Summary
Ce protocole décrit la génération reproductible et phénotypage des cellules T régulatrices humaines induites (les iTregs) à partir de cellules T CD4 + naïves in vitro. Différents protocoles pour FOXP3 induction permettent l'étude des phénotypes iTreg spécifiques obtenus avec les protocoles respectifs.
Introduction
Des cellules T régulatrices CD4 + CD25 + FOXP3 + (Treg) suppriment d' autres cellules immunitaires et sont des médiateurs essentiels de la tolérance périphérique, la prévention de l' auto - immunité et l' inflammation excessive 1. L'importance de Tregs est illustré par la maladie humaine syndrome immunodysregulation polyendocrinopathie entéropathie liée à l'X (IPEX), dans laquelle la perte de Tregs due à des mutations dans le `master' Treg facteur de transcription forkhead box P3 (FOXP3) conduit à une maladie auto-immune systémique sévère, létale à un âge précoce. Cependant, Tregs agir comme une épée à double tranchant dans le système immunitaire , car ils peuvent aussi nuire à l' immunité anti-tumorale dans certains paramètres 2. manipulation thérapeutique du nombre et de la fonction Treg est donc soumis à de nombreuses investigations cliniques. Dans le cancer, l' épuisement des Tregs peut être souhaitable et un certain succès des approches cliniques encourage la poursuite de la recherche 3. Dans les maladies auto-immunes et inflammatoires, en plus des effets thérapeutiques des Treg à plusiedes modèles de maladies de la souris relles, récents essais en homme de transfert Treg adoptive pour prévenir la maladie du greffon contre -host (GvHD) 4-7 et d'évaluer la sécurité dans le traitement du diabète de type 1 8 a montré des résultats très prometteurs.
D' origine naturelle Tregs (nTregs) comprennent tTregs thymiques dérivées et pTregs périphériquement induites, avec des fonctions essentielles non redondantes dans le maintien de la santé 9 - 11. Cependant, les numéros nTreg sont limitées, en encourageant l'approche complémentaire induisant Treg (iTregs) in vitro à partir de précurseurs naïfs des lymphocytes T 12. La stabilité morte de iTregs, probablement en raison d' un manque de déméthylation dans ce qu'on appelle la région déméthylé Treg spécifique (TSDR) dans le locus du gène FOXP3 13, reste une préoccupation et plusieurs études indiquent que in vivo induite par Tregs sont plus stables 14.
À ce jour, FOXP3 reste la meilleure protéine marker pour Tregs mais il est absolument pas spécifique parce que les cellules conventionnelles humaines CD4 + CD25 T expriment transitoirement des niveaux intermédiaires de FOXP3 lors de l' activation 15,16. Bien que des progrès significatifs ont été accomplis dans l'élucidation de la régulation de l'expression FOXP3, il reste encore beaucoup à découvrir en ce qui concerne l'induction, la stabilité et la fonction de FOXP3 en particulier dans les cellules humaines. En dépit des différences à nTregs, in vitro induite FOXP3 + cellules T CD4 + peuvent être utilisés comme un système modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de FOXP3 induction et comme un point de départ pour élaborer des protocoles à l'avenir qui permettent de génération de iTregs qui sont plus semblables à vivo généré Tregs, qui pourrait être applicable pour les stratégies de transfert adoptif à l'avenir.
Il n'y a pas `protocole standard' d'or pour induire iTregs humains, et les protocoles actuels ont été développés sur la base de conditions mimant Treg induisant in vivo: l' interleukine 2 (IL-2) Et la transformation β du facteur de croissance (TGF-β) de signalisation sont cruciaux pour FOXP3 induction in vivo 17, et tout-trans de l' acide rétinoïque (ATRA) - qui est produit in vivo par les cellules dendritiques associés à l' intestin - est fréquemment utilisé pour améliorer FOXP3 induction in vitro 18-21. Nous avons développé des protocoles humains supplémentaires Treg induisant en utilisant butyrate 22, un acide gras à chaîne courte microbiote intestinal dérivé qui a été récemment montré pour augmenter murin Treg induction 23,24. Récemment , nous avons établi un nouveau protocole pour la production de iTregs ayant une fonction suppressive supérieure in vitro en utilisant une combinaison de TGF-β, l' ATRA et la rapamycine 22, cette dernière étant une cible mammalienne cliniquement approuvé de la rapamycine (mTOR) , un inhibiteur qui est connu pour promouvoir entretien FOXP3 lors de l' expansion humaine Treg 25,26.
Cette méthode décrit le reproductiblela génération in vitro de cellules CD4 + humaines FOXP3 + iTregs en utilisant un ensemble de conditions différentes, ainsi que leur phénotypage ultérieure par cytométrie en flux et la réaction inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) pour révéler les profils d'expression de FOXP3 et d' autres signatures des molécules Treg telles spécifiques au protocole comme CD25, CTLA-4, EOS, ainsi que la répression de l' IFN-γ et l' expression SATB1 22. Les populations cellulaires générées peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles relatives à l'activité suppressive ou pour des études moléculaires, que ce soit en ce qui concerne les régulateurs généraux FOXP3 ou pour étudier les effets spécifiques à certains composés tels que le butyrate ou la rapamycine. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de conduite différenciation Treg est très pertinente pour les futures approches thérapeutiques de l'auto-immunité ou d'un cancer de cibler spécifiquement les molécules impliquées dans la production et la fonction Treg.
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Protocol
les cellules mononucléaires du sang périphérique humain (CMSP) ont été fraîchement isolés de donneurs sains buffy coats anonymisées achetés à l'hôpital universitaire Karolinska, en Suède. permis éthique pour les expériences a été obtenue auprès du Conseil régional d'éthique Revue à Stockholm (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Suède (numéro d'agrément: 2013 / 1458-1431 / 1).
1. T cellulaire Isolement du sang périphérique
- PBMC Isolation
- Pré-lay 15 ml de milieu de centrifugation de densité (comme Ficoll) en solution dans 50 ml tubes (5 tubes par couche leucocytaire). Pré-réchauffer à la température ambiante.
- Remplir la couche leucocytaire avec tampon phosphate salin (PBS) (température ambiante) à 180 ml. Si le sang frais est utilisé, diluer le sang avec un volume égal de PBS.
- Tube d'inclinaison sur le côté et lentement overlay milieu de centrifugation de densité avec ~ 35 ml dilué sang par tube. Ajouter le sang très soigneusement, sans aucun mélange de la centrifugation de densité medla phase ium et la couche de sang.
- Centrifugeuse 20 min à 1.150 xg à température ambiante sans frein. Actionner la centrifugeuse sans frein et, si possible, avec une faible accélération à moyen pour empêcher le mélange des couches.
- Retirez l'anneau blanc contenant CMSP entre le milieu de centrifugation de densité et la phase de plasma. Transfert à un nouveau tube de 50 ml (1 fois avec 5 ml pipette et 2 fois avec 2 ml de pipette Pasteur en plastique). Prenez aussi peu que possible le plasma et milieu de centrifugation de densité. Ne touchez pas le culot érythrocytaire rouge.
- Wash CMSP. Diviser les CMSP en tubes de 50 ml (4 tubes par couche leucocytaire). Remplir chacun à 50 ml avec du PBS.
- Centrifugeuse 450 g pendant 10 min à température ambiante.
- Retirer et jeter le surnageant, en commun les cellules dans 1 tube avec 10 ml de RPMI / 10% de sérum de veau foetal (SVF) à moyen et resuspendre bien. Si des amas cellulaires sont présents, les cellules souches à travers un tamis cellulaire de 40 pm.
- Transfert des cellules dans T175 culture cellulaire flacon pour adcellules Herent. Rincer les tubes avec 40 ml de milieu et de combiner avec des cellules (50 ml au total). Si nécessaire, retirez une aliquote de cytométrie de flux (voir l'étape 1.4). Habituellement, les cellules T CD4 + comprennent environ 30 à 40% des cellules dans la grille des lymphocytes et des cellules T naïves comprennent environ 30 à 60% des cellules T CD4 + en fonction du donneur.
- Incuber les cellules dans le flacon de pose , de 45 à 90 min à 37 ° C / 5% de CO 2. Cette étape se videra monocytes par adhérence plastique. Il est pas obligatoire, mais augmentera le rendement des cellules T de pourcentage par quantité de PBMC dans les étapes suivantes.
- Resuspendre les cellules (dans 50 ml d'un milieu contenu dans le ballon) et rincer la couche de cellules sur le fond du flacon puits. Distribuer les cellules de façon égale en deux tubes de 50 ml (les tubes précédents peuvent être réutilisés pour le même donneur). Rincer flacon avec 50 ml frais / 10% FCS RPMI, et transférer également dans les mêmes 2 tubes.
REMARQUE: Les PBMC peuvent être stockées pendant une nuit à 4 ° C avec des tubes pose,le côté, ou, idéalement, directement utilisé pour l'isolement des cellules T.
- nTreg Isolation par Magnetic-tri cellulaire activé
- Préparer un tampon d'isolement: 0,5% (p / v) de sérum-albumine humaine et de l'EDTA 2 mM dans du PBS. Toujours garder un tampon à 4 ° C. Alternativement à l'albumine humaine, utiliser l'albumine bovine.
- Resuspendre et compter PBMC avec un compteur automatique ou manuel cellule en présence de bleu trypan (ne pas compter de petites plaquettes). Si des amas cellulaires sont observées, les cellules souches à travers un tamis cellulaire de 40 pm.
- CMSP centrifuger à 450 xg pendant 10 min à température ambiante.
- Resuspendre les cellules (avec 1 ml d'une pipette) dans 90 ul de tampon d'isolement par 10 7 PBMC pour obtenir une suspension cellulaire unique. Gardez les cellules dans les originaux tubes de 50 ml (2 tubes par couche leucocytaire).
- Ajouter 2 perles ul de CD25 par 10 7 cellules, mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C.
- Remplir avec du PBS à 30 ml. Centrifuger à 450 xg pendant 10 min à 46; C.
- Préparer les colonnes LS (2 par couche leucocytaire): équilibrer avec 3 ml de tampon d'isolement, et jeter les traverser. Les tubes peuvent être réutilisés pour rincer autres colonnes.
- Resuspendre les cellules dans 3 ml de tampon d'isolement par tube (avec 1 ml pipette). Transfert des cellules à LS colonne, et de recueillir l'écoulement à travers en frais tubes de 15 ml.
- Rincer les tubes de 50 ml avec 2 ml Isolement tampon chacun. Transfert du tampon de rinçage aux colonnes.
- Laver la colonne 2x avec 3 ml Isolement tampon chacune. Toujours attendre jusqu'à ce que la colonne arrêté égouttement, avant d'ajouter tout nouveau liquide. Magasin circuler à travers à 4 ° C pour les étapes ultérieures.
- Retirer la colonne de l'aimant. Eluer 2x avec 3 ml de tampon d'isolement par colonne en tube de 15 ml.
REMARQUE: L'éluat de 2 colonnes par donneur peuvent être combinées. Ne pas plonger la colonne dans le liquide. - Préparer et équilibrer les nouvelles LS colonnes (1 colonne par couche leucocytaire). Transférer l'éluat de la colonne à 2.1.11. L'écoulement à travers peut être mis au rebut. Après éluat a passed à travers la colonne, rincer tube et colonne de lavage 3x avec 3 ml de tampon d'isolement.
NOTE: La deuxième colonne est cruciale nécessaire pour augmenter la pureté. - Retirer la colonne de l'aimant. Eluer CD25 de "nTregs" de 2x avec 3 ml de tampon d'isolement.
- Centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant complètement.
- Laver les cellules avec 15 ml de milieu de culture de cellules T, centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant complètement.
- Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de milieu de culture de cellules T, supplémenté avec 100 UI / ml d'IL-2, chacune d'elles. Transfert des cellules à plaque de 24 puits. Tube de rinçage avec 0,5 ml de milieu (+ 100 UI / ml d'IL-2) et combiner en plaque de 24 puits.
- Le comte nTregs (comme à l'étape 1.2.2). Le rendement est habituellement d' environ 1-4 x 10 6 Tregs par couche leucocytaire. Ajuster la densité des Treg à 1-2 x 10 6 cellules / ml avec du milieu de culture de cellules T + 100 UI / ml d' IL-2.
- Incuber Treg à 37 ° C / 5% de CO 2 jusqu'à son utilisation.
REMARQUE: Prenez circuler à travers l'étape 1.2.8-1.2.10 de procéder à l'isolement cellulaire. Par ailleurs, si aucun nTregs ont été isolés, passez directement à partir de PBMC.- Combinez 2 tubes par donneur de CMSP Treg appauvries dans 50 ml tube. Remplir avec du PBS à 50 ml à la température ambiante.
- CMSP centrifuger à 200 g pendant 5-10 min à température ambiante. Retirer et jeter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 50 ml de PBS.
- Répétez l'étape deux fois 1.3.2.
NOTE: Les lavages de PBS sont cruciales pour l'élimination des plaquettes, qui ne seront pas enlevés avec le kit d'isolement négatif suivant. Les plaquettes restent dans le surnageant de cette centrifugation à basse vitesse. Platelet épuisement peut être contrôlé dans les différentes étapes sur une lame microscopique. Les étapes doivent être effectuées avec du PBS et centrifugations à la température ambiante. - Resuspendre CMSP dans 50 ml de PBS. Compter les cellules comme dans l'étape 1.2.2.
- CMSP centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter les cellules et remettre en suspension dans le surnageant 40 ul de tampon d'isolement (4 ° C) pour 10 7 cellules.
- Ajouter 10 ul de Naïf CD4 + T cellulaire Cocktail biotine-Antibody II par 10 7 cellules.
- Mélanger et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
- Laver les cellules par addition de 40 ml de PBS (4 ° C) et centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 80 pi de tampon d'isolement par 10 7 cellules.
- Ajouter 20 ul de microbilles anti-biotine pour 10 7 cellules. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C.
- Remplir à 50 ml avec du PBS froid et centrifuger 450 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Préparer les colonnes LS (avec 3 ml équilibrer tampon d'isolement). Pour éviter une surcharge de la colonne, utilisez une colonne pour au maximum 250 x 10 6 PBMC, ou moins si CMSP contiennent beaucoup de globules rouges.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension caunes dans un tampon 3 ml d'isolement. Transfert des cellules à la colonne LS. Recueillir l' écoulement à travers, qui contient les cellules T CD4 + naïfs, en tubes de 15 ml.
- Rincer le tube avec un tampon d'isolement 2 ml. Transfert à la colonne.
- Laver la colonne 3x avec 3 ml de tampon d'isolement. Toujours attendre que la colonne arrête goutte à goutte, avant d'ajouter tout nouveau liquide.
- Prenez le débit à travers (cellules T CD4 + naïfs) et centrifuger 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Les colonnes peuvent être jetés.
- Retirer le surnageant complètement. Laver les cellules avec 15 ml de milieu, centrifugeuse 450 xg pendant 10 min à température ambiante et retirer le surnageant complètement.
REMARQUE: un tampon d'isolation contient de l'EDTA, qui chélate des ions calcium et altère ainsi l'activation des lymphocytes T. Avant que les essais de stimulation, retirer le tampon d'isolement complètement et laver les cellules deux fois avec 15 ml de milieu. - Remettre en suspension les cellules T du milieu de culture cellulaire à 2-3 x 10 6 cellules par ml. cellules de repos à flacon approprié or bien pendant la nuit dans l'incubateur. Si les cellules sont utilisées directement pour les tests de stimulation, lavez-les une fois de plus avec le milieu.
- Pureté Contrôle Coloration
- Prenez ~ 50.000 cellules (Tnaïve; nTreg; CMSP) chacune, dans 20 pl.
NOTE: Si les deux Tnaïve et le panneau nTreg doivent être tachée, prendre 2 échantillons chacun. - Préparer 2x concentré prémélange d'anticorps (dans du PBS) en fonction de l'instrument, par exemple: Tnaïve panel: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8 eFlour450 1: 8. Pour le panneau Treg, remplacer CD45RO-PE avec CD25-PE, 1:10.
NOTE: Seuls certains anticorps CD25, qui reconnaissent des épitopes différents que les CD25-microbilles, peut être utilisé pour colorer nTregs isolées avec des microbilles CD25. - Ajouter 20 ul d'anticorps pré-mélange à 20 ul des cellules. Préparer également des colorations uniques pour chaque fluorochrome ( en utilisant un échantillon contenant des cellules positives, par exemple, les CMSP) et un échantillon non coloré, cytométrie de flux settings et compensation.
- Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Remplir chaque échantillon avec 200 pi de PBS et centrifuger 450 xg pendant 5-10 min.
- Ramasser cellules cellules activées par fluorescence (FACS) tampon (= tampon d'isolement sans EDTA) et d'analyser par cytométrie en flux. La pureté des cellules T CD4 + naïves est généralement> 95% (voir la figure 2).
- Prenez ~ 50.000 cellules (Tnaïve; nTreg; CMSP) chacune, dans 20 pl.
2. Treg Induction Culture
- Préparation de stimulation des médias et plaques
- Préparer et préchauffer le milieu de culture des cellules T: moyenne hématopoïétique sans sérum supplémenté avec 2 mM de L-alanyl-L-glutamine.
- Préparer cytokine, un anticorps de stimulation et les concentrations de stocks composés.
- Préparer IL-2 solution stock: 400.000 UI / ml dans l'acide acétique 100 mM stérile filtré (avec filtre anti-acide) (167 pg / ml si l'activité du lot utilisé est de 2400 UI par 1 ug; confirmer avec le fournisseur). Aliquote à liaison 0,5 ml tubes à faible protéine stérilisée, sceller avec du Parafilm, geler sur glace sèche et conserver à -80 ° C pour le stockage à long terme ou à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
- Préparer la solution mère de TGF-β1 (pour 10 ug flacon, sans support): poudre Centrifugeuse TGF-β1 (1000 xg 3 min), ajouter 100 pi de HCl 4 mM (stérilisée par filtration avec filtre résistant à l'acide) pour préparer une solution d'achat d'actions avec 100 ug / ml, on laisse se dissoudre complètement; vortex. Aliquotes 5 pi chacun à la liaison tubes de 0,5 ml à faible protéine stérilisée, sceller avec du Parafilm, gèlent sur glace sèche et conserver à -80 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
- Préparer ATRA solution mère: Dissoudre la poudre à 20 mg / ml (66,6 mM) dans le DMSO. Préparer une solution stock de 10 mM par dilution dans du DMSO et stocker aliquotes, protégé de la lumière, à -80 ° C pendant jusqu'à 1 an. ATRA est sensible à la lumière, la chaleur et l'air.
- Préparer la solution de rapamycine stock: 1 mg / ml (1,11 mM) dans le DMSO, magasin en aliquotes à -80 ° C pourjusqu'à 1 an.
- Préparer butyrate solution stock de sodium: 0,908 M (0,1 mg / ml) de bouillon dans stérile H ultra-pure 2 O et filtre stérile. Aliquoter et conserver à -20 ° C.
- Préparer des prémélanges 4x concentré (50 ul par puits) dans un milieu de culture T cellulaire comme dans le tableau 1.
- Le jour précédent, les plaques d'enveloppe avec un anticorps anti-CD3. Manteau désiré nombre de puits de plaque de 96 U puits avec 5 ug / ml anticorps anti-CD3 dans du PBS, 65 pl / puits. Enveloppez la plaque avec une feuille et incuber une nuit à 4 ° C.
NOTE: Ne pas utiliser les puits de marge de plaques 96 puits. des puits plus grands peuvent être utilisés, mais des puits en forme de U facilitent l'utilisation des mêmes nombres de cellules par unité de surface à travers les expériences. Si plusieurs cellules sont nécessaires, en commun la quantité requise de puits après culture. En général, après 4-6 jours d'expansion, 2 puits de chaque échantillon sont suffisantes pour une analyse de cytométrie en flux et l'analyse de l'ARN.- Le jour du dépôt, peu avant le placage, retirer anti--CD3 solution de puits. Remplir les puits avec 200 pl / puits de PBS. Retirer PBS. Répéter le lavage avec 200 pl / puits de PBS. Retirer PBS complètement et utiliser des plaques immédiatement.
- Préparer des plaques (ne pas utiliser les puits de marge):
- Pour chaque puits, ajouter 50 ul de 4x anti-CD28 / IL-2 pré-mélange (sauf pour les cellules "non stimulés", ajouter T milieu de culture cellulaire), 50 pi de 4x TGF-β1 pré-mélange (pour tous iTregs) ou d'une culture de lymphocytes T 50 ul moyen pour "stimulation seulement" contrôle maquette, 50 pi 4x ATRA, ATRA / rapamycine ou butyrate prémélange (le cas échéant) ou du milieu
- Remplir tous les puits vides, y compris les puits de marge, avec 200 ul de PBS. Plaques Préchauffage à 37 ° C / 5% de CO 2.
- Préparer Naïf cellules T pour Placage
- Après des cellules au repos, transfert à tube de 15 ml, rincer flacon / puits avec un milieu de culture cellulaire préchauffée T et la piscine à tube. Remplir le tube à 15 ml avec du milieu de culture de lymphocytes T. </ Li>
- Centrifuger les cellules à 450 xg pendant 10 min à température ambiante.
- Retirer moyen et prendre des cellules dans un milieu frais, préchauffé T culture cellulaire à une densité de 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Compter les cellules comme dans l'étape 1.2.2 et ajuster la densité si nécessaire.
- Ajouter des cellules à des plaques de stimulation préparées (voir 2.1), 50 cellules / puits (110,000-130,000 cellules / puits). Chacun doit bien maintenant contenir un volume total de 200 pi.
- Envelopper les plaques dans du papier d'aluminium pour protéger ATRA de la lumière; incuber à 37 ° C / 5% de CO2 pendant des périodes de temps souhaitées.
- Surveiller Treg Induction Culture
- Surveiller les cultures Treg par microscopie optique (40X grossissement). Jour d'environ 2 à 3, de petites grappes de cellules qui prolifèrent doivent être visibles, ce qui se fondent dans de plus grands pôles aux points temporels ultérieurs. Cultures cultivées avec de la rapamycine se développent en général moins. Voir aussi la figure 3.
- Aux points de temps désirés, prélever des échantillons pour l'ARN extraction ou par cytométrie de flux phénotypage (voir ci-dessous). Pour les points de temps plus tard , avec la prolifération des cellules, 1 chaque puits est suffisant, prendre autrement 1 x 10 5 -1 x 10 6 cellules chacune pour l' ARN et 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellules cytométrie de flux.
- Évaluation FOXP3 Stabilité
- Pour évaluer la stabilité du phénotype iTreg comme décrit précédemment 22,27, laver iTregs deux fois avec du milieu de culture de cellules T et iTregs de culture supplémentaires en T du milieu de culture cellulaire soit sans soit avec un anticorps anti-CD3 et CD28 anti- restimulation comme décrit dans 2.1 et 2.2 . Ajouter des cytokines, telles que 50 UI / ml d'IL-2, pour étudier leur influence sur la stabilité FOXP3.
- Aux points de temps désirés, prélever des échantillons pour l' extraction de l' ARN, par cytométrie de flux phénotypage (voir ci - dessous), et l' analyse de la méthylation TSDR comme décrit 22,28.
3. Analyse phénotypique des iTregs par qRT-PCR
- Préparation deéchantillons
- Aux points de temps désirés, prendre 1 x 10 5 à 1 x 10 6 cellules par échantillon pour l' extraction de l' ARN. Transfert des cellules à un tube de 1,5 ml sans RNase, et centrifuger à 500 g pendant 5 min.
- Si nécessaire, enlever une partie du surnageant et congeler pour le dosage de immuno-enzymatique (ELISA) ou une analyse similaire. Éliminer le surnageant restant complètement à partir de cellules. Passez directement à l'extraction de l'ARN ou congeler culot cellulaire sur glace sèche et conserver à -20 ° C à -80 ° C pendant jusqu'à 2 semaines.
- Extraire l' ARN et effectuer qRT-PCR pour FOXP3 et un gène de ménage (tel que Rpl13a) selon des protocoles standards. En outre, mesurer l' expression d'autres gènes de signature Treg (par exemple `Treg up' gènes IL2RA, CTLA4, IKZF4 et` Treg gènes down' IFNg, SATB1).
4. Analyse phénotypique par cytométrie de flux
NOTE: Ce protocole est optimisé pour la tachement au format de plaque de puits 96U avec 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellules. S'il y a moins de cellules par puits, commencer avec plusieurs puits et piscine comme décrit ci-dessous.
- Cellule restimulation (Facultatif)
- Si une coloration pour les cytokines intracellulaires est souhaitée, les cellules d'impulsion avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) / ionomycine en présence d'un inhibiteur du transport des protéines.
NOTE: Cette procédure n'a pas d'influence l'expression FOXP3 dans les cultures iTreg décrites ci-dessus, mais d'autres marqueurs peut changer - par exemple, CD4 est downregulated. - Préparer 10x Brefeldin A / PMA / ionomycine prémélange (20 pi par puits) en T milieu de culture cellulaire: brefeldine Une solution de stock 1: 100, ionomycine (stock 5 pg / pl) 1: 1300, PMA (stocks 12,35 pg / pl, pré -dilute 1: 1235) 1: 100 de stock pré-dilué.
- 4 heures avant la coloration, ajouter 20 ul Brefeldin A / PMA / ionomycine 10x mélange par puits pour obtenir des concentrations d'extrémité de 1: 1000 Brefeldin A, 0,5 μM (375 ng / ml) ionomycine, 10 ng / ml de PMA.
- Laisser incuber pendant 4 heures à 37 ° C / 5% de CO 2
- Si une coloration pour les cytokines intracellulaires est souhaitée, les cellules d'impulsion avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) / ionomycine en présence d'un inhibiteur du transport des protéines.
- Coloration de surface
REMARQUE: Le panneau suggéré ici est une suggestion; d'autres panneaux peuvent être utilisés en fonction des antigènes d'intérêt et de configuration de l'instrument.- Refroidir PBS sur la glace. Préparer un tampon FACS (PBS avec 0,5% de sérum albumine humaine, HSA) et laisser refroidir sur glace. BSA ou de FBS peuvent être utilisés comme une alternative à la SAH.
- cellules Re-plaque en plaque coloration: les cellules Resuspendre avec une pipette et transférer les cellules dans une nouvelle plaque de puits 96U, laissant un puits libre autour de chaque puits (afin d'éviter des retombées dans la procédure de coloration plus tard). Si moins que le nombre de cellules souhaitées sont présentes dans le puits d'origine, enlever une partie du surnageant avant la remise en suspension, et la piscine de plusieurs puits dans une coloration bien.
- plaque Centrifugeuse 400 xg pendant 10 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant. Verser le surnageant dans la boîte de déchets, laisser la plaque à l'enversvers le bas et immédiatement (sans se retourner la plaque) appuyez sur la plaque une fois sur du papier absorbant. Puis tourner immédiatement la plaque arrière. plaque de Vortex pour remettre en suspension les cellules dans le liquide restant.
- Ajouter 25 ul prémélange de coloration de surface (CD25-PE 1/20, CD4-PerCP 1: 5 dans un tampon FACS) et resuspendre.
NOTE: Inclure aussi des colorations uniques pour chacun des fluorochromes utilisés avec des échantillons qui contiennent des cellules positives pour l'antigène respectif; et inclure un échantillon souillures. Ceux-ci seront nécessaires pour la configuration de la compensation de l'instrument. Vous pouvez également utiliser des billes de compensation. - Incuber 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Ajouter 200 ul de PBS, plaque centrifugeuse 400 xg pendant 10 min à 4 ° C et retirer le surnageant comme décrit à l'étape 4.2.4. plaque de Vortex.
- Répétez l'étape deux fois 4.2.7.
- viabilité coloration
REMARQUE: Viabilité coloration est indispensable, car après fixation / perméabilisation des cellules mortes ne peuvent pas être exclus par suffisammentfsc / ssc et peuvent donner lieu à des signaux non spécifiques. Un colorant pouvant être fixé sur la viabilité doit être utilisé.- Resuspendre les cellules dans 130 ul viabilité tache prémélange (viabilité fixable colorant eFlour780 1: 1400 dans du PBS) et les cellules immédiatement resuspendre avec la pipette multicanal.
NOTE: Inclure aussi une seule coloration pour le colorant de viabilité contenant les cellules mortes, par exemple, les cellules T non stimulées en culture pendant plusieurs jours ou de tuer des cellules par application de chaleur que par les instructions du fabricant. Ceux-ci seront nécessaires pour la compensation. - Incuber 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- plaque Centrifugeuse à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant comme à l'étape 4.2.4. plaque de Vortex.
- Remplir avec un tampon FACS 200 pi. Répétez l'étape 4.3.3.
- Remplir avec 200 ul de PBS. Répétez l'étape 4.3.3.
- Resuspendre les cellules dans 130 ul viabilité tache prémélange (viabilité fixable colorant eFlour780 1: 1400 dans du PBS) et les cellules immédiatement resuspendre avec la pipette multicanal.
- Coloration intracellulaires avec FOXP3 Coloration Buffer Set
- Pour chaque puits, préparer: tampon / Perm 150 ul Fix (dilué Fix / Perm concentrate 1: 4 avec le diluant); 850 ul de tampon de perméabilisation 1x (dilution 10x tampon de perméabilisation 01:10 à ultra-pur H 2 O).
- Après tourbillonnement, remettre les cellules dans un tampon / Perm 150 ul Fix et immédiatement remises en suspension avec une pipette. Il est important de remettre en suspension immédiatement pour éviter la fixation des amas de cellules.
Attention: le tampon de fixation contient paraformaldehyde et doit être manipulé et jeté de manière appropriée. - Incuber 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Ajouter 100 ul de PBS froid. Centrifuger à 850 g pendant 10 min à 4 ° C.
NOTE: A partir de cette étape en avant la vitesse de centrifugation est augmentée pour éviter la perte de cellules. Après fixation, les cellules deviennent invisibles et les soins devraient être prises pour éliminer les surnageants comme décrit à l'étape 4.2.4 et immédiatement après la centrifugation est terminée pour minimiser la perte de cellules. - Retirer le surnageant comme décrit à l'étape 4.2.4. plaque de Vortex.
NOTE: La coloration peut être interrompue à cette étape; dansce cas, laver les cellules deux fois avec 200 ul de PBS; puis prendre dans 250 ul de PBS et stocker à 4 ° C, à l'abri de la lumière. Les cellules peuvent être stockées pendant quelques jours, puis procéder à la perméabilisation. Cependant, des résultats optimaux sont obtenus lorsque directement continué à perméabilisation. - Après tourbillonnement, ajouter 200 ul de tampon de perméabilisation. Centrifuger à 850 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant comme décrit à l'étape 4.2.4. plaque de Vortex.
- Ajouter 200 ul de tampon de perméabilisation à remettre en suspension.
NOTE: Ici, les échantillons peuvent être divisés en coloration intracellulaire et de l'échantillon de contrôle isotypique (enlever la moitié de chaque échantillon). Si le nombre de cellules sont limitants, un échantillon de isotype commun peut être préparé (à emporter 10-20 ul de chaque échantillon et la piscine). En outre, les échantillons peuvent être prélevés pour Fluorescence-Minus-One (FMO) contrôles. - Centrifuger à 850 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant comme décrit à l'étape 4.2.4. plaque de Vortex.
- granulés Remettre en suspension dans44 pi de tampon de perméabilisation plus 1 ul de sérum de souris normal (prémélangé) pour bloquer la liaison non spécifique.
NOTE: Cela vaut si les anticorps utilisés dans l'étape suivante sont des isotype murin. Si d' autres anticorps, tels que les dérivés de rat sont utilisés, comprennent le sérum approprié pour le blocage (par exemple, du sérum de rat). - Incuber à 4 ° C pendant 15 min dans l'obscurité.
- Ajouter des anticorps:
REMARQUE: Renseignez les concentrations d'anticorps pour les lots spécifiques. Dans le cas contraire effectuée à l' étape 4.2 avec des anticorps dirigés contre des antigènes de surface (par exemple, CD4) avec des fluorochromes respectifs, comprennent également des colorations individuelles pour chacun des fluorochromes utilisés avec des échantillons qui contiennent des cellules positives pour la compensation.- Ajouter 15 ul d'anticorps pré-mélange à des échantillons (sauf pour les colorations individuelles, des échantillons non colorés, des échantillons de contrôle isotypique et les contrôles FMO): Prémélange par échantillon: 0,7 ul (0,35 ug) anti-interféron gamma (IFN-γ) -FITC (le cas échéant après restimulation ),2,3 pi (0,115 ug) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 pi (0,05 ug) Anti-FOXP3-APC, 10 ul de PBS.
- Pour isotype échantillons de contrôle, ajouter 15 ul d'anticorps isotype prémélange, en utilisant les mêmes quantités d'anticorps que pour les anticorps utilisés dans 4.4.11.1: prémélange par échantillon: 0,7 pi (0,35 pg) FITC souris IgG1 K isotype contrôle (le cas échéant), 0,58 ul (0,115 ug) IgG2a-BV421 souris isotype, 0,5 pi (0,05 pg) souris IgG1 K contrôle isotypique APC, 13,2 ul de PBS.
- Pour les contrôles FMO, ajouter des anticorps comme dans 4.4.11.1, le remplacement d'un anticorps chacun avec PBS.
- Incuber à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
- Ajouter 200 ul de tampon de perméabilisation. Centrifugeuse, retirer le surnageant et vortex comme à l'étape 4.4.8. Répéter une fois.
- Resuspendre les cellules dans un tampon FACS à froid (volume en fonction de l'instrument utilisé) et d'acquérir, idéalement immédiatement, sur la cytométrie de flux.
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Representative Results
La figure 1 montre un schéma du dispositif expérimental. La figure 2 montre une coloration de contrôle de pureté représentant pour les cellules T CD4 + naïves magnétiquement isolées et nTregs.
F igure 3A montre la cytométrie en flux stratégie de déclenchement et la figure 3B montre FOXP3 et CD25 représentant de cytométrie de flux Colorations le jour 6 de la culture dans les conditions iTreg ou de contrôle indiqués. Lors d'une stimulation in vitro, la plupart des cellules régulent positivement CD25, qui est réduit en présence de rapamycine. Seulement pour l'addition de facteurs iTreg induisant une population claire de FOXP3 + cellules devient apparente, qui est également enrichi dans les cellules CD25 + dans des conditions iTreg. La figure 3C représente l'aspect phénotypique des cultures iTreg dans le microscope avec la prolifération des cellules considérées comme des grappes sombres. Chaque i état Treg montre un motif spécifique et reproductible de la prolifération cellulaire: Dans ces conditions de culture, le TGF-β augmente légèrement la prolifération, et ATRA augmente encore la prolifération. Dans le même temps, l'inhibition de la prolifération de la rapamycine est évident par la taille de grappe fortement réduite. L'aspect microscopique de la force de prolifération correspond également à nombre total de cellules (données non comprises).
Figure 4 résultats affiche représentatifs de qRT-PCR analyses de FOXP3 ARNm induction dans iTreg (et contrôle) cultures à différents points de temps. En ce qui concerne la protéine FOXP3, expression FOXP3 ARNm est plus élevé dans toutes les iTregs par rapport aux cellules témoins stimulées, avec iTregs rapamycine traités ayant un niveau relativement bas par rapport à d' autres iTregs. FOXP3 ARNm dans nTregs est plus élevé que dans iTregs.
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Figure 1: Schéma expérimental pour iTreg induction, nTreg l' isolement et l' analyse Treg. Cellules naïves humaines T CD4 + ont été isolés à partir de couches leucocytaires et stimulées dans un milieu sans sérum avec des anticorps anti-CD28 anti-CD3 et ainsi ml d' IL-2 pendant 6 jours, soit en l'absence (cellules 100 U / `simulacres de commande ') ou en présence de différents facteurs Treg inducteurs ( `iTreg') comme indiqué. nTregs sont isolés et analysés en parallèle. L'analyse phénotypique peut être effectuée par cytométrie en flux et la qRT-PCR. Modifié à partir de Schmidt, A. et al. 2016 22. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: la pureté des cellules de départ populations. CD humain Naïf 4 + T cellules ont été isolées par le Kit cellule d'isolement Naïf CD4 T II, humain. Panneau supérieur: la pureté des cellules Naïf T CD4 +, sur la base des CD4, CD45RA et CD45RO, était de 94 à 98% et la pureté d'un donneur représentatif de plus de 30 est représenté ( `Tnaïve'). Ex vivo de lymphocytes T régulateurs ( `nTreg') ont été isolés en utilisant des quantités limitées de microbilles CD25 et utilisé comme témoin positif pour les expériences iTreg. nTreg la pureté d'un donneur représentatif, basé sur CD25 et CD4, est représentée. Panneau inférieur: coloration FOXP3 intracellulaires (réalisée comme dans la figure 3 et pré-dépendants sur les cellules CD4 + en direct) est indiqué pour les cellules et nTregs T CD4 + naïfs respectivement, en utilisant des cellules provenant du même donneur que dans le panneau supérieur. Modifié à partir de Schmidt, A. et al. 2016 22. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: l' aspect phénotypique des iTregs et nTregs. Cellules naïves humaines T CD4 + ont été cultivées dans un milieu sans sérum dans les conditions indiquées. Les cellules T ont été stimulées avec des anticorps anti-CD28 et anti-CD3 et de 100 U / ml d'IL-2 ( `Stim.'). Le cas échéant, le TGF-β1 ( `TGF'), la rapamycine (` Rapa'), tout-trans acide rétinoïque ( `ATRA') ou butyrate ont été ajoutés. nTregs (ex vivo Les cellules isolées périphérique CD25 de sang ++) ont été laissés non stimulées ( `unstim.') et utilisé comme témoin positif. cellules T naïves non stimulées ont été utilisées comme contrôle négatif. (A) Au jour 6 de la culture, les cellules ont été colorées avec des anticorps de surface , y compris l' anti-CD25 et anti-CD4, puis colorées avec fixable colorant de viabilité et par la suite fixes / perméabilisées et colorées au niveau intracellulaire avec des anticorps anti-FOXP3 et anti-CTLA-4 ou d'un isotype suite anticorps Rol. Acquisition et l'indemnisation a été réalisée sur un flux Cyan ADP cytomètre et les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo. La stratégie de déclenchement est indiqué par les flèches rouges, et l'exemple représenté est un échantillon iTreg induite par TGF + ATRA. (B) Les cellules ont été colorées comme dans (A), et FOXP3 et CD25 expression dans les cellules et iTregs induites par différents protocoles T contrôle est signalée. Les parcelles de pseudocolor montrent FOXP3 et CD25 colorations représentatives pour un donateur, pré-fermée sur singlet, vivre les cellules CD4 + comme dans (A). L'exemple de isotype est montré pour un iTreg (stim. + TGF + ATRA) échantillon. (C) des images de microscopie représentatifs (40X) de chaque puits 96U-plaque de cellules cultivées pendant 4 jours. grappes sombres de cellules représentent des cellules proliférantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figure 4: expression de l' ARNm FOXP3 lors de l' utilisation de différents protocoles de différenciation iTreg. iTregs ont été générés comme sur la figure 3 dans les conditions indiquées, et au niveau des points de temps donnés, des échantillons de cellules ont été prélevés et l' ARN a été extrait. T naïves cellules non stimulées et non stimulées nTregs, ont été prélevés au jour 0. Des échantillons ont été analysés par qRT-PCR, l' ARNm et l' expression FOXP3 a été normalisée à l' expression Rpl13a pour chaque échantillon. Expression FOXP3 ARNm dans les cellules T naïves non stimulées a été fixé à 1, et pliez changement de FOXP3 ARNm a été calculé. Montré sont des valeurs moyennes et la gamme de PCR répliquent des puits pour un donneur représentatif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit permet l'induction robuste de CD4 humaine + FOXP3 + iTregs de cellules naïves humaines T CD4 +. Elle comprend un nouveau protocole que nous avons récemment décrit, en utilisant une combinaison de TGF-β, l' ATRA et de la rapamycine, pour l' induction de iTregs in vitro avec fonction supérieure de suppression 22. Par rapport aux autres protocoles publiés, un autre avantage réside dans l'induction de diverses populations iTreg en parallèle par différents protocoles, ce qui permet la comparaison directe des effets de certains facteurs iTreg inducteurs, ainsi que des cellules de contrôle qui sont activées en présence d'IL-2 seule . Les protocoles décrits permettent l'induction reproductible de FOXP3 avec une faible variation des donateurs. Lymphocytes T CD4 + naïfs dans ce protocole sont isolés par tri magnétique de cellules activées, mais le tri cellulaire activé par fluorescence est également possible. Le rendement attendu des cellules T CD4 + naïfs avec ce protocole est typiquement comprise entre 5-10%, mais dépend fortement du donneur (âge) et apparaît également plus faible lorsque des fractions élevées de globules rouges sont présents. Si une estimation est nécessaire, les CMSP peuvent être colorées (voir étape 1.4) lors de l'étape monocytes d'épuisement. En règle générale, le rendement des cellules T CD4 + naïves est d' environ la moitié des «cellules naïves en pourcentage T CD4 + de la grille de lymphocytes" dans la coloration des CMSP. Ce protocole utilise des quantités limitées de perles CD25 pour obtenir (nTreg) cellules CD25 haute 29. Cependant, ce ne sont pas Tregs purs, mais ceux-ci sont tout simplement enrichis en Tregs pour être utilisé comme témoin positif. Si Tregs purs sont nécessaires, d' autres kits doivent être utilisés (tels que combiné avec l' enrichissement CD4 et CD127-épuisement) ou encore, CD25 + pré-enrichis avec 8 ul de perles de CD25 par 10 7 cellules et colorées et triées par cellule activé par fluorescence le tri avec le déclenchement de strictes CD4 + CD25. Aussi l'inclusion d'autres marqueurs, tels que l'exclusion CD127, devrait être envisagée.
_content "> Il est important de considérer que FOXP3 est nécessaire, mais pas suffisante pour conférer Treg identité 30. Bien que iTregs peuvent être utilisés pour étudier certains aspects de, par exemple, la régulation de FOXP3, il est cependant important de noter que iTregs diffèrent nTregs dans plusieurs aspects. Il est donc crucial de nTregs de culture (idéalement issus du même donneur) en parallèle à iTregs dans tous les tests de comparaison. la différence entre nTregs et iTregs est illustré par seulement chevauchement partiel du transcriptome nTreg et iTreg telle que mesurée dans iTregs murins 31. Autres gènes Treg de signature en plus de FOXP3 doivent être mesurés pour cette raison, et pour assurer la discrimination de l' expression FOXP3 induite par activation dans les cellules humaines. par exemple, iTregs devrait afficher une expression plus élevée du CD25, CTLA-4 et EOS comparés aux cellules T activées alors que l'expression de l'IFN-γ et SATB1 devrait être faible en nTregs et iTregs induits par les protocoles décrits ici, tel que publié antérieurementModification de iTreginductrices protocoles par l' addition de composés (tels que la vitamine C ou le sulfure d'hydrogène) , qui ont une influence sur dix onze Translocation (TET) Les enzymes dioxygénase méthylcytosine, comme il est décrit très récemment , 32-34, peut ajouter à la stabilisation FOXP3 en affectant méthylation de l' ADN. En outre, la force de stimulation et de synchronisation a une influence sur l' expression et la stabilité 35 FOXP3. En ce sens, l'utilisation d'anticorps CD3 à la place d'anticorps lié à la plaque / CD28 couplés à des billes a été montrée pour augmenter iTreg in vivo de la fonction et la stabilité suppressif de souris mais indépendante de TSDR 36 déméthylation. Un autre facteur qui doit être considérée comme une source potentielle de variation est l'utilisation de sérum, qui contient des facteurs indéfinis, y compris TGF-β qui, même d'une source bovine est de 100% réactivité croisée avec des cellules humaines. En outre, la source et l'activité de l'IL-2 peuvent considérablement influencer les résultats de l'induction FOXP3.
Une f importanteossier de Tregs est leur capacité suppressive, qui doit être testé ultérieurement avec iTregs générés dans ce protocole. Il convient de noter que les tests de suppression avec iTregs ne sont pas négligeables et la littérature sur les capacités suppressives de iTregs est controversée. Plusieurs méthodes et protocoles pour évaluer la fonction suppressive des Tregs humains ont été publiés ailleurs 22,37 - 41, avec in vitro des tests de prolifération sur la base de cytométrie de flux lectures telles que la dilution de carboxyfluorescéine de l'ester (CFSE) étant le plus couramment utilisé. Il est important de se laver et se reposer iTregs avant utilisation dans des essais de suppression, et il doit être considéré que iTregs, contrairement à nTregs, peuvent ne pas être anergiques mais se multiplier au cours des essais de suppression. Nous considérons qu'il est extrêmement important d'utiliser `mock' stimulé les lymphocytes T en tant que cellules de contrôle suppresseurs pour identifier le degré de suppression non spécifique (par exemple par CTLA-4 expression, IL-2 consomption et de la culture surcroissance par les cellules T activées) qui est sans rapport avec FOXP3 + Treg effets spécifiques, et l'absence fréquente de ce contrôle peuvent contribuer à certaines controverses dans la littérature. En utilisant cette commande, nous avons défini que seul TGF-ß / iTregs ATRA / Rapa-induits présentaient une activité suppressive in vitro 22. Ainsi, nous concluons que concernant l'activité suppressive (mais pas la plus élevée fraction de FOXP3 + cellules), le TGF-β / ATRA / Rapa est la meilleure combinaison de facteurs des protocoles décrits pour induire iTregs. Néanmoins, l' activité suppressive in vitro ne reflète pas nécessairement l' activité suppressive in vivo, et en effet nous avons déterminé que iTregs humains générés par ces protocoles ne suppriment pas dans un greffon contre -host modèle de maladie xénogénique au moins dans les conditions testées 22. Cela peut être lié à l' expression FOXP3 instable qui a été perdu dans iTregs sur restimulation, en ligne avec un manque de TSDR déméthylation 22
Selon quel aspect de caractéristiques iTreg (haute fraction de FOXP3 + cellules, activité suppressive supérieure, la stabilité de FOXP3) est le plus important pour une question de recherche particulière, différents protocoles peuvent être le plus approprié pour étudier ces questions, ce qui rend difficile la définition du général «meilleur «protocole pour Treg induction. En outre, plusieurs différences subtiles expérimentales décrites ci-dessus peuvent influer sur les résultats et peuvent contribuer à des controverses en ce qui concerne la fonction de phénotype et suppressive de TGF-ß induite-iTregs qui apparaissent entre les rapports , même avec des protocoles apparemment similaires pour la génération iTreg 42. Par exemple, même dans un laboratoire, nous avons observé que iTregs induites par le TGF-β et l' IL-2 dans un milieu RPMI contenant du sérum affichent une activité suppressive par rapport aux cellules de contrôle 27, tandis que iTregs TGF-β / IL-2 induite générée en définie, le milieu de culture de cellules T sans sérum n'a pas 22 dalgré des niveaux similaires de FOXP3.
Les futures applications basées sur ces protocoles devraient viser à optimiser les conditions d'induction Treg pour obtenir un phénotype avec l'expression FOXP3 stable, TSDR déméthylation, phénotype stable sans conversion en cellules T effectrices cytokine production et de l'activité suppressive optimale. Poursuite de l'élaboration de protocoles d'induction iTreg peut être utile pour le transfert adoptif des approches à l'avenir, dans lequel la thérapie par transfert Treg est très prometteur pour le traitement potentiel des maladies auto-immunes et inflammatoires.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |
| anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |
| anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |
| anti-human CD45RA, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |
| anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |
| Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99.7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |
| Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |
| Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
| GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |
| human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| Human serum albumin 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg | eBioscience | 11-4714-81 | |
| mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |
| Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |
| Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |
| Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |
| T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |
| TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution: contains paraformaldehyde |
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution: contains paraformaldehyde |
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
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