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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

在从幼稚的CD4 + T细胞的人CD4 + FOXP3 +诱导调节性T细胞（iTregs的）使用含有TGF-β-协议的体外分化

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

本协议描述从幼稚CD4 + T细胞在体外可重复产生和人为调节性T细胞（iTregs的）的表型。不同的协议FOXP3诱导允许与各自的协议获取特定表型iTreg的研究。

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 +调节性T细胞（Treg细胞）抑制其他免疫细胞，并外周耐受的关键介质，防止自身免疫和炎症反应过度1。 Treg细胞的重要性是由人类疾病immunodysregulation多内分泌腺病肠病X连锁综合征（IPEX），其中的Treg的损失，由于在`master' Treg细胞转录因子叉头框P3突变（FOXP3）例举导致严重的全身性自身免疫性疾病，致命自幼。然而，调节性T细胞作为免疫系统，因为他们也可以妨碍某些设置2抗肿瘤免疫力一把双刃剑。调节性T细胞的数量和功能的治疗操纵因此受到众多临床研究。在癌症中，调节性T细胞耗竭可能是可取的，临床的方法取得了一些成功鼓励进一步研究3。在自身免疫和炎性疾病，除了在塞弗Treg细胞的治疗效果拉尔小鼠疾病模型，继Treg细胞转移的最近最早在人的试验，以防止移植物抗 -host病（GVHD）4 - 7和评估安全性在治疗1型糖尿病8显示了非常有前途的结果。

天然存在的Tregs（nTregs）包括在保持健康9胸腺衍生tTregs和外周诱导的pTregs，具有非冗余必要功能- 11。然而，nTreg数量有限，鼓励诱导调节性T细胞（iTregs的） 在体外从幼稚T细胞前体12的补充方法。仍然稳定的iTregs的，大概是由于缺乏在FOXP3基因座13的所谓的Treg特异性去甲基化区域（TSDR）去甲基化，仍令人担忧和若干研究表明， 在诱导的Tregs 体内更稳定14。

迄今为止，FOXP3仍然是最好的M蛋白arker对于调节性T细胞，但也并非绝对特定，因为人类的常规的CD4 + CD25-T细胞中瞬时激活后15,16表达FOXP3的中间水平。虽然显著进展已经阐明FOXP3表达的调节而完成的，仍有许多关于特别是在人类细胞中FOXP3的诱导，稳定性和功能被发现。尽管差异nTregs， 在体外诱导FOXP3 + CD4 + T细胞可以作为一个模型系统以研究FOXP3诱导分子机制和作为起点到在将来开发的协议，其允许产生的iTregs的那些更类似于体内产生的Treg，这可能是适用于在将来继转移策略。

没有`金standard'协议以诱导人的iTregs，和当前的协议都基于模仿Treg细胞诱导条件在体内被开发：白细胞介素-2（IL-2）和转化生长因子β（TGF-β）信号对于FOXP3诱导体内 17是至关重要的，和全反式维甲酸（ATRA） -这是在体内通过肠相关树突细胞产生的-被经常用来增强FOXP3感应在体外 18 - 21。我们已经开发出利用丁酸22中 ，最近显示，以增加鼠Treg的感应23,24一个肠道微生物衍生的短链脂肪酸的其他人Treg诱导协议。我们最近还建立用于产生具有体外优异的抑制功能的iTregs的一个新的协议，通过使用TGF-β，ATRA的组合和雷帕霉素22，后者是雷帕霉素（mTOR的）的临床批准哺乳动物靶抑制剂是已知促进人Treg扩张25,26中FOXP3维护。

该方法描述了在再现的体外代人CD4 + FOXP3 +使用一组不同的条件的iTregs，并通过流式细胞术和定量逆转录聚合酶链反应及其后续的表型的（QRT-PCR），以揭示FOXP3的表达等的Treg签名分子如的协议特定的图案如CD25，CTLA-4，EOS，以及IFN-γ和SATB1 表达 22的压制。所产生的细胞群可用于关于抑制活性官能测定或对分子研究，无论是关于一般的FOXP3调节剂或研究特定的某些化合物，如丁酸盐或雷帕霉素的效果。驾驶Treg细胞分化的分子机制进一步的了解是在自身免疫或癌症的未来治疗方法专门针对参与调节性T细胞的产生和功能分子高度相关。

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Protocol

人外周血单核细胞（PBMC）中新鲜从卡罗林斯卡大学医院，瑞典购买匿名健康供体的血沉棕黄层分离。从区域伦理审查委员会在斯德哥尔摩（Regionalaetikprövningsnämnden我斯德哥尔摩），得到了该实验的伦理许可证，瑞典（批准文号：2013/1458年至1431年/ 1）。

从外周血1. T细胞分离

  1. PBMC隔离
    1. 预先铺设15毫升密度离心培养基在50ml管（每血沉棕黄层5管）（如聚蔗糖）溶液中。预温至室温。
    2. 填充棕黄层用磷酸缓冲盐水（PBS）（室温）至180毫升如果使用了新鲜的血液，血液稀释等体积的PBS。
    3. 倾斜管的侧面和慢慢覆盖密度离心培养基〜35毫升乙酸乙酯稀释血液每管。非常仔细地加血，而不配有密度离心任何混合IUM阶段和血液层。
    4. 在室温下1150 XG无制动离心20分钟。操作离心机不带制动器，如果可能低到中等加速，以防止各层的混合。
    5. 取出含有密度离心介质和等离子体相之间的PBMC的白圈。 （用2ml塑料巴斯德吸管1与时间5毫升吸管和2次）转移到一个新50ml管中。采取尽可能少血浆和密度离心介质。请勿触摸红色红细胞沉淀。
    6. 洗外周血单个核细胞。拆分到外周血50ml试管（每白膜层4管）。每个填充50毫升PBS。
    7. 离心机450 XG在室温下10分钟。
    8. 除去并弃去上清，凝聚细胞变成1管10毫升的RPMI / 10％胎牛血清（FCS）的培养基和悬浮良好。如果细胞团块存在，株细胞通过一个40微米的细胞过滤。
    9. 转移细胞的T175细胞培养瓶中广告赫伦特细胞。冲洗用40毫升培养基的管，并与细胞相结合（50毫升总）。如果需要，删除流式细胞分析等分（见步骤1.4）。一般，CD4 + T细胞包括细胞的约30-40％，在淋巴细胞门，和幼稚T细胞包括取决于供体的CD4 + T细胞的约30％至60％。
    10. 孵育细胞中，在37℃/ 5％CO 2的铺设烧瓶45至90分钟。这一步将塑料消耗坚持单核细胞。这不是强制性的，但将增加每PBMC中的量在下面的步骤的百分比T细胞产量。
    11. 悬浮细胞（在50毫升培养基中所含的烧瓶），并在烧瓶的底部冲洗细胞层良好。分发细胞均分为两个50毫升管（先前管可以被重新用于相同的供体）。冲洗烧瓶用50ml新鲜的RPMI / 10％FCS的培养基中，同样转移到同为2的管。
      注：PBMC中可能过夜，在4℃用管铺设在被存储侧，或理想地，直接用于T细胞分离。
  2. nTreg通过隔离磁激活细胞分选
    1. 制备隔离缓冲液：0.5％（重量/体积）人血清白蛋白和2mM EDTA的PBS中。始终保持缓冲在4℃。可替代地，以人白蛋白，使用牛血清白蛋白。
    2. 悬浮和计数与台盼蓝的情况下自动或手动细胞计数外周血单个核细胞（不计小血小板）。如果细胞团块被观察到的，菌株的细胞通过40微米的细胞滤网。
    3. 在450×g离心，在室温下10分钟离心的PBMC。
    4. 重悬细胞（1毫升移液管）中每10 7 PBMC中90微升隔离缓冲器以获得单细胞悬浮液。细胞保持在原来的50毫升管（每白膜层2管）。
    5. 加入2微升CD25珠每10 7个细胞，混合，孵育在4℃15分钟。
    6. 用PBS填充〜30毫升。离心在450×g离心在4个10分钟6℃。
    7. 准备LS柱（2％白膜层）：用3ml的隔离缓冲平衡，并丢弃流过。管可以被重新用于冲洗进一步列。
    8. 悬浮细胞在每管3毫升隔离缓冲液（用1毫升移液管）。转移细胞LS列，并通过新的15ml试管收集流。
    9. 冲洗50ml试管用2ml隔离缓冲器的每个。转印漂洗缓冲液中的列。
    10. 洗涤塔2×用3ml隔离缓冲器的每个。总是要等到列停滴水，增加任何新液前。储存在4℃下流动通过购买步骤。
    11. 从磁铁删除列。洗脱2次，每列3毫升隔离缓冲器入15ml试管。
      注意：从每个供体2栏洗脱液可以组合。不要蘸列进液。
    12. 准备和平衡新款LS列（每捉鬼外套1列）。从1.2.11转移洗脱液到柱上。通过可以被丢弃流动。经过洗脱液有过时通过列D，冲洗管和洗涤柱3次用3ml隔离缓冲器。
      注：第二列是至关重要需要增加纯度。
    13. 从磁铁删除列。洗脱CD25 +“nTregs”2X用3ml隔离缓冲。
    14. 离心机在450×g离心在4℃下10分钟。完全取出上清液。
    15. 在4℃下洗用15毫升的T细胞培养液，离心分离细胞以450×g离心10分钟。完全取出上清液。
    16. 悬浮细胞在0.5ml的T细胞培养基，补充有100IU / ml的IL-2，每个。转移细胞到24孔板中。冲洗管用0.5ml培养基（+ 100IU / ml的IL-2）和组合成24孔板。
    17. 算nTregs（如在步骤1.2.2）。产量通常为每暗黄层约1-4×10 6调节性T细胞。调节的Treg的密度与T细胞培养培养基+ 100IU / ml的IL-2 1-2×10 6个细胞/ ml。
    18. 在37℃/ 5％CO 2，直到使用孵育的Treg。
    通过磁激活细胞分选幼稚CD4 + T细胞分离
    注：请从步骤1.2.8-1.2.10流经与细胞分离进行。可替代地，如果没有nTregs分离，直接从PBMC中进行。
    1. 结合每Treg细胞耗尽外周血单个核细胞的供体2管50毫升管。用PBS填充至50ml在室温下。
    2. 在200×g离心在室温下5-10分钟离心的PBMC。取出并弃上清。重悬细胞于50ml PBS中。
    3. 重复步骤1.3.2两次。
      注：PBS洗涤对于除去血小板，将不会与下面的负分离试剂盒被移除的关键。血小板在此低速离心留在上清液中。血小板消耗可在上一显微镜载玻片的各个步骤来监控。该步骤必须在室温下用PBS离心进行。
    4. 重悬的PBMC在50毫升PBS中。细胞计数在步骤1.2.2。
    5. 在450 XG在4℃10分钟离心外周血单个核细胞。丢弃上清，重悬细胞每10 7个细胞40微升的分离缓冲液（4℃）。
    6. 加10μl朴素的 CD4 + T细胞生物素标记抗体鸡尾酒II每10 7个细胞。
    7. 混合，孵育在4℃下10分钟。
    8. 通过在4℃下加入40毫升的PBS（4℃），和离心机在450×g离心10分钟，洗涤细胞。在每10 7单元80微升隔离缓冲区中取出上清和悬浮细胞。
    9. 加入20微升每10 7细胞抗生物素微球。拌匀，并在4℃孵育15分钟。
    10. 补至50ml用冷PBS，和离心机450 XG的在4℃下10分钟。
    11. 制备LS柱（用3ml隔离缓冲器平衡）。以避免柱过载，使用一个柱为最大250×10 6个 PBMC中，或更小，如果PBMC中含有多的红血细胞。
    12. 除去上清，重悬Ç厄尔在3ml隔离缓冲器。转移细胞LS列。通过收集流程，其中包含了幼稚的CD4 + T细胞，在15ml试管。
    13. 冲洗用2ml隔离缓冲管。转移到柱上。
    14. 洗涤柱3次用3ml隔离缓冲器。总是要等到列停止淋漓，增加任何新液前。
    15. 取在4℃通过（幼稚CD4 + T细胞）离心机450×g离心10分钟的流动和。列可以被丢弃。
    16. 完全取出上清液。洗涤细胞用15毫升培养基，离心450×g离心10分钟，在室温下和完全除去上清。
      注：隔离缓冲区包含EDTA，其中螯合钙离子，从而削弱了T细胞活化。任何刺激测定法之前，彻底去除隔离缓冲器和用15毫升培养基洗细胞两次。
    17. 重悬在T细胞培养基中的细胞以每毫升2-3×10 6个细胞。休息细胞的适当烧瓶Ø- [R超过晚上在孵化器。如果细胞直接用于刺激试验，洗一次中等。
  3. 纯度控制染色
    1. 就拿〜50,000个细胞（Tnaïve; nTreg;外周血单个核细胞）各在20微升。
      注意：如果Tnaïve和nTreg面板都是被染色，都需要2个样品。
    2. 制备2倍浓缩抗体预混物（在PBS中）以适合的仪器，例如：Tnaïve面板：CD4-PerCP 1：5; CD45RA-FITC 1:10，CD45RO-PE 1:5，CD8-eFlour450 1：8。对于Treg的面板，用CD25-PE，1:10取代CD45RO-PE。
      注意：只有某些CD25抗体，识别比CD25 - 微珠不同表位，可用于染色用CD25微珠分离nTregs。
    3. 加入20微升抗体预混料20微升细胞。还为每个荧光（使用样品含有阳性细胞， 例如 PBMCs）中和未染色样品制备单染色，流式细胞仪设置搜索GS和赔偿。
    4. 孵育在黑暗中在室温下15分钟。
    5. 填用200μl的PBS各样品，和离心机450 xg离心5-10分钟。
    6. 占用在荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（=隔离缓冲器无EDTA）的细胞，并通过流式细胞术分析。幼稚的 CD4 + T细胞的纯度通常为> 95％（参见图2）。

2.调节性T细胞诱导培养

  1. 刺激媒体和板的制备
    1. 准备和预温T细胞培养基：补充有2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的无血清造血介质。
    2. 准备细胞因子，刺激抗体和化合物的浓度股票。
      1. 准备IL-2原液：在无菌过滤（用耐酸过滤器）100毫米醋酸40万IU / ml的，如果使用大量的活性为1微克2400 IU（167微克/毫升;与供应商确认）。等分试样无菌低蛋白结合0.5毫升管，密封用Parafilm，在-80℃下在干冰上并储存冷冻进行长期储存或-20℃长达3个月。
      2. 准备TGF-β1原液（10微克小瓶，无载体）：离心机TGF-β1粉（1000 XG 3分钟），加100微升4毫米盐酸（用耐酸过滤器过滤除菌）准备原液用100微克/毫升，使其完全溶解;涡流。分装5微升至每无菌低蛋白结合0.5毫升管，密封封口膜，在-80℃的干冰和存储冻结长达6个月。
      3. 准备ATRA原液：在DMSO 20毫克/毫升（66.6毫米）溶解粉末。通过在DMSO中，并存储等份进一步稀释，避光制备的10mM的储备溶液，在-80℃下长达1年。 ATRA是光，热和空气敏感。
      4. 在-80℃下进行1毫克/毫升（1.11毫摩尔）的DMSO，存储在等份：制备雷帕霉素原液长达1年。
      5. 在无菌超纯水H 2 O和无菌过滤器0.908 M（0.1毫克/毫升）的股票：准备丁酸钠原液。分装和储存在-20°C。
    3. 准备在T细胞培养基中4倍浓缩的预混物（每孔50微升），如表1。
    4. 就在前一天，外套板与抗CD3抗体。从用5微克/ ml抗CD3抗体在PBS中，65微升96的U-孔板孔中的涂层所需数目/孔。裹板带箔，并在4℃孵育过夜。
      注意：不要使用96孔板保证金井。更大的孔都可以使用，但U形井便于使用相同的细胞数为每区域横跨实验。如果需要更多的细胞，培养后汇集所需的井的数量。一般，膨胀后的4-6天，2个孔各样品是足够的流式细胞分析和RNA分析。
      1. 上电镀的当天，电镀之前不久，除去抗从水井-CD 3解决方案。填孔用200μl/孔PBS中。除去PBS。重复洗涤用200μl/孔PBS中。完全取出PBS，并立即用板。
    5. 准备板（不使用保证金井）：
      1. 对于每个孔，加入50μl的4×抗CD28 / IL-2的预混物（除了“未刺激”细胞，添加T细胞培养基），50微升4倍，TGF-β1预混（对于所有的iTregs）或50微升T细胞培养对于“只刺激”模拟控制介质，50微升4倍ATRA，ATRA /雷帕霉素或丁预混料（如适用）或中
      2. 填补所有井空，包括保证金井，用200微升PBS。在37℃/ 5％CO 2预暖板上。
  2. 准备电镀幼稚T细胞
    1. 休眠细胞后，转移到15ml试管中，用预温T细胞培养基池管冲洗瓶/井。加油管15毫升的T细胞培养基。</ LI>
    2. 离心细胞，在450×g离心在室温下10分钟。
    3. 除去培养基，并采取了细胞在新鲜，预热的T细胞培养基中的2.2-2.6×10 6 / ml的密度。计数细胞步骤1.2.2并根据需要调整密度。
    4. 添加细胞制备刺激板（见2.1），50微升细胞/孔（110,000-130,000个细胞/孔）。每口井现在应该包含的200微升总体积。
    5. 包装在铝箔保护ATRA由轻板;孵育在37℃/ 5％CO 2的所需的时间段。
  3. 监控调节性T细胞诱导培养
    1. 显示器用光学显微镜（放大40倍），调节性T细胞的文化。约2天至3，增殖细胞的小簇应成为可见的，这在稍后的时间点合并成更大的簇。雷帕霉素生长的培养普遍越来越少。参见图3。
    2. 在期望的时间点，采取RNA样品êxtraction或流式细胞仪表型（见下文）。用于与细胞增殖，1以及稍后的时间点每个是足够的，否则取每1×10 5 -1×10 6个细胞用于RNA和3×10 5 -1×10 6个细胞进行流式细胞。
  4. 评估FOXP3稳定性
    1. 对于如前所述22,27评估iTreg表型的稳定性，洗净的iTregs两次以T细胞培养基，并培养的iTregs在T细胞培养基还要么没有或为2.1和2.2中描述的抗CD3和抗CD28再刺激。加入细胞因子，如50 IU / ml的IL-2，研究其对FOXP3稳定性的影响。
    2. 在期望的时间点，采取样品提取RNA，流式细胞仪表型（见下文），和TSDR甲基化分析如所述22,28。

通过定量RT-PCR的iTregs 3.表型分析

  1. 的准备样本
    1. 在所需的时间点，取每个样品1×10 5〜1×10 6个细胞用于RNA提取。转移细胞的不含RNA酶的1.5mL管中，并离心，在500×g离心5分钟。
    2. 如果需要的话，除去上清的一部分，并冻结酶联免疫吸附测定（ELISA）或类似的分析。取下电池完全剩余的上清液。直接进入RNA提取或在-20℃的干冰和储存冷冻细胞沉淀到-80°C至2周。
    3. 根据标准方法提取的RNA并进行定量RT-PCR技术为FOXP3和持家基因（如RPL13A）。此外，测量其它Treg的签名基因的表达（例如`调节性T细胞的基因up' IL2RA，CTLA4，IKZF4，和'调节性T细胞的基因down' IFNG，SATB1）。

4.表型流式细胞仪分析

注：此协议的染色优化ING在96U孔板形式用3×10 5 -1×10 6个细胞。如果有每孔较少的细胞，如下所述开始与几个井和池。

  1. 细胞再次刺激（可选）
    1. 如果细胞内细胞因子染色是期望的，脉冲的细胞与佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）/离子霉素在蛋白质转运抑制剂的存在。
      注：此过程不影响FOXP3表达上述iTreg文化，但其他指标可能改变 - 例如，CD4被下调。
    2. 准备在T细胞的培养液中10倍布雷菲德菌素A / PMA /离子霉素预混剂（每孔20微升）：布雷菲德菌素原液1：100，离子霉素（股票5微克/微升）1：1300，PMA（股票12.35微克/微升，预-dilute 1：1235）1：100的预稀释股票。
    3. 染色前4个小时，每增加20以及布雷菲德菌素微升A / PMA /离子霉素10X组合，以获得1月底浓度：1000布雷菲德菌素A，0.5μM（375毫微克/毫升）离子霉素，10纳克/毫升的PMA。
    4. 孵育4小时，在37℃/ 5％CO 2的
  2. 表面染色
    注意：这里建议该小组的建议;其他面板可以根据感兴趣的和仪器设置的抗原一起使用。
    1. 酷冰PBS。制备FACS缓冲液（PBS中的0.5％人血清白蛋白，人血清白蛋白）和冷冰上。 BSA或FBS可以用作替代的HSA。
    2. 重板的细胞中染色板：悬浮细胞用吸管将细胞转移到一个新的96U孔板，留下一围绕每一孔的分类孔（以防止在以后的染色过程溢出）。如果不到所需的细胞数是存在于原始孔，再悬浮之前去除上清的一部分，和池几个井成染色良好。
    3. 离心机板400 xg离心在室温下10分钟。
    4. 去除上清。倒出上清液进入垃圾盒，上攻离开板下来，马上（义无反顾板）在吸水纸上酶标板一次。于是马上折回板。涡盘悬浮细胞，剩余的液体。
    5. 加入25微升表面染色预混料（CD25-PE 1:20，CD4-PerCP 1：5 FACS缓冲液），并悬浮。
      注：也包括用于每个与包含对各自抗原阳性细胞的样品所使用的荧光染料的单染色;和包括未染色样品。这些将需要仪器补偿设置。或者，使用补偿珠。
    6. 在黑暗中孵育30分钟，在4℃下。
    7. 加入200μl的PBS，离心板400×g离心10分钟，在4℃并在步骤4.2.4所述除去上清液。涡板。
    8. 重复步骤4.2.7两次。
  3. 活力染色
    注：存活力染色是不可缺少的，因为固定/透化后死细胞不能充分通过排除FSC / SSC和可能引起非特异性信号。一个可固定的存活力染料已被使用。
    1. 悬浮细胞在130微升活力染色预混物（定影活力染料eFlour780 1：1,400溶于PBS中），并立即重悬细胞与多通道移液器。
      注：也包括含有死细胞， 例如，未刺激的T细胞培养数天或通过加热如通过制造商的说明杀死细胞活力染料的单个染色。这些将需要的补偿。
    2. 在黑暗中孵育30分钟，在4℃下。
    3. 在400 XG在4℃10分钟离心板。除去上清液作为步骤4.2.4。涡板。
    4. 用200微升FACS缓冲液填充。重复步骤4.3.3。
    5. 用200微升PBS填写。重复步骤4.3.3。
  4. 细胞内染色与FOXP3染色缓冲液套装
    1. 对于每个孔，准备：150微升修复/烫发缓冲（稀修复/烫发浓entrate 1：4稀释液）; 850微升1个通透缓冲液（稀释10倍通透缓冲1:10用超纯水H 2 O）。
    2. 混匀后，悬浮细胞在150微升修复/烫发缓冲区，并立即重悬与吸管。它立即重悬，以避免细胞团块的固定是很重要的。
      注意：固定缓冲液中含有的多聚甲醛，并应被处理并适当丢弃。
    3. 在黑暗中孵育30分钟，在4℃下。
    4. 加入100微升冷PBS。离心机在850×g离心在4℃下10分钟。
      注意：从该步骤起，离心速度增加，以避免细胞的损失。固定后，细胞变得不可见，并应小心除去上清液如步骤4.2.4描述和后立即离心分离完成，以减少细胞的损失。
    5. 如步骤4.2.4描述去除上清液。涡板。
      注：染色可以在该步骤被暂停;在这种情况下，洗涤细胞两次用200μlPBS;然后采取了在250微升PBS，并在4℃储存，避光。所述细胞可存放数天，然后用透继续。然而，当直接继续透最佳结果得以实现。
    6. 混匀后，加入200微升透缓冲区。离心机在850×g离心在4℃下10分钟。如步骤4.2.4描述去除上清液。涡板。
    7. 加入200μl透缓冲区悬浮。
      注意：在这里，可将样品分成细胞内染色和同种型对照样品（带走半各样品）。如果单元格数限制，一个汇集同型的样品，可制备（带走10-20微升每个样品池）。另外，样品可采取荧光减一（FMO）的控制。
    8. 离心机在850×g离心在4℃下10分钟。如步骤4.2.4描述去除上清液。涡板。
    9. 在悬浮颗粒44微升透化缓冲液加1微升正常小鼠血清（预混）阻断非特异性结合。
      注意：这适用于如果在下面的步骤中使用的抗体是鼠同种型。如果其它抗体，例如来自大鼠衍生的，被使用，包括用于阻止（ 例如，大鼠血清）相应的血清。
    10. 孵育在4℃下在黑暗中15分钟。
    11. 添加抗体：
      注：查询抗体浓度的特定批次。如果不是，在步骤4.2以与相应的荧光染料对表面抗原的抗体（ 例如 ，CD4）完成的，还包括为每个包含用于补偿阳性细胞样品用荧光染料的单染色。
      1. 15微升抗体预混物添加到样品（除单个染色，未染色的样品，同种型对照样品和FMO控制）：每个样品预混料：0.7微升（0.35微克）的抗干扰素γ（IFN-γ）-FITC（如果适用的话再刺激后）2.3微升（0.115微克）CTLA-4的亮紫421，2微升（0.05微克）抗FOXP3-APC，10微升PBS中。
      2. 到同种型的对照样品中，添加15微升的同种型抗体预混物，使用相同量的抗体作为用于4.4.11.1使用的抗体的：每个样品预混料：0.7微升（0.35微克）小鼠IgG1ķ同种型对照FITC（如果适用的话），0.58微升（0.115微克）小鼠IgG2a-BV421同型，0.5微升（0.05微克）鼠IgG1ķ同型对照APC，13.2微升PBS。
      3. 对于FMO控制，增加抗体为4.4.11.1，每更换一个抗体与PBS。
    12. 孵育在4℃下在黑暗中30分钟。
    13. 加入200μl透缓冲区。离心，去掉上清，旋涡如步骤4.4.8。重复一次。
    14. 悬浮细胞在冷FACS缓冲液（按体积所用的仪器），并获得理想地立即对流式细胞仪。

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Representative Results

图1示出实验装置的方案。 图2示出了用于磁性分离的幼稚的CD4 + T细胞和nTregs的代表性纯度对照染色。

˚Figure 3A显示仪设门的流动和图3B显示代表FOXP3和CD25流式细胞仪染色的培养6日表示iTreg或控制的条件下。 在体外刺激后，大多数细胞上调CD25，它是在雷帕霉素的存在而降低。仅在加入iTreg诱导因子，FOXP3 +细胞的明确的人口变得明显，这也是CD25 +细胞内iTreg条件下富集。 图3C描绘了iTreg文化与增殖视为暗集群细胞在显微镜的表型外观。每个I Treg细胞条件显示细胞增殖的特异性和可重复性图案：在这些培养条件下，TGF-β的增加增殖略，和ATRA进一步增加增殖。同时，增殖的雷帕霉素的抑制由强减小簇大小是显而易见的。的增殖强度微观外观也对应于总细胞计数（不包括数据）。

图 QRT-PCR的4显示代表性结果分析FOXP3表达诱导iTreg（和对照）在不同时间点的文化。至于FoxP3蛋白，FOXP3表达是在与对照刺激细胞，用相对于其他的iTregs具有相对低水平的雷帕霉素治疗的iTregs所有的iTregs更高。 FOXP3基因在nTregs比iTregs的高。

ES / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg“/>
图1：iTreg感应，nTreg隔离，和Treg分析的实验方案。人类幼稚的 CD4 + T细胞从血沉棕黄层中分离，并在无血清培养基用抗CD3和抗CD28抗体加100U / ml的IL-2为长达6天，或者在不存在（`模拟控制细胞刺激'）或不同的Treg诱导因子的存在所指示的（`iTreg'）。 nTregs被隔离，并在平行测定。表型分析可通过流式细胞术和定量RT-PCR来完成。从施密特，A 等人修改。 2016年22。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2：启动人口的细胞纯度。天然人CD 4 + T细胞由幼稚的CD4 + T细胞分离试剂盒II，人隔离。上图：朴素的 CD4 + T细胞纯度，基于CD4，CD45RA和CD45RO，为94〜98％和30多个有代表性的捐赠者纯度显示（`Tnaïve'）。 离体的Tregs（`nTreg'）通过使用有限数量的CD25微珠分离并用作iTreg实验的阳性对照。有代表性的供体，根据CD25和CD4的nTreg纯度，被示出。下图：细胞内FOXP3染色（如在图3和活CD4 +细胞门控预执行）示出了用于分别幼稚CD4 + T细胞和nTregs，使用来自相同的供体细胞中的上面板。从施密特，A 等人修改。 2016年22。 请点击此处查看该图的放大版本。

ntent“FO：保together.within页=”1“> 图3
图3：的iTregs和nTregs的表型外观。人幼稚CD4 + T细胞均在指定的条件下，无血清培养基中培养。 T细胞用抗CD3和抗CD28抗体加100U / ml的IL-2（`Stim.'）刺激。那里所指出的，TGF-β1（`TGF'），雷帕霉素（`Rapa'），全反式维甲酸（`ATRA'）或丁酸中加入。 nTregs（ 离体分离的外周血CD25 +细胞）左未刺激（`unstim.'）和用作阳性对照。未刺激的幼稚T细胞用作阴性对照。 （A）在培养的第6天，将细胞用表面抗体，包括抗CD25和抗CD4，然后用可固定活力染料染色并随后固定/透化并用抗FOXP3和抗CTLA-4或同种型在细胞内染色染色续 ROL抗体。征用及补偿于青色ADP流式细胞仪进行，并与软件的FlowJo数据进行了分析。门控策略由红色箭头表示，并且示出的例子是与TGF + ATRA诱导的iTreg样品。 （B）中的细胞进行染色如（A），并在控制T细胞和通过不同的协议诱导的iTregs的FOXP3和CD25的表达被示出。该伪图显示了一个供体，在单门前，代表FOXP3和CD25染色，活CD4 +细胞为（A）。同型例子显示为iTreg（STIM。+ TGF + ATRA）样本。 （C）的代表性的显微镜图像培养4天的细胞的个体96U板孔中（40X放大倍率）。细胞的暗集群代表增殖细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

ntent“FO：保together.within页=”1“> 图4
图4：在使用的为iTreg分化不同的协议FOXP3 mRNA的表达。的iTregs 如图3所指示的条件下产生，并且在给定的时间点，取细胞样品和RNA萃取。未刺激的幼稚T细胞和未刺激nTregs，第0天的样品通过qRT-PCR分析被取样，FOXP3表达标准化为每个样品RPL13A表达。在未刺激的幼稚T细胞的FOXP3表达被设置为1，并计算褶皱的FOXP3表达的变化。显示的是平均值和PCR的范围复制井有代表性的捐赠者。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

所描述的协议使人类CD4 + FOXP3 +来自人幼稚CD4 + T细胞的iTregs的鲁棒诱导。它包括我们最近描述的，使用TGF-β，全反式维甲酸和雷帕霉素的组合，对于具有优异的体外抑制功能22的iTregs的感应一个新的协议。相比其他发表的方案，另一个优点是不同iTreg种群的并联感应由不同的协议，从而使的某些iTreg诱导因子效应的直接比较，与在存在单独的IL-2活化的对照细胞沿着。所描述的协议使FOXP3的重现性诱导低捐助的变化。在这个协议中幼稚的 CD4 + T细胞通过磁激活细胞分选分离，但荧光激活细胞分选也是可能的。幼稚的 CD4 + T细胞与本协议的预期收益率通常介于5-10％，但强烈依赖于供体（年龄），并且当红细胞高分数存在出现也更低。如果需要的估计，外周血单个核细胞可以在单核细胞耗竭步骤染色（见步骤1.4）。通常情况下，幼稚的CD4 + T细胞的产率是大约在PBMC染色的“淋巴细胞门控的百分比幼稚CD4 + T细胞”的一半。该协议使用数量有限的CD25珠获得CD25高（nTreg）细胞29。然而，这些都不是纯的Treg，但这些都只是富集的Treg以用作阳性对照。如果需要纯的Treg，其他试剂盒应使用（如与CD4富集和CD127耗尽组合）或可选地，CD25 +细胞每10 7个细胞8微升的CD25微珠富集前和染色，并通过荧光激活细胞分类严格的CD4 + CD25 +门排序。另外，其它标志物，如CD127排斥的包容性，应予以考虑。

_content“>重要的是要考虑到FOXP3是必要的，但不足以赋予的Treg身份30，虽然iTregs的可用于研究的某些方面，例如，FOXP3调节，需要注意的是的iTregs从nTregs不同然而重要的是重要在几个方面。因此，至关重要并行培养nTregs（理想来自相同供体的），以在所有测定的iTregs进行比较。nTregs和iTregs的之间的差由nTreg和iTreg转录的仅部分重叠例举如测鼠的iTregs 31。除了FOXP3其它的Treg签名基因应该为此进行测量，并保证从人类细胞活化诱导的FOXP3表达的歧视。例如，iTregs的应显示的CD25的较高表达，CTLA-4和EOS相比到活化的T细胞，而IFN-γ和SATB1的表达应该在nTregs和由这里描述的方案诱导的iTregs低，如先前所发表的13的FOXP3基因座。还对全基因组规模，它被描述在鼠的iTregs DNA甲基化和组蛋白修饰的后生模式不反映在nTregs 30中发现的模式。我们先前描述了由此处诱导的iTregs描述协议，而相比之下，nTregs，并没有表现出TSDR去甲基化。因此，再刺激时的iTregs丢失FOXP3，但是保持FOXP3表达时的IL-2和无再刺激22存在下进一步培养。有趣的是，通过使用M 2巨噬细胞的上清液的替代协议诱导的iTregs显示的增强的FOXP3的稳定性，尽管缺乏TSDR去甲基化和TGF-β是致病的对FOXP3感应27。

iTreg的修改通过加入影响十11易位（TET）甲基胞嘧啶加氧酶化合物（例如维生素C或硫化氢）的-inducing协议，如最近所描述32 - 34，可能会增加在通过影响DNA甲基化的稳定的FOXP3。此外，刺激的强度和时间对FOXP3表达和稳定性35的影响。沿着这些线路，使用珠耦合CD3 / CD28抗体，而不是平板结合的抗体显示增加鼠iTreg 在体内抑制功能和稳定性尽管独立TSDR去甲基化36。需要被视为变异的潜在来源的另一因素是使用血清的，其中包含未定义的因素，包括TGF-β其中甚至从牛源是人类细胞100％交叉反应性。此外，IL-2的来源及活性可以大大影响FOXP3感应的结果。

一个重要的˚F调节性T细胞的eature是它们的抑制能力，这必须与本协议产生的iTregs随后被测试。应当指出，与iTregs的抑制测定法是不平凡和约的iTregs的抑制能力的文献是有争议的。几种方法和协议，以评估抑制功能的人Treg细胞在别处公布22,37 -基于流式细胞术读数如羧基荧光琥珀酰亚胺酯（CFSE）的稀释41， 在体外增殖测定被最常用的。它洗并在抑制试验使用前休息的iTregs是重要的，而且它需要被认为的iTregs，而相比之下，nTregs，未必无能，但在抑制测定法增殖自己。我们认为这是极为重要的是使用`mock'刺激的T细胞作为对照抑制性细胞，以确定非特异性抑制（例如通过CTLA-4的表达程度，IL-2的消费ption和由活化T细胞培养过生长）是无关的FOXP3 +特异性的Treg效果，并且经常缺乏这种控制可有助于在文献中的一些争议。利用该控制，我们定义仅TGF-β/ ATRA /拉帕诱导的iTregs 体外 22显示抑制活性。因此，我们的结论是关于抑制活性（尽管FOXP3 +细胞的不最高分数），TGF-β/ ATRA /拉帕是所描述的协议因子诱导的iTregs的最佳组合。尽管如此， 体外抑制活性并不一定反映体内抑制活性，而事实上，我们确定由这些协议产生的人的iTregs没有在异种移植物抗 -host疾病模型抑制至少测试22的条件下进行。这可以用缺乏TSDR脱甲基化22的涉及到将其在在再刺激的iTregs丢失不稳定FOXP3表达，在线路

取决于其中iTreg特征方面（FOXP3 +细胞的高分数，优异抑制活性，FOXP3稳定性）是为特定的研究问题最重要的是，不同的协议可能是最合适的，以研究这些问题，使其难以界定大致'最好“协议调节性T细胞的诱导。此外，一些上述细微差别的实验会影响结果，并可能导致争议方面，即使对于iTreg代42显然类似的协议报告之间出现TGF-β诱导的iTregs的表型和抑制功能。例如，即使在一个实验室中，我们观察到，在含有血清的RPMI培养基中的TGF-β和IL-2诱导的iTregs显示一些抑制活性相比，控制单元27，而在产生的TGF-β/ IL-2诱导的iTregs定义，无血清的T细胞培养基没有22，Despite FOXP3的相似水平。

根据这些协议未来应用应该努力进一步优化调节性T细胞的诱导条件下实现稳定FOXP3的表达，去甲基化TSDR，稳定的表型的表型，无需转换产生细胞因子的效应T细胞和最佳的抑制活性。用于过继转移在未来，其中治疗由调节性T细胞转移是自身免疫和炎性疾病的潜在治疗极有希望的途径的iTreg诱导方案进一步发展可能是有用的。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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<em>在</em>从幼稚的CD4 <sup>+</sup> T细胞<sup>的</sup>人CD4 <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup>诱导调节性T细胞（iTregs的）使用含有TGF-β-协议的<em>体外</em>分化
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