Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Дифференциация человеческого CD4 + FOXP3 + Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает воспроизводимую генерацию и фенотипирования человеческих индуцированных регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток в пробирке. Различные протоколы для индукции FOXP3 позволяют для изучения конкретных фенотипов iTreg, полученных с помощью соответствующих протоколов.

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 + регуляторные Т - клетки (Tregs) подавляют другие иммунные клетки и являются критическими медиаторами периферической толерантности, предотвращая аутоиммунные и чрезмерное воспаление 1. Важность Tregs можно проиллюстрировать на примере человеческой болезни immunodysregulation polyendocrinopathy энтеропатия Х-хромосомой синдромом (IPEX), в котором потеря Tregs из-за мутаций в `master' Treg фактора транскрипции Forkhead коробки P3 (FOXP3) приводит к тяжелым системным аутоиммунным заболеванием, летальной в раннем возрасте. Тем не менее, Tregs действовать как обоюдоострый меч в иммунной системе , поскольку они также могут препятствовать противоопухолевый иммунитет в определенных условиях 2. Терапевтическая манипуляция числа Treg и функции, поэтому предметом многочисленных клинических исследований. При раке, истощение Tregs может быть желательным и некоторый успех клинических подходов стимулирует дальнейшие исследования 3. При аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в дополнение к терапевтическим эффектам Tregs в Seveмодели заболевания RAL мыши, недавние первые испытания в-человека усыновителей передачи Treg для предотвращения трансплантат против -host (РТПХ) 4 - 7 и для оценки безопасности при лечении диабета типа 1 8 показали весьма обнадеживающие результаты.

Встречающиеся в природе Tregs (nTregs) содержат тимуса производные tTregs и периферического индуцированные pTregs, с нерезервированных важных функций в поддержании здоровья 9 - 11. Тем не менее, цифры nTreg ограничены, поощряя дополнительный подход индукции Tregs (iTregs) в пробирке из наивных предшественников Т - клеток 12. Тем не менее устойчивость iTregs, предположительно , из - за отсутствия деметилирования в так называемой Трег-специфической деметилируется области (TSDR) в гене FOXP3 локуса 13, остается проблемой , и некоторые исследования указывают на то, что в естественных условиях индуцированной Tregs более стабильны 14.

На сегодняшний день FOXP3 остается лучшим белком мarker для Tregs , но это не совсем специфический , потому что человеческие обычные CD4 + CD25- Т - клетки скоротечно выражают промежуточные уровни FOXP3 при активации 15,16. Несмотря на значительный прогресс был достигнут в выяснении регуляции экспрессии FOXP3, многое еще предстоит открыть в отношении индукции, стабильности и функции FOXP3 особенно в клетках человека. Несмотря на различия в nTregs, в пробирке индуцированной FOXP3 + CD4 + Т - клетки могут быть использованы в качестве модельной системы для изучения молекулярных механизмов индукции FOXP3 и в качестве отправной точки для разработки протоколов в будущем , которые позволяют поколения iTregs, которые более похожи на в Vivo сгенерированный Tregs, который может быть применим для усыновителей стратегий передачи в будущем.

Там нет `золотой standard' протокол , чтобы побудить человека iTregs, и в настоящее время протоколы были разработаны на основе имитируя Treg-индуцирующие условия в естественных условиях: интерлейкин - 2 (IL-2) И трансформирующий фактор роста β (TGF-β) сигнализации имеют решающее значение для FOXP3 индукции в естественных условиях 17, и все-транс - ретиноевой кислоты (ATRA) - который производится в естественных условиях с помощью связанной с кишечником дендритных клеток - часто используется для повышения индукции FOXP3 в пробирке 18 - 21. Мы разработали дополнительные человеческие Трег индуцирующего протоколы с использованием бутират 22, кишечную флору, происходящей с короткой цепью жирной кислоты , что недавно было показано , чтобы увеличить мышиный Treg индукции 23,24. Мы также недавно установили новый протокол для генерации iTregs с превосходной функцией подавляющих в пробирке, используя комбинацию TGF-бета, ATRA и рапамицина 22, причем последний клинически одобрен целевой рапамицина у млекопитающих (МРМ) ингибитор , который , как известно, содействовать техническое обслуживание FOXP3 в процессе расширения Treg человека 25,26.

Этот метод описывает воспроизводимавитро поколение человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs с использованием набора различных условий, и их последующего фенотипирования с помощью проточной цитометрии и количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) , чтобы выявить закономерности , специфичные для протокола экспрессии FOXP3 и других Treg молекул подписи таких , как CD25, CTLA-4, EOS, а также репрессии IFN-gamma и экспрессии SATB1 22. Сформированные клеточные популяции могут быть использованы для функциональных анализов в отношении супрессивной активности или для молекулярных исследований, либо в отношении общих регуляторов FOXP3 или для изучения эффектов, характерных для определенных соединений, таких как бутират или рапамицином. Дальнейшее понимание молекулярных механизмов вождения Treg дифференциации является весьма актуальным для будущих терапевтических подходов в аутоиммунитета или рака специфически молекул-мишеней, участвующих в генерации и функции Treg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были выделены из свеже анонимными здорового донора лейкоцитарных пленок, приобретенные в университетской больнице Karolinska, Швеция. Этическое разрешение для проведения экспериментов была получена из регионального совета этической экспертизы в Стокгольме (Regionala etikprövningsnämnden я Стокгольм), Швеция (номер официального утверждения: 2013 / 1458-31 / 1).

1. T Выделение клеток из периферической крови

  1. РВМС Изоляция
    1. Предварительно проложите 15 мл плотность центрифугирование среды (например, Ficoll) раствор в 50 мл пробирки (5 труб в лейкоцитарной пленки). Предварительно нагреться до комнатной температуры.
    2. Заполните поглощающее покрытие с фосфатным буферным раствором (PBS) (при комнатной температуре) до 180 мл. Если свежую кровь используется, разбавить кровь с равным объемом PBS.
    3. Наклон трубки в сторону и медленно наложения плотности центрифугирования среды с ~ 35 мл разведенной крови в пробирку. Добавьте кровь очень осторожно, без какого-либо смешивания центрифугирование в градиенте плотности медианыНМУ фазы и слоя крови.
    4. Центрифуга 20 мин при 1150 х г при комнатной температуре без тормоза. Используйте центрифугу без тормоза и, если это возможно с низкого до среднего ускорения для предотвращения смешивания слоев.
    5. Выньте белое кольцо, содержащее МНПК между плотностью центрифугирование среды и плазменной фазы. Переезд в новый 50 мл пробирку (1 раз с 5 мл пипетки и 2 раза с 2 мл пластиковой пипетки Пастера). Возьмите как можно меньше и плотность плазмы центрифугирование среды. Не прикасайтесь к красной эритроцита осадок.
    6. Вымойте МНПК. Разделить МНПК в 50 мл пробирки (4 пробирки в лейкоцитарной пленки). Заполните каждый до 50 мл PBS.
    7. Центрифуга 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Снимите и выбросьте супернатант, пул клеток в 1 пробирку с 10 мл RPMI / 10% сыворотки плода коровы (FCS) среды и ресуспендируют хорошо. Если скопления клеток присутствуют, штамм клетки через клеточный фильтр 40 мкм.
    9. Передача клеток в Т175 колбу для культивирования клеток для объявлениякогерентные клетки. Промыть пробирки с 40 мл среды, и в сочетании с клетками (всего 50 мл). При необходимости, удалить аликвоту для анализа потока цитометрии (см шаг 1.4). Как правило, CD4 + Т - клетки содержат около 30-40% клеток в лимфоцита ворот, и наивные Т - клетки содержат приблизительно от 30 до 60% CD4 + Т - клеток в зависимости от донора.
    10. Инкубируйте клетки в прокладке флаконах в течение 45 до 90 мин при 37 ° C / 5% CO 2. Этот шаг будет истощать моноциты пластическим приверженностью. Это не является обязательным, но будет увеличить процент T выхода клеток в расчете на количество МНПК в следующих шагах.
    11. Ресуспендируют клетки (в 50-мл среды, содержащийся в колбе) и полоскание клеточный слой на дне колбы хорошо. Распределить клетки на две равные части по 50 мл пробирки (предыдущие трубки могут быть повторно использованы для того же донора). Промыть колбу с 50 мл свежей RPMI 10% среды / FCS, а также передавать в равной мере в те же 2 трубок.
      Примечание: МНПК могут храниться в течение ночи при 4 ° С с трубки возложениесторона, или, в идеале, непосредственно использовали для выделения Т-клеток.
  2. nTreg Выделение с помощью магнитно-активированная сортировка клеток
    1. Готовят буфер изоляции: 0,5% (вес / объем) человеческого сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА в PBS. Всегда держите буфера при 4 ° С. В качестве альтернативы человеческого альбумина, используют бычий альбумин.
    2. Ресуспендируют и считать МНПК с автоматическим или ручным счетчиком клеток в присутствии трипанового синего (не считать небольших тромбоциты). Если наблюдаются скопления клеток, штамм клетки через клеточный фильтр 40 мкм.
    3. Центрифуга МНПК при 450 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Ресуспендируют клеток (1 мл пипетки) в 90 мкл буфера для изоляции на 10 7 МНПК для получения суспензии отдельных клеток. Держите клетки в исходных 50 мл пробирки (2 пробирки в лейкоцитарной пленки).
    5. Добавляют 2 мкл CD25 шариков на 10 7 клеток, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
    6. Заполните PBS до 30 мл. Центрифуга при 450 х г в течение 10 мин при 46; С.
    7. Подготовка LS колонны (2 на лейкоцитарной пальто): уравновешиваться с 3 мл буфера изоляции, и отбросить поток через. Трубы могут быть повторно использованы для полосканий дополнительных столбцов.
    8. Ресуспендируют клеток в 3 мл буфера для изоляции на пробирку (1 мл пипеткой). Передача клетки LS колонки, а также собирать поток через в свежих 15 мл пробирки.
    9. Промыть 50 мл пробирки с 2 мл буфера изоляции каждого из них. Передача ополаскивания буфер столбцов.
    10. Промыть колонки 2x с 3 мл Isolation буфер каждый. Всегда ждать, пока колонна не будет остановлено капает, перед добавлением новой жидкости. Хранить поток через при температуре 4 ° С в течение последующих шагов.
    11. Удалить столбец из магнита. Элюировать 2x с 3 мл буфера изоляции на колонку в 15 мл пробирку.
      Примечание: Элюат из 2-х колонок на донора могут быть объединены. Не опускайте колонку в жидкость.
    12. Подготовьте и уравновешивают новые столбцы LS (1 столбец на лейкоцитарной пленки). Передача элюата из 1.2.11 в колонну. Проточные может быть отброшен. После того, как элюат имеет раззёd через колонку, прополоскать трубку и мыть колонки 3 раза с 3 мл буфера для изоляции.
      Примечание: Второй столбец жизненно необходимы для повышения чистоты.
    13. Удалить столбец из магнита. Элюции CD25 ++ "nTregs" 2x с 3 мл буфера изоляции.
    14. Центрифуга при 450 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант полностью.
    15. Промыть клетки с 15 мл Т-клеточной культуральной среды, центрифуге при 450 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант полностью.
    16. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл Т-клеточной культуральной среды, дополненной 100 МЕ / мл IL-2, каждая. Передача клетки на 24-луночный планшет. Полоскание трубка с 0,5 мл среды (+ 100 МЕ / мл ИЛ-2) и объединить в 24-луночный планшет.
    17. Граф nTregs (как в шаге 1.2.2). Выход обычно составляет около 1-4 х 10 6 Tregs в лейкоцитарной пальто. Регулировка плотности Tregs до 1-2 х 10 6 клеток / мл с помощью Т - клеточной культуральной среды + 100 МЕ / мл IL-2.
    18. Выдержите Tregs при 37 ° C / 5% CO 2 до использования.
    Наивные CD4 + T Выделение клеток с помощью магнитно-активированная сортировка клеток
    Примечание: Возьмите поток через со стадии 1.2.8-1.2.10 продолжить выделения клеток. В качестве альтернативы, если не было выделено ни одного nTregs, переходите непосредственно из МНПК.
    1. Объединить 2 труб в донора Treg-истощенных МНПК в 50 мл трубки. Залить PBS до 50 мл при комнатной температуре.
    2. Центрифуга МНПК при 200g в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Снимите и выбросьте супернатант. Ресуспендируют клеток в 50 мл PBS.
    3. Повторите шаг 1.3.2 дважды.
      Примечание: Промывки PBS имеют решающее значение для удаления тромбоцитов, которые не будут удалены со следующим комплектом отрицательной изоляции. Тромбоциты остаются в надосадочной жидкости при этом низкоскоростным центрифугированием. истощение тромбоцитов можно контролировать в отдельных шагов на предметное стекло. Эти шаги должны быть выполнены с PBS и центрифугированием при комнатной температуре.
    4. Ресуспендируют МНПК в 50 мл PBS. Граф клеток, как в шаге 1.2.2.
    5. Центрифуга МНПК при 450 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 40 мкл буфера для изоляции (4 ° С) на 10 7 клеток.
    6. Добавляют 10 мкл наивных CD4 + Т - клеток биотин-антитело Коктейль II на 10 7 клеток.
    7. Смешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С.
    8. Промыть клеток путем добавления 40 мл PBS (4 ° С), и центрифуге при 450 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 80 мкл буфера для изоляции на 10 7 клеток.
    9. Добавьте 20 мкл анти-биотин микрошариков на 10 7 клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° C.
    10. Наполните до 50 мл холодного PBS, и центрифуга 450 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
    11. Подготовка LS колонны (уравновешиваться с 3 мл буферного раствора изоляции). Для того, чтобы избежать перегрузки колонки, используйте один столбец для максимально 250 х 10 6 МНПК, или меньше , если МНПК содержат много красных кровяных телец.
    12. Удалить супернатант и ресуспендируют гргезов в буфере 3 мл изоляции. Передача клетки в колонку LS. Собирают поток через, который содержит наивных CD4 + Т - клеток, в 15 мл пробирки.
    13. Промыть пробирку с буфером изоляции 2 мл. Передача в колонну.
    14. Мытье колонки 3x с 3 мл буфера для изоляции. Всегда ждать, пока колонна не остановится капает, перед добавлением новой жидкости.
    15. Возьмем поток через (наивных CD4 + Т - клеток) и центрифугу 450 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Колонки могут быть отброшены.
    16. Удалить супернатант полностью. Вымойте клеток с 15 мл среды, центрифуги 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и полностью удалить надосадочную жидкость.
      Примечание: Выделение буфер содержит ЭДТА, который способствует образованию хелатных комплексов ионов кальция и, таким образом, снижает активацию Т-клеток. Перед любыми стимуляции анализов, удалить буфер изоляции полностью и промыть клетки дважды с 15 мл среды.
    17. Ресуспендируют клеток в Т - клеточной культуральной среде до 2-3 х 10 6 клеток на мл. Rest клетки в соответствующей колбе Oг и в течение ночи в инкубаторе. Если клетки используются непосредственно для стимуляции анализов, мыть их еще один раз со средой.
  3. Чистота управления Окрашивание
    1. Возьмите ~ 50000 клеток (Tnaïve; nTreg; МНПК) каждый, в 20 мкл.
      Примечание: Если оба Tnaïve и nTreg панели должны быть окрашены, возьмите 2 образцов каждый.
    2. Приготовьте 2x концентрированного премикса антитела (в PBS) в случае необходимости для инструмента, например: Tnaïve панель: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Для Treg панели, заменить CD45RO-PE с CD25-PE, 1:10.
      Примечание: Только определенные CD25 антитела, которые распознают различные эпитопы, чем CD25-микрогранул, могут быть использованы для окрашивания nTregs изоляции с CD25 микрогранул.
    3. Добавить 20 мкл премикс антитела к 20 мкл клеток. Также готовят одиночные окрашивании для каждого флуорохромом (используя образец , содержащий положительные клетки, например, МНПК) и неокрашенной образца для проточной цитометрии НастройGS и компенсации.
    4. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    5. Заполните каждую пробу 200 мкл PBS, и центрифуга 450 мкг в течение 5-10 мин.
    6. Поднимают клетки в флюоресценции активированной сортировки клеток (FACS) буфер (= изоляция буфера без ЭДТА) и анализируют с помощью проточной цитометрии. Чистота наивных CD4 + Т - клеток, как правило , > 95% (рисунок 2).

2. Трег Индукционная Культура

  1. Получение стимуляции медиа и планшеты
    1. Подготовка и предварительно теплой Т-клеточной культуральной среды: бессывороточной гемопоэтические среде с добавлением 2 мМ L-аланил-L-глутамина.
    2. Подготовить цитокин, антитела стимуляции и соединение концентрации запасов.
      1. Приготовьте IL-2 маточного раствора: 400000 МЕ / мл в стерильно отфильтрованного (с кислотостойкой фильтром) 100 мМ уксусной кислоты (167 мкг / мл, если активность использованного лота составляет 2 400 МЕ на 1 мкг; подтвердить с поставщиком). Алиготе в стерилизованной с низким содержанием белка связывания 0,5 мл пробирки, печать с Parafilm, заморозить на сухом льду и хранят при температуре -80 ° С в течение длительного хранения или при -20 ° С в течение до 3-х месяцев.
      2. Приготовьте TGF- 1 маточного раствора (10 мкг флакон, без носителя): Центрифуга TGF-β1 порошок (1000 XG 3 мин), добавляют 100 мкл 4 мМ HCl (стерильно фильтруют с кислотостойкой фильтром) для подготовки исходного раствора с 100 мкг / мл, позволяют полностью раствориться; вихря. Алиготе 5 мкл каждого к стерилизованной низкого связывания с белками 0,5 мл пробирки, печать с Parafilm, заморозить на сухом льду и хранят при температуре -80 ° С в течение до 6 месяцев.
      3. Подготовка ATRA маточного раствора: Растворите порошок при концентрации 20 мг / мл (66,6 ммоль) в ДМСО. Подготовка исходного раствора 10 мМ последующим разбавлением в ДМСО и хранить аликвоты, защищенном от света месте, при температуре -80 ° С в течение до 1 года. ATRA чувствителен к свету, теплу и воздуха.
      4. Готовят рапамицин маточного раствора: 1 мг / мл (1,11 мМ) в ДМСО, хранить в виде аликвот при -80 ° С в течениедо 1 года.
      5. Подготовка бутират натрия маточный раствор: 0,908 М (0,1 мл / мг) запас в стерильной сверхчистой H 2 O и стерильный фильтр. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
    3. Готовят 4x концентрированные премиксы (50 мкл на лунку) в Т - клеточной культуральной среды, описанной в таблице 1.
    4. В предыдущий день, пальто пластины с анти-CD3 антителом. Шерсть нужное количество лунок с 96 U-луночный планшет с 5 мкг / мл анти-СD3-антителом в PBS, 65 мкл / лунку. Заверните пластинку с фольгой и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте маржинальные лунки 96-луночных планшетов. Более крупные скважины могут быть использованы, но U-образных скважин облегчают использование одних и тех же количества клеток на единицу площади через экспериментов. Если требуется большее количество ячеек, объединять необходимое количество скважин после культивирования. Как правило, через 4-6 дней расширения, 2 скважины каждого образца достаточным для проведения анализа проточной цитометрии и анализа РНК.
      1. В день посева, незадолго до посева, удалить анти-CD3 Раствор из скважин. Заполните лунки с 200 мкл / лунку PBS. Удалить PBS. Повторите промывание с 200 мкл / лунку PBS. Удалить PBS полностью и немедленно использовать пластины.
    5. Подготовьте пластины (не используйте маржинальные скважин):
      1. Для каждой лунки добавляют по 50 мкл 4x анти-CD28 / IL-2 премикса (за "нестимулированных" клетках, за исключением, добавьте T среда для культивирования клеток), 50 мкл 4x TGF- 1 премикса (для всех iTregs) или 50 мкл культуры Т-клеток среда для "только стимуляции" притворной контроля, 50 мкл 4x ATRA, ATRA / рапамицина или бутират премикса (где это применимо) или средней
      2. Заполните все пустые скважины, в том числе маржинальных скважин, с 200 мкл PBS. Предварительно теплые пластины при температуре 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Приготовьте Наивные Т - клетки для гальванических
    1. После того, как покоящиеся клетки, передать в 15 мл пробирку, прополощите колбу / колодцы с подогретым Т клеточной культуральной среды и бассейна к трубе. Загрузочная трубка 15 мл с помощью Т-клеточной культуральной среды. </ Li>
    2. Центрифуга клетки при 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    3. Удалите среду и занимают клетки в свежей, подогретого Т - клеточной культуральной среде до плотности 2,2-2,6 × 10 6 / мл. Граф клеток, как в шаге 1.2.2 и регулировать плотность при необходимости.
    4. Добавить клетки подготовленных стимуляции пластин (см 2.1), 50 мкл клеток / лунку (110,000-130,000 клеток / лунку). Каждая скважина должна теперь содержать общий объем 200 мкл.
    5. Оберните пластин в алюминиевой фольгой для защиты от света ATRA; инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение желаемого периода времени.
  3. Монитор Treg Induction Культура
    1. Монитор Treg культур с помощью световой микроскопии (40х увеличение). Примерно день от 2 до 3, небольшие кластеры пролиферирующих клеток должны стать видимым, которые сливаются в более крупные кластеры в более поздние моменты времени. Культуры, выращенные с рапамицина в целом растут меньше. Смотрите также Рисунок 3.
    2. В желаемые моменты времени, берут пробы для РНК еxtraction или проточной цитометрии фенотипирования (смотри ниже). Для более поздних временных точках с клеточной пролиферации, 1 а каждый достаточно, в противном случае принять 1 х 10 5 -1 × 10 6 ячеек , каждая из РНК и 3 × 10 5 -1 × 10 6 клеток для проточной цитометрии.
  4. Оценка стабильности FOXP3
    1. Для оценки стабильности фенотипа iTreg , как описано выше 22,27, моют iTregs дважды с Т - клеточной культуральной среды, и культуры iTregs далее в Т - клеточной культуральной среде , либо без или с анти-CD3 и анти-CD28 рестимуляции , как описано в разделе 2.1 и 2.2 , Добавить цитокины, такие как 50 МЕ / мл IL-2, чтобы изучить их влияние на стабильность FOXP3.
    2. В желаемые моменты времени, берут пробы для экстракции РНК, проточной цитометрии фенотипирования (смотри ниже), а также анализ TSDR метилирования , как описано 22,28.

3. Фенотипическая Анализ iTregs по QRT-PCR

  1. Подготовкаобразцы
    1. В желаемые моменты времени, возьмите 1 х 10 5 до 1 × 10 6 клеток на образец для экстракции РНК. Передача клетки к РНКазы 1,5 мл трубки и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин.
    2. При необходимости удалить часть надосадочной жидкости и замораживать для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или аналогичного анализа. Полностью удалить оставшиеся супернатант из клеток. Перейдем непосредственно к экстракции РНК или замораживать осадок клеток на сухом льду и хранят при -20 ° C до -80 ° C в течение до 2-х недель.
    3. Извлечение РНК и выполнять QRT-PCR для FOXP3 и гена домашнего хозяйства (например, RPL13A) в соответствии со стандартными протоколами. Кроме того, измеряют экспрессию других генов подписи Treg (например , `Трег up' гены IL2RA, CTLA4, IKZF4 и` Treg down' генов IFNG, SATB1).

4. Анализ фенотипа с помощью проточной цитометрии

Примечание: Этот протокол оптимизирован для окрашиванияING в формате плашки 96U с 3 х 10 5 -1 × 10 6 клеток. Если есть меньше клеток на лунку, начинают с нескольких скважин и бассейна, как описано ниже.

  1. Cell рестимуляции (Необязательно)
    1. Если окрашивание на внутриклеточные цитокины желательно, импульсные клетки ПМЯЛ 12-миристат-13-ацетата (РМА) / Ionomycin в присутствии ингибитора белка переноса.
      Примечание: Эта процедура не влияет на экспрессию FOXP3 в вышеописанных культурах iTreg, но и другие маркеры могут измениться - например, CD4 подавляется.
    2. Подготовка 10x брефелдин A / PMA / Ionomycin премикса (20 мкл на лунку) в Т-клеточной культуральной среде: брефелдин маточного раствора 1: 100, Ionomycin (запас 5 мкг / мкл) 1: 1300, ПМА (запас 12,35 мкг / мкл, предварительно -dilute 1: 1235) 1: 100 предварительно разбавлено складе.
    3. За 4 часа до окрашивания, добавьте 20 мкл брефелдин A / PMA / Ionomycin 10x смеси в каждую лунку для получения конечной концентрации 1: 1000 брефелдин А, 0,5 μМ (375 нг / мл) Ionomycin, 10 нг / мл РМА.
    4. Выдержите в течение 4 часов при температуре 37 ° C / 5% CO 2
  2. Поверхность Окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: На панели предлагается здесь предложение; другие панели могут быть использованы в зависимости от антигенов, представляющих интерес и настроек прибора.
    1. Прохладный PBS на льду. Подготовка FACS буфера (PBS с добавлением 0,5% человеческого сывороточного альбумина, HSA) и охлаждают на льду. БСА или ФБС, могут быть использованы в качестве альтернативы HSA.
    2. клетки Re-пластины Окрашивание пластины: Ресуспендируют клеток с помощью пипетки и переносят клетки в новую луночного планшета 96U, оставляя один хорошо свободный вокруг каждой скважины (для предотвращения перетекания в последующей процедуре окрашивания). Если меньше, чем необходимо, количество клеток, присутствуют в исходной скважине, удалить часть надосадочной жидкости перед тем взмучивания и пул нескольких скважин в окрашивании хорошо.
    3. Центрифуга пластина 400 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Удалить супернатант. Вылить надосадочную жидкость в коробку отходов, оставьте тарелку вверхвниз и немедленно (не оборачиваясь пластину) нажмите один раз на пластину фильтровальной бумаги. Затем сразу же повернуть пластину. Vortex пластины для ресуспендирования клеток в оставшейся жидкости.
    5. Добавить 25 мкл поверхностного окрашивания премикса (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 в буфере FACS) и ресуспендируют.
      Примечание: Кроме того, включать одиночные окрашивании для каждого из используемых люминофоры с образцами, содержащими положительные клетки для соответствующего антигена; и включают неокрашенной образец. Они будут необходимы для установки компенсации инструмента. В качестве альтернативы, использовать компенсационные шарики.
    6. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте.
    7. Добавить 200 мкл PBS, центрифуга пластины 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и удаления надосадочной жидкости, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    8. Повторите шаг 4.2.7 дважды.
  3. Жизнеспособность Окрашивание
    Примечание: Жизнеспособность окрашивание является необходимым, так как после фиксации / пермеабилизации мертвые клетки не могут быть в достаточной степени исключеныЛПС / ССК и может привести к возникновению неспецифических сигналов. Поправимо жизнеспособность краситель должен быть использован.
    1. Ресуспендируют клеток в 130 мкл жизнеспособность красителя премикса (поправимо жизнеспособность красителя eFlour780 1: 1,400 в PBS) и сразу ресуспендирования клеток с многоканальной пипеткой.
      Примечание: Кроме того, включать одну окрашивание для жизнеспособности красителя , содержащего мертвые клетки, например, нестимулированных Т - клетки культивировали в течение нескольких дней или убивают клетки путем применения тепла , как по инструкции производителя. Они будут необходимы для компенсации.
    2. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте.
    3. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант, как на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    4. Залить 200 мкл FACS буфера. Повторите шаг 4.3.3.
    5. Залить 200 мкл PBS. Повторите шаг 4.3.3.
  4. Внутриклеточные Окрашивание с FOXP3 окрашивающего буфера Set
    1. Для каждой лунки, подготовить: 150 мкл Fix / Пермь буфера (разбавленным Фикс / Пермь концentrate 1: 4 с растворителем); 850 мкл 1x пермеабилизации буфер (разбавленные 10х буфера пермеабилизирующего 1:10 сверхчистой H 2 O).
    2. После встряхивания ресуспендирования клеток в 150 мкл Fix / Пермский буфер и сразу ресуспендирования с пипеткой. Важно, чтобы сразу ресуспендирования, чтобы избежать фиксации клеточных комочков.
      Внимание: Закрепление буфер содержит параформальдегида и должны быть обработаны и отбрасывают соответствующим образом.
    3. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте.
    4. Добавьте 100 мкл холодного PBS. Центрифуга при 850 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
      Примечание: С этого шага вперед скорость центрифугирование увеличивается, чтобы избежать потери клеток. После фиксации клетки становятся невидимыми и следует соблюдать осторожность, чтобы удалить супернатанты, как описано в шаге 4.2.4 и сразу же после того, как центрифугирование закончена, чтобы минимизировать потери клеток.
    5. Удалить супернатант, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
      Примечание: Окрашивание может быть приостановлена ​​на данном этапе; вэтот случай, промыть клетки дважды 200 мкл PBS; а затем взять в 250 мкл PBS и хранить при температуре 4 ° С, в защищенном от света месте. Клетки можно хранить в течение нескольких дней, а затем продолжить пермеабилизации. Тем не менее, оптимальные результаты достигаются, когда непосредственно продолжали пермеабилизации.
    6. После встряхивания добавляют 200 мкл буфера пермеабилизирующего. Центрифуга при 850 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    7. Добавить 200 мкл буфера пермеабилизирующего для ресуспендирования.
      Примечание: В данном случае образцы можно разбить на внутриклеточного окрашивания и контрольным образцом изотипа (отнять половину каждого образца). Если количество клеток являются предельными, объединенный образец изотипа могут быть получены (забрать 10-20 мкл каждого образца и бассейна). Кроме того, образцы могут быть приняты для флуоресценция-минус один (FMO) управления.
    8. Центрифуга при 850 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    9. Ресуспендируют осадок в44 мкл буфера плюс пермеабилизирующего 1 мкл сыворотки нормальная мышь (предварительно смешан), чтобы блокировать неспецифическое связывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это применимо, если антитела, используемые на следующей стадии являются мышиного изотипа. Если другие антитела, такие как полученный из крыс, используются, включают соответствующую сыворотку для блокирования (например, крысы сыворотка).
    10. Инкубируйте при 4 ° С в течение 15 мин в темноте.
    11. Добавить антитела:
      Примечание: Запрос концентрации антител для конкретных лотов. Если это не сделано на шаге 4.2 с антителами к поверхностным антигенам (например, CD4) с соответствующими флуорохромии также включают в себя одиночные окрашивании для каждого из используемых люминофоры с образцами, содержащими положительные клетки для компенсации.
      1. Добавить 15 мкл премикса антител к образцам (за исключением отдельных окрашиванием, неокрашенных образцов, контрольных образцов изотипа и управления FMO): премикса на образце: 0,7 мкл (0,35 мкг) анти-Интерферон гамма (IFN-γ) -FITC (если применимо после рестимуляции ),2,3 мкл (0,115 мкг) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 мкл (0,05 мкг) анти-FOXP3-APC, 10 мкл PBS.
      2. Для изотипа контрольные образцы, добавляют 15 мкл премикса изотипа антитела, с использованием тех же количеств антител, как и для антител, используемых в 4.4.11.1: премикса на образце: 0,7 мкл (0,35 мкг) мышь IgG1 K контрольного изотипа FITC (если это применимо), 0,58 мкл (0,115 мкг) мышь IgG2a-BV421 изотип, 0,5 мкл (0,05 мкг) мышь IgG1 K контроль изотипа APC, 13,2 мкл PBS.
      3. Для управления FMO, добавьте антитела, как в 4.4.11.1, заменяя одно антитело каждый с PBS.
    12. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
    13. Добавить 200 мкл буфера пермеабилизирующего. Центрифуга, удалить супернатант и вихрь, как на этапе 4.4.8. Повторить один раз.
    14. Ресуспендируют клеток в холодном буфере FACS (громкость в зависимости от используемого прибора) и приобретающие, в идеале сразу, на проточном цитометре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показана схема экспериментальной установки. На рисунке 2 показана репрезентативная контроля чистоты окрашивание на магнитно - обособленных наивных CD4 + Т - клеток и nTregs.

F igure 3A показывает проточной цитометрии стратегии стробирования и фигура 3В показывает представитель FOXP3 и CD25 проточной цитометрии окрашиванием на 6 -й день культуры при указанных iTreg или контрольных условиях. При стимуляции в пробирке, большинство клеток апрегулируются CD25, который восстанавливают в присутствии рапамицина. Только при добавлении iTreg-индуцирующих факторов, четкое население FOXP3 + клеток становится очевидным, что также обогащена в пределах CD25 + клеток в условиях iTreg. Фигура 3С изображает фенотипическое появление iTreg культур в микроскоп с пролиферирующие клетки видны в виде темных скоплений. Каждый я состояние Трег показывает конкретный и воспроизводимую картину клеточной пролиферации: В этих условиях культивирования, TGF-β слегка увеличивает пролиферацию, и ATRA дополнительно увеличивает пролиферацию. В то же время, ингибирование пролиферации рапамицином очевидно в сильно уменьшенного размера кластера. Микроскопическое появление силы пролиферации также соответствует общего числа клеток (данные не включены).

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты QRT-PCR анализ FOXP3 мРНК индукции в iTreg (и контроля) культур в различные моменты времени. Что касается FOXP3 белка, экспрессия мРНК FOXP3 выше во всех iTregs по сравнению с контрольными стимулированных клеток, с рапамицином обработанных iTregs , имеющие относительно низкие уровни по сравнению с другими iTregs. FOXP3 мРНК в nTregs выше , чем в iTregs.

эс / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Схема эксперимента для индукции iTreg, nTreg изоляции, а также анализ Treg. Человека наивных CD4 + Т - клетки выделяли из лейкоцитарных пленок и стимулировали в среде без сыворотки с анти-CD3 и анти-CD28 антитела плюс 100 U мл IL-2 до 6 дней, либо в отсутствие ( `контрольных клеток / фиктивных ') или наличие различных Treg-индуцирующих факторов ( `iTreg'), как указано. nTregs изолированы и анализируют параллельно. Фенотипические анализ может быть выполнен с помощью проточной цитометрии и QRT-PCR. Измененный Шмидт, А. и др. 2016 22. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Клеточная чистота исходного населения. Наивный человек CD 4 + Т - клетки выделяли с помощью набора Выделение клеток Наивные CD4 Т - II, человека. Верхняя панель: чистота Наивные CD4 + Т - клеток, на основе CD4, CD45RA и CD45RO, было от 94 до 98% , а степень чистоты для репрезентативного донора , более 30 показан ( `Tnaïve'). Экс естественных Tregs ( `nTreg') выделяли с использованием ограниченных количеств CD25 микрошариков и использовали в качестве положительного контроля для экспериментов iTreg. nTreg чистота репрезентативной доноров, на основе CD25 и CD4, показано. Нижняя панель: внутриклеточная FOXP3 окрашивание (выполняется как на рисунке 3 и предварительно закрытого типа на живых клеток CD4 +) показан для наивных CD4 + Т - клеток и nTregs соответственно, с использованием клеток из того же донора , как и в верхней панели. Измененный Шмидт, А. и др. 2016 22. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ntent "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> Рисунок 3
Рисунок 3: Фенотипическая появление iTregs и nTregs. Человеческие наивных CD4 + Т - клетки культивировали в среде без сыворотки в указанных условиях. Т-клетки стимулировали с помощью анти-CD3 и анти-CD28 антитела плюс 100 ед / мл IL-2 ( `Stim.'). Там, где указано, добавляют TGF-β1 ( `TGF'), рапамицин (` Rapa'), все-транс-ретиноевой кислоты ( `ATRA') или бутират. nTregs (исключая виво изолированный периферический CD25 крови ++ клетки) были оставлены нестимулируемый ( `unstim.') и использовали в качестве положительного контроля. Нестимулированные наивные Т-клетки использовали в качестве отрицательного контроля. (А) На 6 -й день культивирования клетки окрашивали поверхностными антителами , включая анти-CD25 и анти-CD4, а затем окрашивали фиксируемой жизнеспособность красителя и последующей фиксации / проницаемыми и окрашивали внутриклеточно с анти-FOXP3 и анти-CTLA-4 или изотипа продолжение РОЛ антитела. Приобретение и компенсация была выполнена на проточном цитометре Циан АДФ и данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo. Стратегия стробирования обозначена красными стрелками, а показан пример представляет собой образец iTreg индуцированной с TGF + ATRA. (В) Клетки окрашивали , как в (а), и выражение FOXP3 и CD25 , в контрольных Т - клеток и iTregs , индуцированные различными протоколами показана. На псевдоцветовую графики показывают репрезентативные FOXP3 и CD25 окрашивании для одного донора, предварительно закрытого типа на синглета, живут клеток CD4 + , как в (A). Пример изотипическим показан для iTreg (стим. + TGF + ATRA) образца. (С) Представительные микроскопии изображений (40 - кратном увеличении) отдельных 96U-лунок планшета клеток культивировали в течение 4 дней. Темные скопления клеток представляют собой пролиферирующие клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ntent "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> Рисунок 4
Рисунок 4: FOXP3 экспрессии мРНК при использовании различных протоколов для iTreg дифференциации. iTregs были получены как показано на рисунке 3 при указанных условиях, и при заданных временных точках, были взяты образцы клеток и РНК экстрагировали. Нестимулированные наивные Т - клетки и нестимулированных nTregs, отбирали в день 0. Образцы анализируют методом QRT-PCR, и экспрессия мРНК FOXP3 нормализовалось к выражению RPL13A для каждого образца. Экспрессия FOXP3 мРНК в стимулированных наивных Т - клеток было установлено на 1, и сложите изменение мРНК FOXP3 рассчитывали. Показаны средние значения и диапазон ПЦР репликации скважин для представительной донора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный протокол обеспечивает надежную индукцию человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs от человека наивных CD4 + Т - клеток. Он включает в себя новый протокол , который мы описали в последнее время , с использованием комбинации TGF-бета, ATRA и рапамицином, для индукции iTregs с превосходной в пробирке функции 22 супрессивной. По сравнению с другими опубликованными протоколами, еще одним преимуществом является индукция различных популяций iTreg параллельно с различными протоколами, что позволяет прямое сравнение эффектов некоторых iTreg-индуцирующих факторов, наряду с контрольными клетками, которые активируются в присутствии одного ИЛ-2 , Описанные протоколы позволяют воспроизводимый индукции FOXP3 с низкой вариацией донора. Наивные CD4 + Т - клеток в этом протоколе изолированы с помощью магнитного активированного сортировки клеток, но флуоресценция активированных сортировки клеток также возможно. Ожидаемый выход наивных CD4 + Т - клеток с этим протоколом обычно составляет от 5-10%, но сильно зависит от доноров (возраст) и, как представляется, также ниже, когда высокие доли эритроцитов присутствуют. Если оценка необходима, МНПК могут быть окрашены (этап 1.4), в течение стадии истощения моноцитов. Как правило, выход наивных CD4 + Т - клеток составляет около половины "Процент наивных CD4 + Т - клеток лимфоцитов ворот" в пятно РВМС. Этот протокол использует ограниченное количество CD25 шариков для получения CD25 высокой (nTreg) клеток 29. Тем не менее, это не чисто Tregs, но все это лишь обогащенную Tregs для использования в качестве положительного контроля. Если необходимы чистые Tregs, другие наборы должны быть использованы (например, в сочетании с обогащением CD4 и CD127-истощение) или в качестве альтернативы, CD25 + клеток , предварительно обогащенный 8 мкл CD25 шариков на 10 7 клеток и окрашивают и сортируют с помощью флуоресцентной-активированных клеток сортировка с жесткими CD4 + CD25 ++ стробирования. Кроме того включение других маркеров, таких как CD127 исключения, следует рассмотреть.

_content "> Важно учитывать , что FOXP3 является необходимым, но не достаточным для придания Treg идентичности 30. Хотя iTregs могут быть использованы для изучения некоторых аспектов, например, регулирование FOXP3, важно , однако, отметить , что iTregs отличаются от nTregs в нескольких аспектах. поэтому крайне важно, чтобы культура nTregs (в идеале, полученных от того же донора) параллельно с iTregs во всех анализах для сравнения. разница между nTregs и iTregs иллюстрируется лишь частичным перекрытием транскриптома nTreg и iTreg как измерено в мышиные iTregs 31. Другие гены Трег подписи в дополнение к FOXP3 следует измерять по этой причине, а также для обеспечения селективности от активации индуцированной экспрессии FOXP3 в клетках человека. Например, iTregs должен показывать более высокую экспрессию CD25, CTLA-4 и EOS по сравнению на активированных Т-клеток в то время как экспрессия IFN-gamma и SATB1 должны быть низкими в nTregs и iTregs, вызванных протоколами, описанными здесь, как и ранее опубликованных 13. Также на геном масштабе, это было описано , что эпигенетические паттерны метилирования ДНК и модификации гистонов в мышиных iTregs не отражают закономерности , найденные в nTregs 30. Мы ранее описано, что iTregs, индуцированные здесь описаны протоколы, в отличие от nTregs, не проявляли TSDR деметилирования. Соответственно, iTregs потерял FOXP3 когда рестимулирован, но поддерживается выражение FOXP3 когда дополнительно культивировали в присутствии IL-2 и без рестимуляции 22. Интересно, что iTregs индуцированные альтернативным протоколом с использованием М2 макрофаги супернатантов отображается повышенную стабильность FOXP3, несмотря на отсутствие TSDR деметилирования и TGF-бета будучи причинных для индукции FOXP3 27.

Модификация iTreg-inducing протоколы добавлением соединений (таких как витамин С или сероводород), влияющих на десять-одиннадцать транслокации (TET) метилцитозин диоксигеназой ферменты, как описано совсем недавно 32 - 34, может добавить в стабилизации FOXP3, влияя на метилирование ДНК. Кроме того , сила стимуляции и времени оказывает влияние на экспрессию и стабильность 35 FOXP3. Вдоль этих линий, использование бусинок в сочетании CD3 / CD28 - антителами вместо антител пластинчатых Связанную показано увеличение мышиный iTreg в естественных условиях супрессивной функции и стабильности хотя и не зависит от TSDR деметилирования 36. Другим фактором, который необходимо рассматривать как потенциальный источник изменений является использование сыворотки, которая содержит неопределенные факторы, включая TGF-бета, который даже из бычьего источника составляет 100% перекрестной реактивностью с человеческими клетками. Кроме того, источник и активность IL-2 может существенно повлиять на результаты индукции FOXP3.

Важным еeature из Tregs является их подавляющих способность, которая должна быть проверена впоследствии с iTregs, генерируемых в этом протоколе. Следует отметить, что подавление пробы с iTregs не являются тривиальными и литература о подавляющих способностях iTregs является спорным. Существует несколько методов и протоколов для оценки подавляющий функции человеческого Tregs были опубликованы в другом месте 22,37 - 41, с в пробирке анализов пролиферации на основе проточной цитометрии считываниями , таких как разбавление карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) причем наиболее часто используемых. Важно, чтобы вымыть и отдохнуть iTregs перед использованием в анализах подавления, и это необходимо учитывать, что iTregs, в отличие от nTregs, может не быть анергических но пролиферируют себя во время подавления анализов. Мы считаем крайне важным, чтобы использовать `mock' стимулируется Т-клеток в качестве контроля супрессорных клеток, чтобы определить степень неспецифического подавления (например, через CTLA-4 экспрессии, IL-2 потравтомеханик и культуры разрастание активированными Т-клетками), что не имеет никакого отношения к FOXP3 + Treg-специфических эффектов, а также частое отсутствие такого контроля могут способствовать некоторые противоречия в литературе. С помощью этого элемента управления, мы определили , что только TGF-бета / ПТРК / Рапа-индуцированные iTregs подавляющий активность отображается в пробирке 22. Таким образом, мы приходим к выводу, что в отношении подавляющий активность (хотя и не самой высокой доли FOXP3 + клеток), TGF-β / ПТРК / Рапа наилучшее сочетание факторов описанных протоколов к индуцируют iTregs. Тем не менее, подавляющих активность в пробирке не обязательно отражает подавляющую активность в естественных условиях, и на самом деле мы определили , что человеческие iTregs порожденные этими протоколами не подавляло в ксеногенного трансплантат против -host модели заболевания по крайней мере в условиях испытания 22. Это может быть связано с нестабильным выражением FOXP3 , которое было потеряно в iTregs при рестимуляции, в соответствии с отсутствием TSDR деметилирования 22

В зависимости от того, какой аспект особенностей iTreg (высокая доля FOXP3 + клеток, превосходят подавляющих активность, стабильность FOXP3) является наиболее важным для конкретного вопроса исследования, различные протоколы могут быть наиболее подходящими для изучения этих вопросов, что делает его трудно определить в целом "лучший 'протокол для Treg индукции. Кроме того, некоторые тонкие экспериментальные различия Вышеописанные могут влиять на результаты и может способствовать спорами по фенотипу и супрессивной функции TGF-бета-индуцированной iTregs , которые появляются между сообщениями даже с по- видимому , аналогичными протоколам для генерации iTreg 42. Например, даже в пределах одной лаборатории, мы наблюдали , что iTregs индуцированные с TGF-бета и IL-2 в содержащей сыворотку среде RPMI среде отображаются некоторые подавляющие активность по сравнению с контрольными клетками , 27, в то время как TGF-β / IL-2-индуцированные iTregs генерируется в определяется, свободной от сыворотки культуральной среды Т - клеток не 22, dесмотря аналогичные уровни FOXP3.

Будущие приложения, основанные на этих протоколах должны стремиться к дальнейшей оптимизации Treg индукции условий для достижения фенотип с стабильной экспрессии FOXP3, TSDR деметилирования, стабильный фенотип без преобразования в цитокин-продуцирующих эффекторных Т-клеток и оптимальной подавляющей активности. Дальнейшее развитие асинхронных протоколов iTreg могут быть полезны для усыновителей передачи подходов в будущем, в котором терапия передачи Treg является весьма перспективным для потенциального лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

Immunology выпуск 118 регуляторные Т-клетки Treg CD4 + Т-клетки изоляция магнитная ячейка, цитокины FOXP3 TGF-β IL-2 внутриклеточный проточной цитометрии QRT-PCR
<em>In Vitro</em> Дифференциация человеческого CD4 <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup> Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 <sup>+</sup> Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter