوابة اللمفاويات" في وصمة عار PBMC. يستخدم هذا البروتوكول كميات محدودة من الخرز CD25 للحصول على (nTreg) خلايا عالية CD25 29. ومع ذلك، هذه ليست Tregs نقية، ولكن هذه هي المخصب فقط في Tregs لاستخدامها مراقبة إيجابية. إذا كانت هناك حاجة Tregs نقية، ينبغي أن تستخدم مجموعات أخرى (مثل جنبا إلى جنب مع تخصيب CD4 وCD127 استنفاد) أو بدلا من ذلك، CD25 + الخلايا ما قبل المخصب مع حبات CD25 8 ميكرولتر في 10 7 الخلايا وملطخة وفرزها من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز مع صرامة CD4 + CD25 + النابضة. أيضا إدراج علامات أخرى، مثل استبعاد CD127، ينبغي النظر فيها.

_content "> ومن المهم أن نرى أن FOXP3 ضروري ولكنه ليس كافيا لمنح Treg هوية 30. وفي حين iTregs يمكن استخدامها لدراسة جوانب معينة، على سبيل المثال، تنظيم FOXP3، فمن المهم مع ذلك أن نلاحظ أن iTregs تختلف من nTregs في عدة جوانب. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن nTregs الثقافة (مشتقة من الناحية المثالية من نفس الجهات المانحة) بالتوازي مع iTregs في جميع المقايسات للمقارنة. ويتمثل الفرق بين nTregs وiTregs من التداخل الجزئي فقط من Transcriptome على nTreg وiTreg التي تقاس iTregs الفئران 31. جينات Treg توقيع الأخرى بالإضافة إلى FOXP3 ينبغي قياس لهذا السبب، وضمان التمييز من التعبير FOXP3 الناجم عن التنشيط في الخلايا البشرية. على سبيل المثال، يجب أن iTregs عرض تعبير أعلى من CD25، CTLA-4 و EOS مقارنة لتنشيط خلايا تي حين أن التعبير عن الإنترفيرون γ وSATB1 يجب أن تكون منخفضة في nTregs وiTregs الناجمة عن البروتوكولات المذكورة هنا، كما نشرت سابقا 13. أيضا على نطاق الجينوم واسعة، وقد وصفت أن أنماط جينية من الحامض النووي والتعديلات هيستون في iTregs الفئران لا تعكس أنماط وجدت في nTregs 30. وصفنا سابقا أن iTregs الناجمة عن هنا وصف البروتوكولات، وعلى النقيض من nTregs، لم تظهر TSDR نزع الميثيل. وبناء على ذلك، فقد iTregs FOXP3 عندما restimulated، لكنه حافظ على التعبير FOXP3 عند مواصلة المثقف في وجود IL-2 ودون restimulation 22. ومن المثير للاهتمام، المعروضة iTregs الناجمة عن بروتوكول بديل باستخدام M2 supernatants بلعم تعزيز الاستقرار FOXP3، على الرغم من عدم وجود TSDR نزع الميثيل وTGF-β كونها المسبب لFOXP3 تحريض 27.

تعديل iTreg-inducing البروتوكولات إضافة مركبات (مثل فيتامين (ج) أو كبريتيد الهيدروجين) التي تؤثر عشرة أحد عشر إزفاء (TET) الانزيمات ميثيل سيتوزين دي أكسيجيناز، كما هو موضح في الآونة الأخيرة جدا 32-34، قد تضيف في استقرار FOXP3 عن طريق التأثير في الحامض النووي. أيضا، وقوة التحفيز وتوقيت لها تأثير على التعبير FOXP3 والاستقرار 35. على طول هذه الخطوط، وقد تبين استخدام يقترن حبة CD3 الأجسام المضادة / CD28 بدلا من الأجسام المضادة ملزمة لوحة لزيادة الفئران iTreg في الجسم الحي وظيفة القمعية والاستقرار ولو مستقلة عن TSDR نزع الميثيل 36. وثمة عامل آخر لا بد من اعتبارها مصدرا محتملا للالاختلاف هو استخدام المصل، الذي يحتوي على عوامل غير محددة بما في ذلك TGF-β التي هي 100٪ عبر التفاعل مع الخلايا البشرية حتى من مصدر بقري. أيضا، المصدر والنشاط من IL-2 يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج التوجيهي FOXP3.

وو الهامةeature من Tregs هو قدرتها القمعية، التي تحتاج لفحصها في وقت لاحق مع iTregs ولدت في هذا البروتوكول. وتجدر الإشارة إلى أن فحوصات قمع مع iTregs ليست هينة والأدب حول قدرات القمعية من iTregs مثير للجدل. عدة طرق وبروتوكولات لتقييم وظيفة القمعية من Tregs الإنسان قد تم نشرها في أماكن أخرى 22،37 - 41، مع فحوصات في المختبر انتشار على أساس التدفق الخلوي قراءات مثل التخفيف من Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) المستخدمة الأكثر شيوعا. من المهم أن تغسل وراحة iTregs قبل استخدامها في المقايسات قمع، وأنه يحتاج إلى اعتبار أن iTregs، على النقيض من nTregs، قد لا تكون تعطيلي ولكن تتكاثر أنفسهم خلال فحوصات قمع. ونحن نعتبر أنه من المهم للغاية لاستخدام `mock' حفز خلايا تي وخلايا السيطرة القامع للتعرف على درجة من قمع غير محددة (مثل من خلال CTLA-4 التعبير، IL-2 المستهلكونption وفرط الثقافة عن طريق تنشيط خلايا تي) التي لا علاقة لها FOXP3 + آثار Treg محددة، وعدم وجود كثرة من هذه السيطرة قد تساهم في بعض الخلافات في الأدب. باستخدام هذه السيطرة، حددنا أن فقط TGF-β / iTregs يسببها رابا-ATRA / عرض النشاط القمعية في المختبر 22. وبالتالي، فإننا نستنتج أنه فيما يتعلق النشاط القمعية (وإن لم يكن أعلى جزء من FOXP3 + الخلايا)، TGF-β / ATRA / رابا هو أفضل مزيج من العوامل من البروتوكولات المذكورة للحث على iTregs. ومع ذلك، النشاط القمعية في المختبر لا تعكس بالضرورة النشاط القمعية في الجسم الحي، وبالفعل توصلنا إلى أن iTregs البشرية التي تولدها هذه البروتوكولات لم قمع في graft- مقابل -host نموذج المرض xenogeneic على الأقل في ظل الظروف المختبرة 22. قد يكون ذلك متعلقا التعبير FOXP3 غير المستقر الذي ضاع في iTregs على restimulation، وذلك تمشيا مع عدم وجود TSDR نزع الميثيل 22

اعتمادا على أي جانب من جوانب ميزات iTreg (جزء كبير من FOXP3 + الخلايا، النشاط القمعية متفوقة والاستقرار FOXP3) هو الأكثر أهمية لمسألة بحثية معينة، قد تكون بروتوكولات مختلفة الأنسب لدراسة هذه الأسئلة، مما يجعل من الصعب تحديد عموما 'أفضل "بروتوكول لTreg الاستقراء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن العديد من الاختلافات التجريبية خفية المذكورة أعلاه تؤثر النتائج ويمكن أن تسهم في الخلافات فيما يتعلق النمط الظاهري والقمعية وظيفة من TGF-الناجم عن β iTregs التي تظهر بين التقارير حتى مع بروتوكولات مماثلة على ما يبدو لiTreg جيل 42. على سبيل المثال، حتى داخل مختبر واحد، لاحظنا أن iTregs الناجم مع TGF-β و IL-2 في المحتوية على مصل RPMI المتوسطة عرض بعض النشاط القمعية مقارنة للسيطرة على الخلايا 27، في حين iTregs التي يسببها IL-2 TGF-β / ولدت في تعريف وخالية من مصل الثقافة المتوسطة الخلايا التائية لم أكن 22، دespite مستويات مماثلة من FOXP3.

يجب أن التطبيقات المستقبلية بناء على هذه البروتوكولات تسعى لمواصلة تحسين الظروف تحريض Treg لتحقيق النمط الظاهري مع التعبير FOXP3 مستقر، TSDR نزع الميثيل، النمط الظاهري مستقرة دون التحول إلى خلايا T المستجيب المنتجة للخلوى والنشاط القمعية الأمثل. مزيد من تطوير بروتوكولات تحريض iTreg قد تكون مفيدة للاقتراب نقل بالتبني في المستقبل، والتي العلاج عن طريق التحويل Treg واعدة للغاية لعلاج المحتملة من أمراض المناعة الذاتية والالتهابات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

علم المناعة، العدد 118، والخلايا التائية التنظيمية، Treg، خلايا CD4 + T، عزل الخلايا المغناطيسية،
التمايز <em>في المختبر</em> من خلايا CD4 الإنسان <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup> المستحثة تنظيم الخلايا التائية (iTregs) من خلايا CD4 <sup>+</sup> T السذاجة باستخدام بروتوكول تحتوي على TGF-β-
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter