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Immunology and Infection

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l'induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.

Introduction

Cellule T regolatorie CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) sopprimere le altre cellule del sistema immunitario e sono mediatori critici di tolleranza periferica, impedendo autoimmunità ed eccessiva infiammazione 1. L'importanza di Tregs è esemplificata dalla malattia umana sindrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia legata all'X (IPEX), in cui la perdita di Tregs a causa di mutazioni nel master' Treg fattore di trascrizione forkhead box P3 `(FOXP3) porta ad una grave malattia autoimmune sistemica, letale in tenera età. Tuttavia, Tregs agire come una spada a doppio taglio nel sistema immunitario in quanto possono anche ostacolare l'immunità anti-tumorale in alcune impostazioni 2. manipolazione terapeutica del numero e della funzione Treg è quindi soggetto a numerose indagini cliniche. Nel cancro, l'esaurimento delle Tregs può essere desiderabile e un certo successo degli approcci clinici incoraggia ulteriori ricerche 3. Nelle malattie autoimmuni e infiammatorie, in aggiunta agli effetti terapeutici di Tregs in sevemodelli di malattia del mouse RAL, recenti prove in-man di trasferimento adottivo Treg per prevenire graft- contro -host malattia (GvHD) 4-7 e per valutare la sicurezza nel trattamento del diabete di tipo 1 8 ha mostrato risultati molto promettenti.

Presenti in natura Tregs (nTregs) comprendono tTregs timiche-derivati e pTregs perifericamente indotte, con funzioni essenziali non ridondanti nel mantenimento della salute 9 - 11. Tuttavia, i numeri nTreg sono limitate, favorendo l'approccio complementare di indurre Tregs (iTregs) in vitro da precursori delle cellule T naive 12. Ancora stabilità iTregs, presumibilmente a causa della mancanza di demetilazione nella cosiddetta regione demetilato Treg-specifico (TSDR) nel locus genico FOXP3 13, rimane una preoccupazione e diversi studi indicano che in vivo indotto Tregs sono più stabili 14.

Fino ad oggi, FOXP3 rimane la migliore proteina mArker per Tregs ma non è assolutamente specifica perché convenzionali cellule CD4 + CD25- T umani transitoriamente esprimono livelli intermedi di FOXP3 all'attivazione 15,16. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire la regolazione dell'espressione FOXP3, resta molto da scoprire per quanto riguarda l'induzione, la stabilità e la funzione di FOXP3 in particolare nelle cellule umane. Nonostante le differenze a nTregs, in vitro indotta FOXP3 + cellule T CD4 + possono essere utilizzati come sistema modello per studiare i meccanismi molecolari dell'induzione FOXP3 e come punto di partenza per sviluppare protocolli in futuro che consentono la generazione di iTregs più simili al vIVO generato Tregs, che potrebbe essere applicabile per le strategie di trasferimento adottivo in futuro.

Non vi è alcun `protocollo d'oro standard' per indurre iTregs umani, e attuali protocolli sono stati sviluppati sulla base di mimare condizioni Treg-inducono in vivo: interleuchina 2 (IL-2) E fattore di crescita trasformante β (TGF-β) di segnalazione sono cruciali per l'induzione FOXP3 in vivo 17, e all-trans retinoico (ATRA) - che è prodotto in vivo dalle cellule dendritiche intestinali associate - viene spesso utilizzato per migliorare l'induzione FOXP3 in vitro 18 - 21. Abbiamo sviluppato ulteriori protocolli Treg-inducono umani utilizzando butirrato 22, un acido grasso a catena corta flora intestinale di derivazione che è stato recentemente dimostrato per aumentare murino Treg induzione 23,24. Abbiamo inoltre recentemente istituito un nuovo protocollo per la generazione di iTregs con funzione di soppressiva superiore in vitro utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina 22, quest'ultimo è un mammalian target clinicamente approvato rapamicina (mTOR) inibitore che è noto per la promozione manutenzione FOXP3 durante umana espansione Treg 25,26.

Questo metodo descrive la riproducibile invitro generazione di CD4 umana + FOXP3 + iTregs utilizzando una serie di condizioni diverse, e la loro successiva fenotipizzazione mediante citometria di flusso e la reazione quantitativa inversa a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) per rivelare i modelli specifici del protocollo di espressione di FOXP3 e altre molecole di firma Treg tali come CD25, CTLA-4, EOS, così come la repressione di IFN-γ e di espressione SATB1 22. Le popolazioni cellulari generati possono essere utilizzati per saggi funzionali relative attività soppressiva o per studi molecolari, né riguardo regolatori generali FOXP3 o per studiare gli effetti specifici di alcuni composti come butirrato o rapamicina. Ulteriore comprensione dei meccanismi molecolari di guida differenziazione Treg è molto importante per i futuri approcci terapeutici in autoimmunità o il cancro per indirizzare specificamente molecole coinvolte nella generazione e la funzione Treg.

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Protocol

cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono stati appena isolati da anonimi donatori sani buffy coats acquistati dal Karolinska University Hospital, in Svezia. permesso di etica per gli esperimenti è stata ottenuta dalla Ethical Review Board regionale a Stoccolma (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Svezia (numero di omologazione: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. T isolamento delle cellule da sangue periferico

  1. Isolamento PBMC
    1. Pre-lay 15 ml media densità centrifugazione (come Ficoll) soluzione in provette da 50 ml (5 tubi per buffy coat). Pre-caldo a temperatura ambiente.
    2. Riempire buffy coat con tampone fosfato salino (PBS) (temperatura ambiente) a 180 ml. Se si utilizza sangue fresco, diluire il sangue con uguale volume di PBS.
    3. tubo di inclinazione di lato e media densità centrifugazione lentamente sovrapposizione con ~ 35 ml di sangue diluito per provetta. Aggiungere il sangue molta attenzione, senza alcuna miscelazione della centrifugazione densità medfase di IUM e lo strato di sangue.
    4. Centrifugare 20 min a 1150 xga temperatura ambiente senza freno. Azionare la centrifuga senza freno e, se possibile da bassa a media di accelerazione per evitare la miscelazione degli strati.
    5. Estrarre l'anello bianco contenente PBMC tra la media densità centrifugazione e la fase di plasma. Trasferire in un tubo da 50 ml (1 volta con 5 ml pipetta e 2 volte con 2 ml-Pasteur plastica pipetta). Prendere il meno possibile al plasma e media densità centrifugazione. Non toccare la pallina rossa degli eritrociti.
    6. Lavare PBMC. Dividere le PBMC in provette da 50 ml (4 tubi per buffy coat). Riempire ogni a 50 ml con PBS.
    7. Centrifugare 450 xg per 10 min a temperatura ambiente.
    8. Rimuovere e scartare il surnatante, in comune le cellule in 1 tubo con 10 ml RPMI / 10% di siero fetale bovino (FCS) medio e risospendere bene. Se grumi di cellule sono presenti, le cellule Filtrare con un colino cella di 40 micron.
    9. Trasferire le cellule in pallone di coltura cellulare T175 per l'annunciocellule Herent. Risciacquare provette con 40 ml di mezzo e si combinano con le cellule (50 ml in totale). Se necessario, rimuovere un'aliquota per citometria a flusso di analisi (vedi punto 1.4). Solitamente, le cellule T CD4 + costituiscono circa il 30-40% delle cellule nel cancello linfociti e cellule T naive comprendono circa 30 al 60% di cellule T CD4 + a seconda del donatore.
    10. Incubare le cellule in posa matraccio per 45 a 90 minuti a 37 ° C / 5% CO 2. Questo passaggio si riducono monociti dal aderenza plastica. Non è obbligatorio, ma aumenta la resa delle cellule T di percentuale quantità di PBMC nei seguenti passaggi.
    11. Risospendere le cellule (in 50 ml di mezzo contenute nel pallone) e risciacquo strato di cellule sul fondo del pallone ben. Distribuire le cellule equamente in due provette da 50 ml (i tubi precedenti possono essere riutilizzati per lo stesso donatore). Risciacquare pallone con 50 ml fresca / 10% di media RPMI FCS, e trasferire altrettanto negli stessi 2 tubi.
      NOTA: PBMC possono essere conservati a 4 ° C con i tubi, che sulato, o idealmente, utilizzato direttamente per l'isolamento delle cellule T.
  2. nTreg isolamento da Cell Sorting magnetico attivato
    1. Preparare buffer di isolamento: 0,5% (w / v) di albumina di siero umano e 2 mM EDTA in PBS. Tenere sempre tampone a 4 ° C. In alternativa all'albumina umana, usare albumina bovina.
    2. Risospendere e contare PBMC con un contatore di cellule automatica o manuale in presenza di trypan blu (non contano piccole piastrine). Se si osservano grumi di cellule, le cellule filtrare con un colino cella di 40 micron.
    3. PBMC centrifugare a 450 xg per 10 min a temperatura ambiente.
    4. Risospendere le cellule (con 1 ml pipetta) in 90 microlitri tampone di isolamento per 10 7 PBMC di ottenere una sospensione di cellule singole. Mantenere le cellule in originale provette da 50 ml (2 tubi per buffy coat).
    5. Aggiungere 2 ml perline CD25 per 10 7 cellule, mescolare e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
    6. Riempire con PBS a 30 ml. Centrifugare a 450 xg per 10 min a 46; C.
    7. Preparare LS colonne (2 per buffy coat): equilibrare con 3 ml tampone di isolamento, ed eliminare il flusso attraverso. I tubi possono essere riutilizzati per sciacquare ulteriori colonne.
    8. Risospendere le cellule in 3 ml di tampone di isolamento per tubo (con 1 ml pipetta). Trasferire le cellule a LS colonna, e raccogliere il flusso attraverso freschi provette da 15 ml.
    9. Lavare le provette da 50 ml con 2 ml di isolamento tampone ciascuna. Trasferimento risciacquo tampone alle colonne.
    10. Lavare colonna 2x con 3 ml di isolamento tampone ciascuna. Attendere sempre che la colonna si fermò stillicidio, prima di aggiungere qualsiasi nuovo liquido. Conservare fluire attraverso a 4 ° C per le fasi successive.
    11. Rimuovere colonna dal magnete. Eluire 2x con 3 ml di tampone di isolamento per colonna in 15 ml di tubo.
      NOTA: L'eluato da 2 colonne per donatore può essere combinato. Non immergere la colonna nel liquido.
    12. Preparare ed equilibrare le nuove colonne LS (1 colonna per mano Buffy). Trasferire l'eluato dalla 1.2.11 alla colonna. Il flusso attraverso può essere scartata. Dopo eluato ha passed attraverso la colonna, risciacquare tubo e lavare colonna 3x con 3 ml di tampone di isolamento.
      NOTA: La seconda colonna è cruciale necessaria per aumentare la purezza.
    13. Rimuovere colonna dal magnete. Elute CD25 ++ 2x "nTregs" con 3 ml di buffer di isolamento.
    14. Centrifugare a 450 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante.
    15. Lavare le cellule con 15 ml di mezzo di coltura cellulare T, centrifugare a 450 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante.
    16. Risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzo di coltura cellulare T, integrati con 100 IU / ml di IL-2, ciascuno. Trasferire le cellule a 24 pozzetti. tubo di risciacquo con 0,5 ml di mezzo (+ 100 IU / ml di IL-2) e combinare in 24-pozzetti.
    17. Contare nTregs (come nel passaggio 1.2.2). La resa è di solito circa 1-4 x 10 6 Tregs per buffy coat. Regolare la densità di Tregs a 1-2 x 10 6 cellule / ml con terreno di coltura cellulare T + 100 IU / ml di IL-2.
    18. Incubare Tregs a 37 ° C / 5% di CO 2 fino al momento dell'uso.
    + T naive CD4 isolamento delle cellule da Cell Sorting magnetico attivato
    NOTA: Prendere il flusso attraverso la procedura dal punto 1.2.8-1.2.10 per procedere con l'isolamento delle cellule. In alternativa, se non nTregs sono stati isolati, procedere direttamente da PBMC.
    1. Unire 2 tubi per donatore di PBMC Treg-impoverito in 50 ml tubo. Riempire con PBS a 50 ml a temperatura ambiente.
    2. PBMC centrifugare a 200 xg per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 50 ml di PBS.
    3. Ripetere il punto 1.3.2 due volte.
      NOTA: I lavaggi PBS sono cruciali per la rimozione delle piastrine, che non verranno rimossi con il seguente kit di isolamento negativo. Le piastrine rimangono nel supernatante di questa centrifugazione a bassa velocità. deplezione di piastrine può essere monitorato nei singoli passaggi su un vetrino microscopico. I passaggi devono essere eseguiti con PBS e centrifugazioni a temperatura ambiente.
    4. Risospendere PBMC in 50 ml di PBS. Contare le celle come al punto 1.2.2.
    5. PBMC centrifugare a 450 xg per 10 minuti a 4 ° C. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 40 microlitri tampone di isolamento (4 ° C) per 10 7 cellule.
    6. Aggiungere 10 ml di + T naive CD4 cellulare biotina-anticorpo cocktail II per 10 7 cellule.
    7. Mescolare e incubare per 10 minuti a 4 ° C.
    8. Lavare le cellule aggiungendo 40 ml di PBS (4 ° C), e centrifugare a 450 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 80 microlitri di buffer di isolamento per 10 7 cellule.
    9. Aggiungere 20 ml di microperle anti-biotina per 10 7 cellule. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
    10. Riempire a 50 ml con PBS freddo e centrifugare 450 xg per 10 min a 4 ° C.
    11. Preparare colonne LS (equilibrare con 3 ml tampone di isolamento). Per evitare un sovraccarico di colonna, utilizzare una colonna per al massimo 250 x 10 6 PBMC, o meno se PBMC contengono molte globuli rossi.
    12. Rimuovere il surnatante e risospendere cells nel buffer di 3 ml di isolamento. Trasferire le cellule a colonna LS. Raccogliere flusso attraverso, che contiene le cellule T CD4 + naive, in provette da 15 ml.
    13. Risciacquare tubo con tampone di isolamento 2 ml. Trasferire alla colonna.
    14. Lavare colonna 3x con 3 ml tampone di isolamento. Attendere sempre che la colonna si ferma stillicidio, prima di aggiungere qualsiasi nuovo liquido.
    15. Prendere il flusso attraverso (cellule T CD4 + naive) e centrifugare a 450 xg per 10 minuti a 4 ° C. Le colonne possono essere scartati.
    16. Rimuovere completamente il surnatante. Lavare le cellule con 15 ml di mezzo, centrifugare 450 xg per 10 min a temperatura ambiente e rimuovere completamente il surnatante.
      NOTA: buffer di isolamento contiene EDTA, che chela gli ioni di calcio e danneggia quindi l'attivazione delle cellule T. Prima di ogni test di stimolazione, rimuovere il tampone di isolamento completamente e lavare le cellule due volte con 15 ml di mezzo.
    17. Risospendere le cellule in mezzo di coltura delle cellule T di 2-3 x 10 6 cellule per ml. cellule riposo in adeguata pallone oR ben oltre la notte in incubatrice. Se le cellule vengono utilizzati direttamente per le prove di stimolazione, lavarli ancora una volta con il mezzo.
  3. Purezza controllo Colorazione
    1. Prendere ~ 50.000 cellule (Tnaïve; nTreg; PBMC) ciascuna, in 20 microlitri.
      NOTA: Se entrambi Tnaïve e il pannello nTreg devono essere macchiato, prendere 2 campioni ciascuno.
    2. Preparare 2x premiscelato anticorpo concentrato (in PBS) a seconda dei casi per lo strumento, per esempio: pannello Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10 CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Per il pannello Treg, sostituire CD45RO-PE con CD25-PE, 1:10.
      NOTA: Solo alcuni anticorpi CD25, che riconoscono epitopi differenti rispetto ai CD25-microsfere, può essere utilizzato per colorare nTregs isolati con microsfere CD25.
    3. Aggiungere 20 ml di anticorpi premiscelato a 20 celle microlitri. Anche preparare singole colorazioni per ogni fluorocromo (utilizzando un campione contenente cellule positive, ad esempio, PBMC) e un campione senza macchia, per citometria a flusso settings e la compensazione.
    4. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
    5. Riempire ogni campione con 200 ml di PBS, e centrifugare a 450 g per 5-10 minuti.
    6. Raccogliere le cellule a fluorescenza delle cellule attivate (FACS) tampone (= buffer di isolamento, senza EDTA) e analizzare in citometria a flusso. La purezza delle cellule T CD4 + naive solito è> 95% (vedi Figura 2).

2. Cultura induzione Treg

  1. Preparazione di stimolazione media e Piastre
    1. Preparare e pre-caldo terreno di coltura delle cellule T: libero di siero-medio ematopoietiche integrato con 2 mM L-alanil-L-glutammina.
    2. Preparare citochine, anticorpi stimolazione e le concentrazioni azionari composti.
      1. Preparare IL-2 soluzione madre: 400.000 UI / ml a 100 mm acido acetico sterile filtrata (con filtro resistente agli acidi) (167 mg / ml se l'attività del lotto utilizzato è di 2.400 UI al 1 mg, confermare con fornitore). Aliquota di sterilizzato vincolante 0,5 ml tubi basso contenuto di proteine, sigillare con parafilm, congelare il ghiaccio secco e conservare a -80 ° C per una conservazione a lungo termine o -20 ° C per un massimo di 3 mesi.
      2. Preparare TGF-β1 soluzione di riserva (da 10 mg fiala, senza carrier): Centrifuga TGF-β1 in polvere (1.000 xg 3 minuti), aggiungere 100 ml di 4 mm HCl (sterile filtrata con filtro antiacido) per preparare soluzione madre con 100 pg / ml, permettono di sciogliere completamente; vortice. Aliquota 5 ml ciascuno per sterilizzare vincolante 0,5 ml tubi basso contenuto di proteine, sigillare con parafilm, congelare il ghiaccio secco e conservare a -80 ° C per un massimo di 6 mesi.
      3. Preparare soluzione madre ATRA: sciogliere la polvere a 20 mg / ml (66.6 mm) di DMSO. Preparare soluzione madre di 10 mm con ulteriore diluizione in DMSO e memorizzare aliquote, al riparo dalla luce, a -80 ° C fino a 1 anno. ATRA è sensibile alla luce, il calore e l'aria.
      4. Preparare la soluzione rapamicina magazzino: 1 mg / ml (1,11 mm) di DMSO, conservare in aliquote a -80 ° C perfino a 1 anno.
      5. Preparare sodio butirrato soluzione madre: 0.908 M (/ ml 0,1 mg) stock in sterili ultra-puri H 2 O e filtro sterile. Aliquota e conservare a -20 ° C.
    3. Preparare 4x premiscele concentrati (50 microlitri per pozzetto) in terreno di coltura cellulare T come in Tabella 1.
    4. Il giorno precedente, piastre cappotto con anticorpo anti-CD3. il numero Coat desiderato di pozzi da 96 U-pozzetti con 5 mg / ml di anti-CD3 anticorpi in PBS, 65 ml / pozzetto. Avvolgere piatto con un foglio e incubare una notte a 4 ° C.
      NOTA: non utilizzare i pozzi di margine di 96 pozzetti. pozzi più grandi possono essere usati, ma pozzetti a U facilitano l'uso degli stessi numeri di cellule per area attraverso esperimenti. Se sono necessarie più celle, in comune la quantità necessaria di pozzi dopo la cultura. Di solito, dopo 4-6 giorni di espansione, 2 pozzetti ogni campione sono sufficienti per l'analisi di citometria di flusso e l'analisi dell'RNA.
      1. Il giorno della placcatura, poco prima placcatura, rimuovere Antisoluzione -CD3 da pozzi. Riempire i pozzetti con 200 l / pozzetto PBS. Rimuovere PBS. Ripetere il lavaggio con 200 ml / pozzetto PBS. Rimuovere PBS completamente e usare le piastre immediatamente.
    5. Preparare piatti (non utilizzare i pozzi di margine):
      1. Per ogni bene, aggiungere 50 ml di 4x anti-CD28 / IL-2 premiscelato (ad eccezione di cellule "non stimolate", aggiungere T mezzo di coltura cellulare), 50 ml 4x TGF-β1 premiscelato (per tutti iTregs) o coltura cellulare T 50 ml mezzo per "solo la stimolazione" controllo finto, 50 ml 4x ATRA, ATRA / rapamicina o butirrato premiscelato (se del caso) o media
      2. Riempire tutti i pozzetti vuoti, compresi i pozzi di margine, con 200 l di PBS. Piastre pre-caldo a 37 ° C / 5% di CO 2.
  2. Preparare cellule naive T per la placcatura
    1. Dopo che le cellule a riposo, trasferimento a 15 ml di tubo, lavare fiasco / pozzi con mezzo di coltura cellulare pre-riscaldato T e la piscina a tubo. Riempire il tubo a 15 ml con terreno di coltura delle cellule T. </ Li>
    2. cellule centrifugare a 450 xg per 10 min a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere medie e prendere cellule, mezzo fresco preriscaldata T coltura cellulare ad una densità di 2.2-2.6 x 10 6 / ml. Contare le celle come nel passaggio 1.2.2 e regolare la densità, se necessario.
    4. Aggiungere le cellule a piastre di stimolazione preparati (vedi 2.1), 50 celle ul / pozzetto (110,000-130,000 cellule / pozzetto). Ogni pozzetto dovrebbe ora contenere un volume totale di 200 microlitri.
    5. Avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per proteggere ATRA dalla luce; incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per periodi di tempo desiderati.
  3. Monitorare Treg Cultura induzione
    1. Monitorare Treg culture al microscopio ottico (40X di ingrandimento). Da circa giorno 2 a 3, piccoli gruppi di cellule proliferanti dovrebbero diventare visibile, che si fondono in gruppi più grandi in momenti successivi. Culture coltivate con rapamicina generalmente crescono meno. Vedi anche figura 3.
    2. A intervalli di tempo desiderati, prelevare campioni di RNA extraction o citometria a flusso fenotipizzazione (vedi sotto). Per momenti successivi con la proliferazione cellulare, 1 e ciascuno è sufficiente, altrimenti prendere 1 x 10 5 -1 x 10 6 cellule ciascuno per RNA e celle 3 x 10 5 -1 x 10 6 per citometria a flusso.
  4. Valutare FOXP3 Stabilità
    1. Per la valutazione della stabilità del fenotipo iTreg come descritto in precedenza 22,27, lavare iTregs due volte con terreno di coltura delle cellule T, e cultura iTregs ulteriormente nel terreno di coltura delle cellule T o senza o con anti-CD3 e restimolazione anti-CD28, come descritto in 2.1 e 2.2 . Aggiungere citochine, come 50 UI / ml di IL-2, per studiare la loro influenza sulla stabilità FOXP3.
    2. A intervalli di tempo desiderati, prelevare campioni per l'estrazione di RNA, citometria a flusso fenotipo (vedi sotto), e l'analisi TSDR metilazione come descritto 22,28.

3. Analisi fenotipica di iTregs da qRT-PCR

  1. Preparazione diCampioni
    1. A intervalli di tempo desiderati, prendere 1 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule per esempio per l'estrazione di RNA. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml RNasi-free, e centrifugare a 500 xg per 5 min.
    2. Se necessario, rimuovere parte del surnatante e congelare per il saggio immunoenzimatico (ELISA) o l'analisi simili. Rimuovere restante surnatante completamente da cellule. Procedere direttamente alla estrazione di RNA o congelare pellet cellulare in ghiaccio secco e conservare a -20 ° C a -80 ° C per un massimo di 2 settimane.
    3. Estrarre RNA ed eseguire qRT-PCR per FOXP3 e un gene housekeeping (come RPL13A) secondo protocolli standard. Inoltre, misurare l'espressione di altri geni firma Treg (ad esempio `Treg up' geni IL2RA, CTLA4, IKZF4, e` Treg down' geni IFNG, SATB1).

4. Analisi fenotipica mediante citometria di flusso

NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per macchiaing in formato piatto ben 96U con 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellule. Se ci sono meno cellule per bene, iniziare con diversi pozzi e piscina come descritto di seguito.

  1. Cellulare restimolazione (opzionale)
    1. Se la colorazione per citochine intracellulari è desiderato, cellule impulsi con Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) / Ionomicina in presenza di un inibitore della proteina di trasporto.
      NOTA: Questa procedura non influenza l'espressione di FOXP3 nelle culture iTreg sopra descritte, ma altri marcatori possono cambiare - per esempio, CD4 è downregulated.
    2. Preparare 10x brefeldina a / PMA / Ionomicina premiscelato (20 ml per pozzetto) in terreno di coltura delle cellule T: brefeldina a soluzione madre 1: 100, Ionomicina (magazzino 5 mg / mL) 1: 1.300, PMA (magazzino 12,35 mg / mL, pre Diluire 1: 1.235) 1: 100 di magazzino pre-diluito.
    3. 4 ore prima della colorazione, aggiungere 20 ml brefeldina a / PMA / Ionomicina 10x mix per pozzetto per ottenere concentrazioni finali di 1: 1.000 brefeldina a, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomicina, 10 ng / ml PMA.
    4. Incubare per 4 ore a 37 ° C / 5% di CO 2
  2. colorazione della superficie
    NOTA: Il pannello suggerito ecco un suggerimento; altri pannelli possono essere utilizzati a seconda delle antigeni di interesse e la configurazione dello strumento.
    1. Raffreddare PBS in ghiaccio. Preparare FACS tampone (PBS con 0,5% di albumina sierica umana, HSA) e lasciare raffreddare su ghiaccio. BSA o FBS possono essere utilizzati come alternativa alla HSA.
    2. cellule Re-piastra in lamiera colorazione: Risospendere le cellule con una pipetta e trasferire le cellule in una nuova piastra ben 96U, lasciando un pozzetto libero attorno a ciascun bene (per evitare di ricaduta in procedura di colorazione più avanti). Se meno di numero di cellule desiderate sono presenti nel pozzo originale, rimuovere parte del surnatante prima risospensione e piscina diverse pozzetti in una colorazione ben.
    3. piatto di centrifuga 400 xg per 10 min a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il surnatante. Riversa surnatante in scatola dei rifiuti, lasciare la piastra a testaverso il basso e subito (senza voltarsi indietro la piastra) toccare la piastra una volta su carta assorbente. Poi subito tornare indietro la piastra. Piastra Vortex per risospendere le cellule in un liquido rimanente.
    5. Aggiungere 25 ml premiscelato superficie colorazione (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 in tampone FACS) e risospendere.
      NOTA: includere anche colorazioni singole per ciascuna delle fluorocromi utilizzati con campioni che contengono le cellule positive per il rispettivo antigene; e comprendono un campione senza macchia. Questi saranno necessari per l'installazione di compensazione dello strumento. In alternativa, utilizzare sfere di compensazione.
    6. Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio.
    7. Aggiungere 200 microlitri di PBS, piatto di centrifuga 400 xg per 10 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante come descritto al punto 4.2.4. piatto Vortex.
    8. Ripetere il punto 4.2.7 due volte.
  3. Viabilità colorazione
    NOTA: Viabilità colorazione è indispensabile, dal momento che dopo la fissazione / permeabilizzazione cellule morte non può sufficientemente essere esclusi dalfsc / SSC e possono dare origine a segnali non specifici. Un colorante vitalità fissabile deve essere utilizzato.
    1. Risospendere le cellule in 130 microlitri vitalità macchia premiscelato (risolvibile vitalità dye-eFlour780 1: 1.400 in PBS) e le cellule immediatamente sospendere nuovamente con la pipetta multicanale.
      NOTA: includono anche una sola colorazione per la tintura la vitalità che contiene le cellule morte, per esempio, le cellule T non stimolati in coltura per diversi giorni o uccidere le cellule mediante l'applicazione di calore, come da istruzioni del fabbricante. Questi saranno necessari per la compensazione.
    2. Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio.
    3. Piastra Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante come al punto 4.2.4. piatto Vortex.
    4. Riempire con 200 microlitri di buffer FACS. Ripetere il punto 4.3.3.
    5. Riempire con 200 ml di PBS. Ripetere il punto 4.3.3.
  4. Colorazione intracellulare con FOXP3 colorazione tamponi
    1. Per ogni bene, la preparazione: 150 ml di buffer Fix / Perm (diluire Fix / Perm concEntrate 1: 4 con il diluente); 850 buffer permeabilizzazione microlitri 1x (diluire buffer 10x permeabilizzazione 1:10 con ultra-puri H 2 O).
    2. Dopo vortex, Risospendere le cellule in 150 microlitri di buffer Fix / Perm e subito risospendere con pipetta. È importante risospendere immediatamente per evitare la fissazione di grumi di cellule.
      Attenzione: Fissazione buffer contiene paraformaldeide e deve essere maneggiato ed eliminato in modo appropriato.
    3. Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio.
    4. Aggiungere 100 ml PBS freddo. Centrifugare a 850 xg per 10 min a 4 ° C.
      NOTA: Da questo punto in poi la velocità di centrifugazione viene aumentata per evitare perdita di cellule. Dopo la fissazione, le cellule diventano invisibili e la cura devono essere prese per rimuovere surnatanti come descritto al punto 4.2.4 e, subito dopo la centrifugazione è finito per ridurre al minimo la perdita di cellule.
    5. Rimuovere il surnatante come descritto al punto 4.2.4. piatto Vortex.
      NOTA: La colorazione può essere messo in pausa in questa fase; inquesto caso, lavare le cellule due volte con 200 ml di PBS; poi prendere in 250 l di PBS e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce. Le cellule possono essere conservate per alcuni giorni, poi procedere con permeabilizzazione. Tuttavia, i risultati ottimali si ottengono quando direttamente continuato a permeabilizzazione.
    6. Dopo vortex, aggiungere 200 microlitri di buffer permeabilizzazione. Centrifugare a 850 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante come descritto al punto 4.2.4. piatto Vortex.
    7. Aggiungere 200 microlitri di buffer permeabilizzazione per sospendere di nuovo.
      NOTA: Qui, i campioni possono essere divisi in colorazione intracellulare e il campione di controllo isotipo (togliere la metà di ogni campione). Se il numero di cellule stanno limitando, un campione isotipo pool può essere preparato (togliere 10-20 ml di ogni campione e piscina). Inoltre, i campioni possono essere presi per fluorescenza-minus-one controlli (FMO).
    8. Centrifugare a 850 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante come descritto al punto 4.2.4. piatto Vortex.
    9. pellet Risospendere in44 buffer di permeabilizzazione microlitri oltre 1 ml di siero normale mouse (premiscelato) per bloccare legame aspecifico.
      NOTA: Questo vale se anticorpi utilizzati nel passaggio successivo sono di isotipo murino. Se si utilizzano altri anticorpi, come derivato da ratto, includere il siero appropriato per blocco (ad esempio, siero di ratto).
    10. Incubare a 4 ° C per 15 minuti al buio.
    11. Aggiungere anticorpi:
      NOTA: Informarsi le concentrazioni di anticorpi per i lotti specifici. Se non fatto in fase 4.2 con anticorpi contro antigeni di superficie (ad esempio, CD4) con i rispettivi fluorocromi, includere anche colorazioni singole per ciascuna delle fluorocromi utilizzati con campioni che contengono le cellule positive per la compensazione.
      1. Aggiungere 15 ml di anticorpi premiscelato a campioni (tranne che per singole colorazioni, i campioni non colorati, campioni di controllo isotipo e controlli FMO): Mangimi per campione: 0,7 ml (0,35 mg) anti-interferone gamma (IFN-γ) -FITC (se applicabile dopo restimolazione ),2,3 ml (0,115 mg) CTLA-4 brillante Viola 421, 2 ml (0,05 mg) anti-FOXP3-APC, 10 ml di PBS.
      2. Per isotipo campioni di controllo, aggiungere 15 ml di anticorpi isotipo premiscelato, utilizzando le stesse quantità di anticorpi come per gli anticorpi utilizzati in 4.4.11.1: Mangimi per campione: 0,7 ml (0,35 mg) FITC controllo isotipico del mouse IgG1 K (se applicabile), 0.58 ml (0,115 mg) del mouse IgG2a-BV421 isotipo, 0,5 ml (0,05 mg) di controllo isotipo del mouse IgG1 K APC, 13.2 ml di PBS.
      3. Per i controlli FMO, aggiungere gli anticorpi come in 4.4.11.1, in sostituzione di un anticorpo ciascuno con PBS.
    12. Incubare a 4 ° C per 30 minuti al buio.
    13. Aggiungere 200 microlitri di buffer permeabilizzazione. Centrifuga, rimuovere il surnatante e vortice come al punto 4.4.8. Ripetere una volta.
    14. Risospendere le cellule in tampone FACS freddo (volume in base allo strumento utilizzato) e acquisire, idealmente subito, il citofluorimetro.

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Representative Results

La figura 1 mostra uno schema del setup sperimentale. La figura 2 mostra una colorazione rappresentante controllo della purezza per le cellule T CD4 + naive magneticamente isolate e nTregs.

F IGURA 3A mostra la citometria a flusso strategia di gating e la Figura 3B mostra FOXP3 rappresentante e CD25 citometria a flusso colorazioni il giorno 6 della cultura nelle condizioni iTreg o di controllo indicati. Dopo stimolazione in vitro, maggior parte delle cellule upregulate CD25, che si riduce in presenza di rapamicina. Solo sotto aggiunta di fattori che inducono iTreg-, una chiara popolazione di cellule FOXP3 + diventa evidente, che è anche arricchito entro CD25 + cellule in condizioni iTreg. La figura 3C illustra l'aspetto fenotipica delle culture iTreg nel microscopio con cellule proliferanti visti come ammassi oscuri. ogni I condizioni Treg mostra un modello specifico e riproducibile di proliferazione cellulare: In queste condizioni di coltura, TGF-β aumenta leggermente la proliferazione, e ATRA aumenta ulteriormente la proliferazione. Allo stesso tempo, l'inibizione della proliferazione rapamicina è evidente dalla dimensione del cluster fortemente ridotte. L'aspetto microscopico di forza proliferazione corrisponde anche alla conta delle cellule totali (dati non inclusi).

Figura 4 mostra i risultati rappresentativi della qRT-PCR analisi dell'induzione FOXP3 mRNA in iTreg (e controllo) culture in diversi momenti. Per quanto riguarda la proteina FOXP3, espressione FOXP3 mRNA è più alto in tutte le iTregs rispetto per controllare cellule stimolate, con iTregs rapamicina-trattati con livelli relativamente bassi rispetto ad altri iTregs. FOXP3 mRNA in nTregs è superiore a iTregs.

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Figura 1: schema sperimentale per l'induzione iTreg, isolamento nTreg, e l'analisi Treg. Naïve cellule T CD4 + umani sono stati isolati da buffy coats e stimolati in mezzo privo di siero con anti-CD3 e anti-CD28 più / `cellule di controllo finte 100 U ml di IL-2 per un massimo di 6 giorni, sia in assenza ( ') o la presenza di diversi fattori Treg inducono ( `iTreg') come indicato. nTregs sono isolati e analizzati in parallelo. L'analisi fenotipica può essere fatto mediante citometria di flusso e qRT-PCR. Modificato da Schmidt, A. et al. 2016 22. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Cell purezza partire popolazioni. Naïve CD umano 4 + T cellule sono state isolate per l'isolamento delle cellule CD4 T Kit Naïve II, umana. Pannello superiore: purezza cellule T CD4 Naïve, sulla base di CD4, CD45RA e CD45RO, era del 94 al 98% e la purezza di un donatore rappresentativo di oltre 30 è mostrata ( `Tnaïve'). Ex vivo Tregs ( `nTreg') sono stati isolati utilizzando quantità limitate di microperle CD25 e utilizzato come controllo positivo per esperimenti iTreg. nTreg purezza di un donatore rappresentante, sulla base di CD25 e CD4, viene mostrato. Pannello inferiore: intracellulare FOXP3 colorazione (eseguita come in Figura 3 e pre-gated cellule vive CD4 +) è indicata per le cellule T CD4 + naive e nTregs rispettivamente, utilizzando cellule dallo stesso donatore nel pannello superiore. Modificato da Schmidt, A. et al. 2016 22. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

S copi "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 3
Figura 3: aspetto fenotipica di iTregs e nTregs. Naïve cellule T CD4 + umane sono state coltivate in terreno privo di siero alle condizioni indicate. Le cellule T sono state stimolate con anticorpi anti-CD28 anti-CD3 piú 100 U / ml di IL-2 ( `Stim.'). Dove indicato, sono stati aggiunti TGF-β1 ( `TGF'), rapamicina (` Rapa'), all-trans retinoico ( `ATRA') o butirrato. nTregs (ex vivo isolate cellule periferiche CD25 sangue ++) sono stati lasciati non stimolate ( `unstim.') e utilizzato come controllo positivo. Le cellule T naive non stimolate sono state usate come controllo negativo. (A) Il giorno 6 della cultura, le cellule sono state colorate con anticorpi di superficie, tra cui anti-CD25 e anti-CD4, poi colorate con tinture viabilità risolvibile e successivamente fisse / permeabilizzate e colorate intracellulare con anti-FOXP3 e anti-CTLA-4 o isotipo CONT anticorpi Rol. Acquisizione e compensazione è stata effettuata su un flusso ciano ADP citometro ed i dati sono stati analizzati con il software FlowJo. La strategia di gating è indicato dalle frecce rosse, e nell'esempio illustrato è un campione iTreg indotto con TGF + ATRA. (B) Le cellule sono state colorate come in (A), ed è indicata FOXP3 e CD25 espressione in cellule T di controllo e iTregs indotti da diversi protocolli. Le trame PseudoColor mostrano rappresentativi colorazioni FOXP3 e CD25 per un donatore, pre-gated sul singoletto, vivere cellule CD4 + come in (A). L'esempio isotipo viene mostrato per un iTreg (stim. + + ATRA TGF) del campione. (C) le immagini di microscopia Rappresentante (ingrandimento 40X) di singoli pozzi 96U-piastra di cellule in coltura per 4 giorni. ammassi oscuri di cellule rappresentano cellule proliferanti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

S copi "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: espressione di mRNA di FOXP3 in conseguenza dell'uso di diversi protocolli per la differenziazione iTreg. iTregs sono stati generati come in figura 3 alle condizioni indicate, e al dato punti di tempo, sono stati presi campioni di cellule e l'RNA è stato estratto. Le cellule non stimolate naive T, e nTregs non stimolati, sono stati campionati al giorno 0. I campioni sono stati analizzati mediante qRT-PCR, e l'espressione di mRNA FOXP3 era normalizzata all'espressione RPL13A per ogni campione. Espressione di FOXP3 mRNA in cellule T naive non stimolate è stato fissato a 1, e piegare il cambiamento di FOXP3 mRNA è stato calcolato. vengono riportati i valori medi e la gamma di PCR replicare pozzi per un donatore rappresentante. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo descritto consente l'induzione robusto di CD4 umana + FOXP3 + iTregs da cellule T CD4 + naive umane. Esso comprende un nuovo protocollo che abbiamo descritto recentemente, utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina, per l'induzione di iTregs con superior funzione in vitro soppressiva 22. Rispetto ad altri protocolli pubblicati, un altro vantaggio è l'induzione di diverse popolazioni iTreg in parallelo da diversi protocolli, che consente il confronto diretto di determinati fattori iTreg inducono, insieme con cellule di controllo che vengono attivati ​​in presenza di sola IL-2 . I protocolli descritti consentono l'induzione riproducibile di FOXP3 con variazione bassa donatore. Naïve cellule T CD4 + in questo protocollo sono isolati dalla separazione delle cellule magnetica attivata, ma la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule è anche possibile. Il rendimento atteso delle cellule naïve T CD4 + con questo protocollo è in genere tra il 5-10%, ma fortemente dipende donatore (età) e appare anche inferiore quando alte frazioni di eritrociti sono presenti. Se è necessaria una stima, PBMC possono essere colorati (vedi punto 1.4) durante la fase di svuotamento dei monociti. In genere, il rendimento delle cellule T CD4 + naive è circa la metà delle "ingenui cellule T CD4 + percentuali del cancello dei linfociti" nella macchia PBMC. Questo protocollo utilizza una quantità limitata di perline CD25 per ottenere cellule CD25 29-alta (nTreg). Tuttavia, questi non sono Tregs puri, ma questi sono solo arricchiti in Tregs per essere usato come controllo positivo. Se sono necessari Tregs puri, altri kit dovrebbero essere utilizzati (come ad esempio in combinazione con CD4 arricchimento e CD127-esaurimento) o, in alternativa, le cellule CD25 + pre-arricchite da 8 microlitri CD25 perle per 10 7 cellule e macchiati e ordinati da cellule di fluorescenza-attivato l'ordinamento con rigorosi CD4 + CD25 ++ gating. Anche l'inserimento di altri marcatori, come ad esempio l'esclusione CD127, dovrebbe essere presa in considerazione.

_content "> È importante considerare che FOXP3 è necessaria, ma non sufficiente a conferire Treg identità 30. Mentre iTregs possono essere utilizzati per studiare alcuni aspetti relativi, per esempio, regolazione FOXP3, è importante tuttavia notare che iTregs differiscono da nTregs in diversi aspetti. e 'quindi fondamentale per nTregs cultura (idealmente derivati ​​dallo stesso donatore) in parallelo a iTregs in tutti i test per il confronto. la differenza tra nTregs e iTregs è esemplificato da solo parziale sovrapposizione del trascrittoma nTreg e iTreg misurata in iTregs murini 31. Altri geni firma Treg in aggiunta a FOXP3 devono essere misurati per questo motivo, e per garantire la discriminazione da espressione FOXP3 attivazione indotta nelle cellule umane. ad esempio, iTregs dovrebbe visualizzare più alta espressione di CD25, CTLA-4 e EOS confronto a cellule T attivate, mentre l'espressione di IFN-γ e SATB1 dovrebbe essere a basso contenuto di nTregs e iTregs indotte dai protocolli descritti qui, come pubblicato in precedenza 13. Anche su scala genomica, è stato descritto che i modelli epigenetici di metilazione del DNA e modificazioni degli istoni in iTregs murine non riflettono i modelli si trovano in nTregs 30. Abbiamo precedentemente descritto che iTregs indotte dal qui descritti protocolli, a differenza nTregs, non hanno mostrato TSDR demetilazione. Di conseguenza, ha perso iTregs FOXP3 quando restimolato, ma ha mantenuto l'espressione di FOXP3 quando ulteriormente coltivate in presenza di IL-2 e senza restimolazione 22. È interessante notare che, iTregs indotte da un protocollo alternativo utilizzando M2 surnatanti macrofagi visualizzata maggiore stabilità FOXP3, nonostante la mancanza di TSDR demetilazione e TGF-β essere causale per l'induzione FOXP3 27.

Modifica del iTregche inducono i protocolli con l'aggiunta di sostanze (come la vitamina C o acido solfidrico) che influenzano Dieci-undici traslocazione (TET) enzimi methylcytosine diossigenasici, come descritto poco tempo fa 32 - 34, può aggiungere a stabilizzare FOXP3 interessando metilazione del DNA. Inoltre, la forza di stimolazione e la tempistica ha un'influenza sull'espressione FOXP3 e stabilità 35. Lungo queste linee, l'uso di tallone accoppiato CD3 anticorpi / CD28 invece di anticorpi piastriformi vincolato ha mostrato di aumentare murino iTreg vivo funzione e stabilità soppressiva in seppur indipendente TSDR demetilazione 36. Un altro fattore che deve essere considerato come una potenziale fonte di variazione è l'uso di siero, che contiene fattori indefiniti compresi TGF-β, che anche da fonte bovina è 100% cross-reattivi con cellule umane. Inoltre, la sorgente e l'attività di IL-2 possono influenzare drasticamente i risultati dell'induzione FOXP3.

Un importante feature di Tregs è la loro capacità soppressiva, che ha bisogno di essere testati successivamente con iTregs generati in questo protocollo. Va notato che i test di soppressione con iTregs non sono banali e letteratura sulla capacità soppressiva di iTregs è controversa. Diversi metodi e protocolli per valutare la funzione soppressiva delle Treg umane sono state pubblicate altrove 22,37 - 41, con saggi di proliferazione in vitro sulla base di citometria a flusso letture come la diluizione del carbossifluoresceina succinimidyl estere (CFSE) è il più comunemente usato. È importante lavare e riposare iTregs prima dell'uso in saggi di soppressione, e deve considerare che iTregs, a differenza nTregs, possono non essere anergic ma si proliferare durante test di soppressione. Riteniamo estremamente importante utilizzare `mock' stimolato le cellule T come cellule di controllo soppressore per identificare il grado di soppressione non specifica (ad esempio attraverso CTLA-4 di espressione, IL-2 consumption e cultura crescita eccessiva da parte delle cellule T attivate) che non è correlato a FOXP3 + Treg effetti specifici, e la frequente mancanza di questo controllo può contribuire ad alcune controversie in letteratura. Utilizzando questo controllo, abbiamo definito che solo TGF-beta / iTregs ATRA / Rapa-indotte visualizzati attività soppressiva in vitro 22. Quindi, possiamo concludere che per quanto riguarda l'attività soppressiva (anche se non più alta frazione di FOXP3 cellule +), TGF-β / ATRA / Rapa è la migliore combinazione di fattori di protocolli descritti per indurre iTregs. Tuttavia, l'attività soppressiva in vitro non riflette necessariamente l'attività soppressiva in vivo, e infatti abbiamo stabilito che iTregs umani generati da questi protocolli non sopprimere in un graft- contro -host modello di malattia xenogenico almeno nelle condizioni testate 22. Questo può essere correlato a espressione di FOXP3 instabile che è stato perso in iTregs su restimolazione, in linea con una mancanza di TSDR demetilazione 22

A seconda di quale aspetto della funzionalità iTreg (un'elevata frazione di FOXP3 + cellule, l'attività soppressiva superiore, stabilità FOXP3) è più importante per una particolare domanda di ricerca, diversi protocolli possono essere più adatto per studiare queste domande, il che rende difficile definire il genere 'migliore 'protocollo per Treg induzione. Inoltre, molte differenze sperimentali sopra descritti sottili possono influenzare i risultati e possono contribuire a controversie rispetto al fenotipo e soppressiva funzione del TGF-beta-indotta iTregs che appaiono tra i rapporti anche con i protocolli apparentemente simili per la generazione di iTreg 42. Ad esempio, anche all'interno di un laboratorio, abbiamo osservato che iTregs indotte con TGF-β e IL-2 in media RPMI siero contenente visualizzati qualche attività soppressiva rispetto alle cellule di controllo 27, mentre iTregs TGF-β / IL-2-indotti generati in definito, mezzo di coltura cellulare esente da siero T non ha 22, donostante simili livelli di FOXP3.

Le future applicazioni basate su questi protocolli dovrebbero sforzarsi di ottimizzare ulteriormente le condizioni di induzione Treg per ottenere un fenotipo con espressione FOXP3 stabile, TSDR demetilazione, fenotipo stabile senza conversione in cellule T effettrici citochine produzione e l'attività soppressiva ottimale. Ulteriore sviluppo di protocolli di induzione iTreg può essere utile per il trasferimento adottivo avvicina in futuro, in cui la terapia mediante trasferimento Treg è molto promettente per il potenziale trattamento di malattie autoimmuni ed infiammatorie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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Immunologia cellule T regolatorie Treg cellule T CD4 + isolamento delle cellule magnetiche, citochine FOXP3 TGF-β IL-2 intracellulare citometria a flusso qRT-PCR
<em>La</em> differenziazione <em>in vitro</em> di cellule CD4 <sup>+</sup> umana FOXP3 <sup>+</sup> indotta da T regolatorie (iTregs) da <sup>cellule</sup> T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti
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Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

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