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Immunology and Infection

भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं से मानव सीडी 4 + Foxp3 + प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं (iTregs) एक TGF-β युक्त प्रोटोकॉल का उपयोग की इन विट्रो भेदभाव में

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी और मानव प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं (iTregs) की phenotyping वर्णन करता है। Foxp3 शामिल करने के लिए अलग अलग प्रोटोकॉल संबंधित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त विशिष्ट iTreg phenotypes के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।

Introduction

सीडी 4 + CD25 + Foxp3 + विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दबाने और परिधीय सहिष्णुता की आलोचना मध्यस्थों, रोकने औतोइम्मुिनित अत्यधिक सूजन 1 रहे हैं। Tregs के महत्व को मानव रोग immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy एक्स से जुड़े सिंड्रोम (IPEX), जो Tregs के नुकसान में `master' Treg प्रतिलेखन कारक forkhead बॉक्स पी 3 में म्यूटेशन के कारण (Foxp3) द्वारा उदाहरण गंभीर प्रणालीगत ऑटोइम्यून रोग होता है, एक कम उम्र में घातक। हालांकि, Tregs प्रतिरक्षा प्रणाली को वे भी कुछ सेटिंग 2 में विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में एक दोधारी तलवार के रूप में काम करते हैं। Treg संख्या और समारोह की चिकित्सीय हेरफेर इसलिए कई चिकित्सीय जांच के अधीन है। कैंसर में, Tregs की कमी वांछनीय हो सकता है और नैदानिक दृष्टिकोण के कुछ सफलता आगे अनुसंधान 3 प्रोत्साहित करती है। स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों, seve में Tregs के उपचारात्मक प्रभाव के अलावा मेंRAL माउस रोग मॉडल, हाल ही में पहली बार मैन दत्तक Treg हस्तांतरण के परीक्षण graft- बनाम मेजबान रोग (GVHD) 4 को रोकने के लिए - 7 और इलाज टाइप 1 मधुमेह 8 में सुरक्षा का आकलन करने के लिए बहुत ही होनहार परिणामों से पता चला है।

स्वाभाविक रूप से होने वाली Tregs (nTregs) स्वास्थ्य को बनाए रखने में 9 थाइमिक व्युत्पन्न tTregs और सतही तौर पर प्रेरित pTregs, गैर बेमानी आवश्यक कार्यों के साथ शामिल - 11। हालांकि, nTreg संख्या पूरक भोले टी सेल व्यापारियों 12 से इन विट्रो में उत्प्रेरण Tregs (iTregs) के दृष्टिकोण को प्रोत्साहित करने, सीमित हैं। ITregs की फिर भी स्थिरता, शायद Foxp3 जीन ठिकाना 13 में तथाकथित Treg विशेष demethylated क्षेत्र (TSDR) में demethylation की कमी के कारण, एक चिंता का विषय बनी हुई है और कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि प्रेरित Tregs विवो में और अधिक स्थिर 14 हैं।

तिथि करने के लिए, सबसे अच्छा Foxp3 प्रोटीन मीटर रहता हैTregs के लिए arker लेकिन यह क्योंकि मानव पारंपरिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं CD25- क्षणिक सक्रियण 15,16 पर Foxp3 के मध्यवर्ती स्तर व्यक्त बिल्कुल विशिष्ट नहीं है। हालांकि महत्वपूर्ण प्रगति Foxp3 अभिव्यक्ति के नियमन elucidating में किया गया है, बहुत विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में प्रेरण, स्थिरता और Foxp3 के समारोह के बारे में पता चला जाना बना रहता है। NTregs करने के लिए मतभेदों के बावजूद, इन विट्रो में प्रेरित Foxp3 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं Foxp3 प्रेरण के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और भविष्य में प्रोटोकॉल है कि iTregs की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं कि अधिक में करने के लिए इसी तरह की हैं विकसित करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उत्पन्न Tregs, जो भविष्य में दत्तक हस्तांतरण रणनीतियों के लिए लागू किया जा सकता है विवो।

इसमें कोई `सोने standard' मानव iTregs प्रेरित करने के लिए प्रोटोकॉल है, और मौजूदा प्रोटोकॉल विवो में Treg उत्प्रेरण की स्थिति नकल उतार के आधार पर विकसित किया गया है: 2 (आईएल -2 इंटरल्यूकिन) और बदलने वृद्धि कारक β (TGF-β) संकेतन विवो 17 में Foxp3 शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, और सब पार retinoic एसिड (ATRA) - जो विवो में पेट से जुड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा निर्मित है - बार-बार Foxp3 प्रेरण को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है 21 - 18 विट्रो में। हम अतिरिक्त मानव Treg उत्प्रेरण butyrate 22, एक पेट microbiota व्युत्पन्न लघु श्रृंखला फैटी एसिड है कि हाल ही में murine Treg प्रेरण 23,24 बढ़ाने के लिए दिखाया गया था का उपयोग कर प्रोटोकॉल विकसित किया है। हम यह भी हाल ही में TGF-β, ATRA के संयोजन का उपयोग और 22 rapamycin, बाद rapamycin (mTOR) के एक चिकित्सकीय अनुमोदित स्तनधारी लक्ष्य जा रहा है कि अवरोध को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है के द्वारा इन विट्रो में बेहतर दमनकारी समारोह के साथ iTregs की पीढ़ी के लिए एक नए प्रोटोकॉल स्थापित मानव Treg विस्तार 25,26 दौरान Foxp3 रखरखाव।

इस विधि में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने का वर्णनमानव सीडी 4 + Foxp3 + विभिन्न शर्तों का एक सेट का उपयोग कर iTregs, और फ्लो और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा उनके बाद phenotyping के इन विट्रो पीढ़ी (QRT- पीसीआर) Foxp3 की अभिव्यक्ति और अन्य Treg हस्ताक्षर अणुओं इस तरह के प्रोटोकॉल-विशिष्ट पैटर्न प्रकट करने के लिए CD25, CTLA -4, EOS, साथ ही IFN-γ और SATB1 अभिव्यक्ति 22 के दमन के रूप में। उत्पन्न सेल आबादी दमनकारी गतिविधि के बारे में कार्यात्मक assays के लिए या आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो सामान्य Foxp3 नियामकों के विषय में या इस तरह के butyrate या rapamycin के रूप में कुछ यौगिकों के लिए विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। Treg भेदभाव ड्राइविंग आणविक तंत्र के आगे समझने औतोइम्मुिनित या कैंसर में भविष्य चिकित्सकीय दृष्टिकोण विशेष Treg पीढ़ी और समारोह में शामिल अणुओं को लक्षित करने के लिए प्रासंगिक है।

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Protocol

मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) हौसले अनामीकृत स्वस्थ दाता बफी कारोलिंस्का विश्वविद्यालय अस्पताल, स्वीडन से खरीदी कोट से अलग थे। प्रयोगों के लिए एथिकल परमिट स्टॉकहोम में क्षेत्रीय नैतिक समीक्षा बोर्ड (Regionala etikprövningsnämnden मैं स्टॉकहोम) से प्राप्त हुई थी, स्वीडन (अनुमोदन संख्या: 2013 / 1458-31 / 1)।

परिधीय रक्त से 1. टी सेल अलगाव

  1. PBMC अलगाव
    1. पूर्व रखना 15 मिलीलीटर घनत्व centrifugation मध्यम 50 मिलीलीटर ट्यूब (बफी कोट प्रति 5 ट्यूब) में (जैसे Ficoll के रूप में) समाधान। कमरे के तापमान को पूर्व गर्म।
    2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (कमरे के तापमान) 180 मिलीलीटर के साथ बफी कोट भरें। ताजा खून का इस्तेमाल किया जाता है, पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ खून पतला।
    3. पक्ष और धीरे-धीरे ओवरले घनत्व centrifugation माध्यम के साथ ~ 35 मिलीलीटर ट्यूब प्रति खून पतला करने के लिए झुकाव ट्यूब। मेड घनत्व centrifugation के किसी भी मिश्रण के बिना, बहुत सावधानी से खून जोड़ेIUM चरण और रक्त परत।
    4. ब्रेक के बिना कमरे के तापमान पर 1,150 XG पर अपकेंद्रित्र 20 मिनट। ब्रेक के बिना सेंट्रीफ्यूज काम करते हैं और यदि संभव हो तो मध्यम त्वरण के लिए कम के साथ परतों के मिश्रण को रोकने के लिए।
    5. सफेद अंगूठी घनत्व centrifugation मध्यम और प्लाज्मा चरण के बीच PBMCs युक्त बाहर ले जाओ। (2 मिलीलीटर की प्लास्टिक-पाश्चर विंदुक के साथ 1 के साथ समय 5 मिलीलीटर पिपेट और 2 बार) एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण। संभव प्लाज्मा और घनत्व centrifugation माध्यम के रूप में के रूप में छोटे से ले। लाल एरिथ्रोसाइट गोली मत छुओ।
    6. धो PBMCs। 50 मिलीलीटर ट्यूब (बफी कोट प्रति 4 ट्यूब) में PBMCs विभाजित। पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर करने के लिए प्रत्येक भरें।
    7. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 450 XG।
    8. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, एमएल RPMI / 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) मध्यम 10 के साथ 1 ट्यूब में कोशिकाओं पूल और अच्छी तरह resuspend। सेल clumps मौजूद है, एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से तनाव कोशिकाओं रहे हैं।
    9. विज्ञापन के लिए T175 सेल संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं स्थानांतरणHerent कोशिकाओं। 40 मिलीलीटर मध्यम के साथ ट्यूब कुल्ला और कोशिकाओं के साथ गठबंधन (50 मिलीलीटर कुल)। यदि आवश्यक हो, प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एक विभाज्य निकालें (1.4 कदम देखें)। आमतौर पर, सीडी 4+ टी कोशिकाओं लिम्फोसाइट गेट में कोशिकाओं के बारे में 30-40% शामिल है, और भोले टी कोशिकाओं दाता के आधार पर सीडी 4+ टी कोशिकाओं की लगभग 30 से 60% शामिल है।
    10. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 45 से 90 मिनट के लिए कुप्पी बिछाने में कोशिकाओं को सेते हैं। यह कदम प्लास्टिक पालन द्वारा monocytes गिरेगा। यह अनिवार्य नहीं है, लेकिन निम्न चरणों में PBMCs की राशि प्रति प्रतिशत टी सेल उपज में वृद्धि होगी।
    11. Resuspend कोशिकाओं (50 मिलीलीटर में मध्यम फ्लास्क में निहित) और अच्छी तरह कुप्पी के तल पर सेल परत कुल्ला। (पिछले नलियों ही दाता के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है) समान रूप से दो 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं बांटो। 50 मिलीलीटर ताजा RPMI / 10% एफसीएस माध्यम के साथ फ्लास्क कुल्ला, और एक ही 2 ट्यूबों में समान रूप से हस्तांतरण।
      नोट: PBMCs ट्यूब पर बिछाने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत किया जा सकतापक्ष, या आदर्श रूप में, सीधे टी सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया।
  2. चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई द्वारा nTreg अलगाव
    1. अलगाव बफर तैयार: 0.5% (w / v) मानव सीरम albumin और पीबीएस में 2 मिमी EDTA। हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर रखने के लिए। मानव एल्बुमिन को वैकल्पिक रूप से, गोजातीय एल्बुमिन का उपयोग करें।
    2. Resuspend और trypan नीले रंग की उपस्थिति में एक स्वत: या मैनुअल सेल काउंटर के साथ PBMCs गिनती (छोटे प्लेटलेट्स गिनती नहीं है)। सेल clumps मनाया जाता है, एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से तनाव कोशिकाओं।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र PBMCs।
    4. Resuspend कोशिकाओं प्रति 10 7 PBMCs 90 μl अलगाव बफर में (1 मिलीलीटर pipet के साथ) एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए। मूल 50 मिलीलीटर ट्यूब (बफी कोट प्रति 2 ट्यूब) में कोशिकाओं रखें।
    5. 10 7 कोशिकाओं प्रति 2 μl CD25 मोती जोड़ें, मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. 30 मिलीलीटर पीबीएस के साथ भरें। 4 पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र6, सी।
    7. तैयार लोकसभा कॉलम (2 बफी कोट प्रति): 3 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ संतुलित करना, और के माध्यम से प्रवाह त्यागें। ट्यूब आगे कॉलम कुल्ला करने के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
    8. ट्यूब प्रति 3 मिलीलीटर अलगाव बफर में Resuspend कोशिकाओं (1 मिलीलीटर pipet के साथ)। कोशिकाओं स्थानांतरण स्तंभ रास, और नए सिरे से 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए।
    9. 2 मिलीलीटर अलगाव के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूबों प्रत्येक बफर कुल्ला। स्थानांतरण स्तंभों के लिए बफर rinsing।
    10. 3 मिलीलीटर अलगाव के साथ धो स्तंभ 2x प्रत्येक बफर। हमेशा रुको जब तक स्तंभ, टपकता बंद कर दिया है किसी भी नए तरल जोड़ने से पहले। स्टोर बाद के चरणों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर के माध्यम से प्रवाह।
    11. चुंबक से स्तंभ निकालें। 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्तंभ प्रति 3 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ Elute 2x।
      नोट: दाता प्रति 2 कॉलम से eluate जोड़ा जा सकता है। तरल में स्तंभ डुबकी नहीं है।
    12. तैयार है और नई लोकसभा कॉलम (बफी कोट प्रति 1 स्तंभ) संतुलित करना। स्तंभ के लिए 1.2.11 से eluate स्थानांतरण। के माध्यम से खारिज किया जा सकता प्रवाह। eluate के बाद सर्व हैस्तंभ के माध्यम से डी, ट्यूब कुल्ला और 3 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ स्तंभ 3x धो लें।
      नोट: दूसरे स्तंभ महत्वपूर्ण शुद्धता को बढ़ाने की जरूरत है।
    13. चुंबक से स्तंभ निकालें। Elute CD25 ++ "nTregs" 3 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ 2x।
    14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर 15 मिलीलीटर टी सेल संस्कृति के माध्यम से, सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें।
    16. 0.5 मिलीलीटर टी सेल संस्कृति के माध्यम में Resuspend कोशिकाओं, 100 आइयू / एमएल आईएल -2, प्रत्येक के साथ पूरक। 24 अच्छी तरह से थाली कोशिकाओं स्थानांतरण। 0.5 मिलीलीटर माध्यम के साथ कुल्ला ट्यूब (+ 100 आइयू / एमएल आईएल -2) और 24 अच्छी तरह से थाली में गठबंधन।
    17. गणना nTregs (कदम 1.2.2 के रूप में)। उपज आमतौर पर बफी कोट प्रति के बारे में 1-4 एक्स 10 6 Tregs है। टी सेल संस्कृति के माध्यम से + 100 आइयू / एमएल आईएल -2 के साथ 1-2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल Tregs के घनत्व को समायोजित करें।
    18. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 उपयोग करें जब तक Tregs सेते हैं।
    चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई द्वारा भोले सीडी 4+ टी सेल अलगाव
    नोट: कदम 1.2.8-1.2.10 से के माध्यम से प्रवाह सेल अलगाव के साथ आगे बढ़ने के लिए ले लो। वैकल्पिक रूप से, अगर कोई nTregs अलग थे, PBMCs से सीधे आगे बढ़ना।
    1. 50 मिलीलीटर ट्यूब में Treg समाप्त PBMCs के दाता प्रति 2 ट्यूबों का मिश्रण। कमरे के तापमान पर 50 मिलीलीटर पीबीएस के साथ भरें।
    2. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र PBMCs। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 50 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend।
    3. दोहराएँ कदम 1.3.2 दो बार।
      ध्यान दें: पीबीएस washes प्लेटलेट्स, जो निम्नलिखित नकारात्मक अलगाव किट के साथ नहीं हटाया जाएगा हटाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्लेटलेट्स यह कम गति centrifugation पर तैरनेवाला में रहते हैं। प्लेटलेट की कमी एक सूक्ष्म स्लाइड पर अलग-अलग चरणों में नजर रखी जा सकती है। कदम कमरे के तापमान पर पीबीएस और centrifugations के साथ प्रदर्शन किया जाना है।
    4. 50 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend PBMCs। कदम 1.2.2 के रूप में कोशिकाओं की गणना।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र PBMCs। 40 μl अलगाव बफर (4 डिग्री सेल्सियस) 10 7 कोशिकाओं प्रति में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागें।
    6. 10 7 कोशिकाओं प्रति भोले सीडी 4+ टी सेल बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल द्वितीय के 10 μl जोड़ें।
    7. मिक्स, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर 40 मिलीलीटर पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस), जोड़ने और सेंट्रीफ्यूज द्वारा कोशिकाओं को धो लें। 10 7 कोशिकाओं प्रति 80 μl अलगाव बफर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें।
    9. 10 7 कोशिकाओं प्रति विरोधी बायोटिन microbeads के 20 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    10. ठंड पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर को भरें, और सेंट्रीफ्यूज 450 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए XG।
    11. तैयार लोकसभा कॉलम (3 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ संतुलित करना)। स्तंभ अधिभार से बचने के लिए ज़्यादा से ज़्यादा 250 x 10 6 PBMCs, या कम समय के लिए एक स्तंभ का उपयोग करता है, तो PBMCs कई लाल रक्त कोशिकाओं में होते हैं।
    12. हटाये सतह पर तैरनेवाला और resuspend ग3 मिलीलीटर अलगाव बफर में एल। लोकसभा स्तंभ कोशिकाओं स्थानांतरण। 15 मिलीलीटर ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह है, जो भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं में शामिल है, ले लीजिए।
    13. 2 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ ट्यूब कुल्ला। स्तंभ के लिए स्थानांतरण।
    14. 3 मिलीलीटर अलगाव बफर के साथ स्तंभ धो 3x। हमेशा जब तक स्तंभ टपकता बंद हो जाता है, किसी भी नए तरल जोड़ने से पहले इंतजार करें।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर (भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं) के माध्यम से प्रवाह और सेंट्रीफ्यूज के लिए 450 XG 10 मिनट के लिए ले लो। कॉलम खारिज किया जा सकता है।
    16. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें। कमरे के तापमान पर 15 मिलीलीटर मध्यम, सेंट्रीफ्यूज के लिए 450 XG 10 मिनट के साथ कोशिकाओं को धो लें और पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      नोट: अलगाव बफर EDTA, जो कैल्शियम आयनों chelates होता है और इस प्रकार के टी सेल सक्रियण impairs। किसी भी उत्तेजना assays से पहले, पूरी तरह से अलगाव बफर हटाने और 15 मिलीलीटर माध्यम के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    17. मिलीलीटर प्रति 2-3 एक्स 10 6 कोशिकाओं के लिए टी सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं Resuspend। उचित कुप्पी ओ में रेस्ट कोशिकाओंआर अच्छी तरह से इनक्यूबेटर में रात खत्म। कोशिकाओं उत्तेजना assays के लिए सीधे इस्तेमाल कर रहे हैं, उन्हें मध्यम के साथ एक बार धो लें।
  3. पवित्रता नियंत्रण धुंधला
    1. 20 μl में प्रत्येक 50,000 कोशिकाओं (PBMCs; nTreg Tnaïve) ले लो ~।
      नोट: दोनों Tnaïve और nTreg पैनल दाग हो रहे हैं, 2 नमूने प्रत्येक ले।
    2. उदाहरण के लिए, साधन के लिए 2x केंद्रित एंटीबॉडी (पीबीएस में) के रूप में उपयुक्त Premix तैयार: Tnaïve पैनल: सीडी 4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO पीई 1: 5, सीडी 8-eFlour450 1: 8। Treg पैनल के लिए, CD25 पीई, 1:10 के साथ CD45RO पीई की जगह।
      नोट: केवल कुछ CD25 एंटीबॉडी, कि CD25-microbeads की तुलना में अलग epitopes पहचान, CD25 microbeads के साथ अलग nTregs दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. 20 μl कोशिकाओं को 20 μl एंटीबॉडी Premix जोड़ें। इसके अलावा settin प्रवाह cytometry के लिए, प्रत्येक fluorochrome (सकारात्मक कोशिकाओं से युक्त एक नमूना का उपयोग कर, जैसे, PBMCs) और एक बेदाग नमूना के लिए एकल stainings तैयारजी एस और मुआवजा।
    4. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. 200 μl पीबीएस के साथ प्रत्येक नमूना भरें, और 5-10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज 450 XG।
    6. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) बफर (= अलगाव बफर EDTA के बिना) में कोशिकाओं को ले लो और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण। भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की पवित्रता आमतौर पर> 95% है (देखें चित्र 2)।

2. Treg प्रेरण संस्कृति

  1. उत्तेजना मीडिया और प्लेट्स की तैयारी
    1. तैयार है और पूर्व गर्म टी सेल संस्कृति के माध्यम से: सीरम मुक्त hematopoietic मध्यम 2 मिमी एल alanyl-एल glutamine के साथ पूरक।
    2. साइटोकाइन, उत्तेजना एंटीबॉडी और यौगिक शेयर सांद्रता तैयार करें।
      1. आईएल -2 शेयर समाधान तैयार: बाँझ फ़िल्टर (एसिड प्रतिरोधी फिल्टर के साथ) 100 मिमी एसिटिक एसिड में 400,000 आइयू / एमएल (167 माइक्रोग्राम / एमएल अगर इस्तेमाल बहुत की गतिविधि 1 माइक्रोग्राम प्रति 2,400 आइयू है, प्रदाता के साथ की पुष्टि)। निष्फल कम प्रोटीन 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों बाध्यकारी को अशेष, Parafilm के साथ सील लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान पर फ्रीज या -20 डिग्री अप करने के लिए 3 महीने के लिए सी।
      2. (एसिड प्रतिरोधी फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर), अपकेंद्रित्र TGF-β1 पाउडर (1000 XG 3 मिनट) 4 मिमी एचसीएल के 100 μl जोड़ने के शेयर समाधान तैयार करने के लिए: (10 माइक्रोग्राम प्रति शीशी, वाहक मुक्त करने के लिए) TGF-β1 शेयर समाधान तैयार 100 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ, पूरी तरह से भंग करने के लिए अनुमति देते हैं; भंवर। अशेष 5 निष्फल कम प्रोटीन 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों बाध्यकारी करने के लिए प्रत्येक μl, Parafilm के साथ सील अप करने के लिए 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान पर फ्रीज।
      3. ATRA शेयर समाधान तैयार: DMSO में 20 मिलीग्राम / एमएल (66.6 मिमी) पर पाउडर भंग। 10 मिमी के शेयर समाधान अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर, DMSO और दुकान aliquots में आगे कमजोर पड़ने, प्रकाश से सुरक्षित द्वारा तैयार करें। ATRA प्रकाश, गर्मी और हवा के प्रति संवेदनशील है।
      4. के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर DMSO में 1 मिलीग्राम / एमएल (1.11 मिमी), aliquots में स्टोर: rapamycin शेयर समाधान तैयार1 साल तक।
      5. बाँझ अति शुद्ध एच 2 हे और बाँझ फिल्टर में 0.908 एम (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के शेयर: सोडियम butyrate शेयर समाधान तैयार है। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    3. तालिका 1 में के रूप में टी सेल संस्कृति माध्यम में 4x केंद्रित premixes (अच्छी तरह से प्रति 50 μl) तैयार करें।
    4. पिछले दिन पर, विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ कोट प्लेटें। 5 माइक्रोग्राम प्रति पीबीएस में / एमएल विरोधी CD3 एंटीबॉडी, 65 μl के साथ 96 यू अच्छी तरह से थाली से कुओं की कोट वांछित संख्या / अच्छी तरह से। पन्नी के साथ थाली लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
      नोट: 96 अच्छी तरह से प्लेटों के मार्जिन कुओं का प्रयोग न करें। बड़ा कुओं में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यू के आकार कुओं प्रयोगों भर में क्षेत्र के प्रति एक ही सेल नंबर के उपयोग की सुविधा। अधिक कोशिकाओं की जरूरत है, संस्कृति के बाद कुओं के लिए आवश्यक राशि पूल। आमतौर पर, विस्तार के 4-6 दिनों के बाद, 2 कुओं प्रत्येक नमूना से फ्लो विश्लेषण और शाही सेना के विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं।
      1. चढ़ाना के दिन, शीघ्र ही चढ़ाना पहले, विरोधी को दूरकुओं से -CD3 समाधान। 200 μl / अच्छी तरह से पीबीएस के साथ कुओं भरें। पीबीएस निकालें। 200 μl / अच्छी तरह से पीबीएस के साथ कपड़े धोने दोहराएँ। पीबीएस पूरी तरह से निकालें और तुरंत प्लेटों का उपयोग करें।
    5. प्लेट (मार्जिन कुओं का उपयोग नहीं करते) तैयार करें:
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से, के 4x विरोधी CD28 / आईएल -2 Premix 50 μl जोड़ने के लिए, 50 μl 4x TGF-β1 Premix (सभी iTregs के लिए) या 50 μl टी सेल संस्कृति ( "unstimulated" कोशिकाओं के अलावा, टी सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ने के लिए) "उत्तेजना केवल" नकली नियंत्रण के लिए मध्यम, 50 μl 4x ATRA, ATRA / rapamycin या butyrate Premix (जहां लागू हो) या मध्यम
      2. 200 μl पीबीएस के साथ सभी खाली कुओं भरें, मार्जिन कुओं भी शामिल है। 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में पूर्व गर्म प्लेटें।
  2. चढ़ाना के लिए भोले टी कोशिकाओं को तैयार
    1. कोशिकाओं को आराम करने के बाद, 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण पूर्व गर्म टी सेल संस्कृति के माध्यम से और ट्यूब के लिए पूल के साथ फ्लास्क / कुओं कुल्ला। टी सेल संस्कृति के माध्यम से 15 मिलीलीटर ट्यूब भरें। </ Li>
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
    3. मध्यम निकालें और 2.2-2.6 x 10 6 / एमएल के एक घनत्व के लिए ताजा, पूर्व गर्म टी सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को ले। कदम 1.2.2 के रूप में कोशिकाओं की गणना और अगर जरूरत घनत्व को समायोजित।
    4. (2.1 देखें), 50 μl कोशिकाओं / अच्छी तरह से (110,000-130,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) तैयार उत्तेजना प्लेटों के लिए कोशिकाओं जोड़ें। हर अच्छी तरह से अब 200 μl की कुल मात्रा को शामिल करना चाहिए।
    5. लपेटें प्रकाश से ATRA की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेटें; वांछित समय अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  3. मॉनिटर Treg प्रेरण संस्कृति
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी (40x बढ़ाई) द्वारा Treg संस्कृतियों मॉनिटर। 2 दिन के बारे में से 3, proliferating कोशिकाओं के छोटे समूहों दिखाई दे, जो बाद में समय बिंदुओं पर बड़ा समूहों में विलय हो जाना चाहिए। rapamycin के साथ हो संस्कृतियों आम तौर पर कम हो जाना। यह भी 3 आंकड़ा देखें।
    2. वांछित समय बिंदुओं पर, आरएनए ई के लिए नमूने लेनेxtraction या phenotyping प्रवाह cytometry (देखें नीचे)। सेल प्रसार, 1 अच्छी तरह से बाद में समय अंक के लिए प्रत्येक के लिए पर्याप्त है, अन्यथा शाही सेना के लिए 1 एक्स 10 5 -1 एक्स 10 6 कोशिकाओं को एक और 3 x 10 5 -1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के प्रवाह के लिए cytometry ले।
  4. Foxp3 स्थिरता का आकलन
    1. के रूप में पहले 22,27 वर्णित iTreg phenotype की स्थिरता का आकलन करने के लिए, iTregs टी सेल संस्कृति के माध्यम से दो बार धोने, और संस्कृति iTregs टी सेल संस्कृति माध्यम में आगे या तो बिना या विरोधी CD3 और विरोधी CD28 restimulation 2.1 और 2.2 में वर्णित के रूप में साथ । साइटोकिन्स जोड़ें, इस तरह के रूप में 50 आइयू / एमएल आईएल -2, Foxp3 स्थिरता पर अपने प्रभाव का अध्ययन करने के लिए।
    2. वांछित समय बिंदुओं पर, शाही सेना निकासी के लिए नमूने लेने phenotyping प्रवाह cytometry (देखें नीचे), और TSDR मेथिलिकरण विश्लेषण के रूप में वर्णित 22,28।

QRT- पीसीआर द्वारा iTregs 3. प्ररूपी विश्लेषण

  1. की तैयारीनमूने
    1. वांछित समय बिंदुओं पर, शाही सेना निकासी के लिए नमूना प्रति 1 एक्स 10 5 1 x 10 6 कोशिकाओं ले। एक RNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब, और 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं स्थानांतरण।
    2. यदि आवश्यक हो, सतह पर तैरनेवाला का हिस्सा हटाने और एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) या इसी तरह के विश्लेषण के लिए फ्रीज। कोशिकाओं से पूरी तरह से शेष सतह पर तैरनेवाला निकालें। आरएनए निकासी के लिए सीधे आगे बढ़ना या सेल गोली सूखी बर्फ और दुकान पर अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए डिग्री सेल्सियस -80 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।
    3. शाही सेना निकालें और Foxp3 और एक गृह व्यवस्था जीन (जैसे Rpl13a के रूप में) के लिए QRT- पीसीआर प्रदर्शन मानक प्रोटोकॉल के अनुसार। इसके अलावा, अन्य Treg हस्ताक्षर जीनों की अभिव्यक्ति को मापने (उदाहरण के लिए `Treg up' जीन IL2RA, CTLA4, IKZF4, और` Treg down' जीन IFNG, SATB1)।

4. प्ररूपी विश्लेषण से फ्लो द्वारा

नोट: इस प्रोटोकॉल दाग के लिए अनुकूलित है3 एक्स 10 5 -1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के साथ 96U अच्छी तरह से थाली प्रारूप में हैैं। अच्छी तरह से प्रति कम कोशिकाओं रहे हैं, तो कई कुओं और पूल के साथ शुरू के रूप में नीचे वर्णित है।

  1. सेल Restimulation (वैकल्पिक)
    1. intracellular साइटोकिन्स के लिए धुंधला हो जाना वांछित है, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) के साथ पल्स कोशिकाओं / एक प्रोटीन परिवहन अवरोध की उपस्थिति में Ionomycin।
      नोट: यह प्रक्रिया ऊपर वर्णित iTreg संस्कृतियों में Foxp3 अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन अन्य मार्कर बदल सकता है - उदाहरण के लिए, सीडी 4 downregulated है।
    2. तैयार टी सेल संस्कृति माध्यम में 10x Brefeldin ए / पीएमए / Ionomycin Premix (अच्छी तरह से प्रति 20 μl): Brefeldin एक शेयर समाधान 1: 100, Ionomycin (शेयर 5 माइक्रोग्राम / μl) 1: 1300, पीएमए (शेयर 12.35 माइक्रोग्राम / μl, पूर्व -dilute 1: 1235) 1: पूर्व पतला शेयर के 100।
    3. 1,000 Brefeldin ए, 0.5 μ: धुंधला से पहले 4 घंटे, 1 के अंत सांद्रता प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 20 μl Brefeldin ए / पीएमए / Ionomycin 10x मिश्रण जोड़नेएम (375 एनजी / एमएल) Ionomycin, 10 एनजी / एमएल पीएमए।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 4 घंटे के लिए सेते
  2. सतह धुंधला
    नोट: पैनल यहाँ का सुझाव दिया एक सुझाव है; अन्य पैनलों ब्याज और साधन की स्थापना के एंटीजन के आधार पर किया जा सकता है।
    1. बर्फ पर पीबीएस कूल। और बर्फ पर शांत (0.5% मानव सीरम albumin, एचएसए के साथ पीबीएस) FACS बफर तैयार करें। बीएसए या FBS एचएसए के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. धुंधला थाली में पुन प्लेट कोशिकाओं: Resuspend एक विंदुक के साथ कोशिकाओं और एक नया 96U अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को हस्तांतरण, अच्छी तरह से प्रत्येक के आसपास मुक्त अच्छी तरह से (बाद में धुंधला प्रक्रिया में spillover रोकने के लिए) एक को छोड़कर। वांछित सेल नंबर से भी कम समय में अच्छी तरह से मूल में मौजूद हैं, तो अच्छी तरह से एक धुंधला में मेजबान से पहले सतह पर तैरनेवाला के हिस्से को हटाने, और पूल कई कुओं।
    3. अपकेंद्रित्र प्लेट कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 400 XG।
    4. सतह पर तैरनेवाला निकालें। अपशिष्ट बॉक्स में सतह पर तैरनेवाला बाहर डालो, थाली उल्टा छोड़नीचे और तुरंत (वापस प्लेट बदल के बिना) प्लेट एक बार शोषक कागज पर नल। फिर तुरंत वापस थाली की बारी है। भंवर प्लेट शेष तरल में कोशिकाओं resuspend।
    5. और resuspend: 25 μl सतह धुंधला Premix (5 FACS बफर में CD25 पीई 1:20, सीडी 4-PerCP 1) जोड़ें।
      नोट: इसके अलावा नमूने है कि संबंधित प्रतिजन के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को रोकने के साथ इस्तेमाल किया fluorochromes से प्रत्येक के लिए एक stainings शामिल हैं; और एक बेदाग नमूना शामिल हैं। ये साधन मुआवजा स्थापना के लिए आवश्यक हो जाएगा। वैकल्पिक रूप से, मुआवजा मोती का उपयोग करें।
    6. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 μl पीबीएस, सेंट्रीफ्यूज प्लेट 400 XG जोड़ें और कदम 4.2.4 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला हटा दें। भंवर थाली।
    8. दोहराएँ कदम 4.2.7 दो बार।
  3. व्यवहार्यता धुंधला
    नोट: व्यवहार्यता धुंधला हो जाना, अपरिहार्य है, क्योंकि निर्धारण / permeabilization के बाद मृत कोशिकाओं को पर्याप्त से बाहर नहीं किया जा सकता हैएफएससी / एसएससी और unspecific संकेतों को जन्म दे सकता है। एक fixable व्यवहार्यता डाई का इस्तेमाल किया जाना है।
    1. 130 μl व्यवहार्यता दाग Premix में Resuspend कोशिकाओं (फिक्स व्यवहार्यता डाई eFlour780 1: पीबीएस में 1,400) और मल्टीचैनल pipet के साथ तुरंत resuspend कोशिकाओं।
      नोट: इसके अलावा व्यवहार्यता कई दिनों के लिए मृत कोशिकाओं, जैसे, unstimulated टी कोशिकाओं से युक्त सुसंस्कृत या निर्माताओं के निर्देशों के रूप में गर्मी लगाने से कोशिकाओं को मारने के लिए एक एकल डाई धुंधला शामिल हैं। इन क्षतिपूर्ति के लिए आवश्यक हो जाएगा।
    2. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र थाली। कदम 4.2.4 के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें। भंवर थाली।
    4. 200 μl FACS बफर के साथ भरें। दोहराएँ कदम 4.3.3।
    5. 200 μl पीबीएस के साथ भरें। दोहराएँ कदम 4.3.3।
  4. Foxp3 बफर धुंधला सेट के साथ intracellular धुंधला
    1. प्रत्येक कुएं के लिए, तैयार: 150 μl फिक्स / पर्म बफर (पतला फिक्स / पर्म सान्द्रentrate 1: मंदक के साथ 4); 850 μl 1x permeabilization बफर (साथ अति शुद्ध एच 2 ओ 10x permeabilization बफर 1:10 पतला)।
    2. vortexing के बाद, 150 μl फिक्स / पर्म बफर में और तुरंत resuspend कोशिकाओं विंदुक के साथ resuspend। यह तुरंत सेल झुरमुटों के निर्धारण से बचने के लिए resuspend करने के लिए महत्वपूर्ण है।
      सावधानी: निर्धारण बफर paraformaldehyde में शामिल है और संभाला और उचित रूप से खारिज किया जाना चाहिए।
    3. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं।
    4. 100 μl ठंड पीबीएस जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 850 XG पर अपकेंद्रित्र।
      नोट: इस कदम के बाद से centrifugation गति कोशिकाओं के नुकसान से बचने के लिए बढ़ जाती है। निर्धारण के बाद, कोशिकाओं अदृश्य हो जाते हैं और देखभाल के कदम 4.2.4 में वर्णित है और तुरंत बाद centrifugation कोशिकाओं के नुकसान को कम करने के लिए समाप्त हो गया है के रूप में supernatants दूर करने के लिए लिया जाना चाहिए।
    5. कदम 4.2.4 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें। भंवर थाली।
      नोट: धुंधला इस कदम पर रुका हुआ जा सकता है; मेंइस मामले में, कोशिकाओं 200 μl पीबीएस के साथ दो बार धोने; तो 250 μl पीबीएस में लेने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, प्रकाश से रक्षा की। कोशिकाओं को कुछ दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है, तो permeabilization के साथ आगे बढ़ें। हालांकि, इष्टतम परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब सीधे permeabilization करना जारी रखा।
    6. vortexing के बाद, 200 μl Permeabilization बफर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 850 XG पर अपकेंद्रित्र। कदम 4.2.4 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें। भंवर थाली।
    7. resuspend करने के लिए 200 μl Permeabilization बफर जोड़ें।
      नोट: यहाँ, नमूने intracellular धुंधला हो जाना और निर्धारण नियंत्रण नमूना में विभाजित किया जा सकता है (प्रत्येक नमूने की दूरी पर आधा ले)। सेल नंबर को सीमित कर रहे हैं, तो एक जमा निर्धारण नमूना तैयार किया जा सकता है (दूर प्रत्येक नमूना और पूल के 10-20 μl लेने के लिए)। इसके अलावा, नमूने प्रतिदीप्ति-ऋण-वन (FMO) नियंत्रण के लिए ले जाया जा सकता है।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 850 XG पर अपकेंद्रित्र। कदम 4.2.4 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें। भंवर थाली।
    9. में resuspend गोली44 μl Permeabilization बफर प्लस 1 μl सामान्य माउस सीरम (premixed) unspecific बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए।
      नोट: इस पर लागू होता है, तो निम्न चरण में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी murine निर्धारण के हैं। इस तरह, चूहे से व्युत्पन्न के रूप में अन्य एंटीबॉडी, इस्तेमाल कर रहे हैं, अवरुद्ध (जैसे, चूहे सीरम) के लिए उपयुक्त सीरम शामिल हैं।
    10. अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    11. एंटीबॉडी जोड़ें:
      नोट: विशिष्ट बहुत सारे के लिए एंटीबॉडी सांद्रता में पूछें। तो संबंधित fluorochromes के साथ सतह एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी (जैसे, सीडी 4) के साथ 4.2 कदम में नहीं किया, यह भी नमूने है कि मुआवजे के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को रोकने के साथ इस्तेमाल किया fluorochromes से प्रत्येक के लिए एक stainings शामिल हैं।
      1. (एकल stainings, बेदाग नमूने, निर्धारण नियंत्रण के नमूने और FMO नियंत्रण करने के लिए छोड़कर) नमूने के 15 μl एंटीबॉडी Premix जोड़ें: 0.7 μl (0.35 माइक्रोग्राम) विरोधी इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) -FITC (यदि restimulation के बाद लागू: नमूना प्रति Premix ),2.3 μl (0.115 माइक्रोग्राम) CTLA -4 खूब वायलेट 421, 2 μl (0.05 माइक्रोग्राम) विरोधी Foxp3 एपीसी, 10 μl पीबीएस।
      2. नियंत्रण नमूने निर्धारण करने के लिए, 15 μl निर्धारण एंटीबॉडी Premix जोड़ने के लिए, 4.4.11.1 में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए के रूप में एंटीबॉडी का एक ही मात्रा का उपयोग: नमूना प्रति Premix: 0.7 μl (0.35 माइक्रोग्राम) माउस IgG1 कश्मीर निर्धारण नियंत्रण FITC (यदि लागू हो), 0.58 μl (0.115 माइक्रोग्राम) माउस IgG2a-BV421 निर्धारण, 0.5 μl (0.05 माइक्रोग्राम) माउस IgG1 कश्मीर निर्धारण नियंत्रण एपीसी, 13.2 μl पीबीएस।
      3. FMO नियंत्रण के लिए, 4.4.11.1 के रूप में एंटीबॉडी जोड़ने के लिए, पीबीएस के साथ एक एंटीबॉडी प्रत्येक जगह ले।
    12. अंधेरे में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    13. 200 μl Permeabilization बफर जोड़ें। अपकेंद्रित्र, कदम 4.4.8 के रूप में सतह पर तैरनेवाला और भंवर को हटा दें। एक बार पुन: दोहराएं।
    14. ठंड FACS बफर में Resuspend कोशिकाओं (प्रयुक्त साधन के अनुसार मात्रा) और कोशिकामापी अधिग्रहण, आदर्श तुरंत प्रवाह पर।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रयोगात्मक स्थापना की एक योजना से पता चलता है। चित्रा 2 चुंबकीय पृथक भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं और nTregs के लिए एक प्रतिनिधि पवित्रता नियंत्रण धुंधला से पता चलता।

एफ igure 3 ए gating रणनीति प्रवाह cytometry पता चलता है और चित्रा 3 बी प्रतिनिधि Foxp3 और CD25 संकेत दिया iTreg या नियंत्रण की शर्तों के तहत संस्कृति के 6 दिन पर stainings प्रवाह cytometry से पता चलता है। इन विट्रो उत्तेजना पर, सबसे कोशिकाओं CD25, जो rapamycin की उपस्थिति में कम हो जाता है upregulate। केवल iTreg उत्प्रेरण कारकों के अलावा तहत, Foxp3 + कोशिकाओं का एक स्पष्ट आबादी स्पष्ट हो जाता है, जो भी iTreg की शर्तों के तहत CD25 + कोशिकाओं के भीतर समृद्ध है। चित्रा -3 सी अंधेरे समूहों के रूप में देखा कोशिकाओं proliferating साथ माइक्रोस्कोप में iTreg संस्कृतियों के प्ररूपी उपस्थिति को दर्शाया गया है। प्रत्येक मैं Treg हालत सेल प्रसार का एक विशिष्ट और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पैटर्न से पता चलता है: इन संस्कृति शर्तों के तहत, TGF-β थोड़ा प्रसार बढ़ जाती है, और ATRA आगे प्रसार बढ़ जाती है। इसी समय, rapamycin द्वारा प्रसार के निषेध दृढ़ता से कम क्लस्टर आकार से स्पष्ट है। प्रसार शक्ति के सूक्ष्म उपस्थिति भी कुल कोशिकाओं की गिनती से मेल खाती है (शामिल नहीं डेटा)।

चित्रा QRT- पीसीआर के 4 दिखाता प्रतिनिधि परिणाम iTreg (और नियंत्रण) में Foxp3 mRNA प्रेरण अलग समय बिंदुओं पर संस्कृतियों का विश्लेषण करती है। Foxp3 प्रोटीन के रूप में, Foxp3 mRNA अभिव्यक्ति rapamycin इलाज iTregs अन्य iTregs की तुलना में अपेक्षाकृत कम स्तर होने के साथ प्रेरित कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में सभी iTregs में अधिक है। NTregs में Foxp3 mRNA iTregs की तुलना में अधिक है।

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चित्रा 1: iTreg प्रेरण, nTreg अलगाव, और Treg विश्लेषण के लिए प्रायोगिक योजना। मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं बफी कोट से अलग और विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ साथ 100 यू / एमएल आईएल -2 के लिए 6 दिनों के लिए, या तो अभाव में ( `नकली नियंत्रण कोशिकाओं के साथ सीरम मुक्त माध्यम में प्रेरित थे ') या अलग Treg उत्प्रेरण कारकों की उपस्थिति ( `iTreg') के रूप में संकेत दिया। nTregs अलग-थलग और समानांतर में यत्न कर रहे हैं। प्ररूपी विश्लेषण फ्लो और QRT- पीसीआर के द्वारा किया जा सकता है। श्मिट, ए एट अल से संशोधित। 2016 22। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: आबादी शुरू करने की सेल शुद्धता। भोले मानव सीडी 4 + टी कोशिकाओं भोले सीडी 4 टी सेल अलगाव किट द्वितीय, मानव द्वारा अलग थे। ऊपरी पैनल: भोले सीडी 4+ टी सेल पवित्रता, सीडी 4, CD45RA और CD45RO के आधार पर, 98% करने के लिए 94 थी और 30 से अधिक के एक प्रतिनिधि दाता के लिए पवित्रता दिखाया गया है ( `Tnaïve')। पूर्व vivo Tregs ( `nTreg') CD25 microbeads की सीमित मात्रा का उपयोग करके अलग-थलग और iTreg प्रयोगों के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। एक प्रतिनिधि दाता, CD25 और सीडी 4 के आधार पर की nTreg शुद्धता, दिखाया गया है। लोअर पैनल: Intracellular Foxp3 धुंधला (चित्रा 3 और लाइव सीडी 4 + कोशिकाओं पर प्री-गेटेड में के रूप में प्रदर्शन) भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं और nTregs क्रमशः के लिए दिखाया गया है, ऊपरी पैनल के रूप में ही दाता से कोशिकाओं का उपयोग। श्मिट, ए एट अल से संशोधित। 2016 22। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ntent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3: iTregs और nTregs की प्ररूपी उपस्थिति। मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को संकेत दिया की शर्तों के तहत सीरम मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत थे। टी कोशिकाओं विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ साथ 100 यू / एमएल आईएल -2 ( `Stim.') के साथ प्रेरित किया गया। जहां संकेत, TGF-β1 ( `TGF'), rapamycin (` Rapa'), सब पार retinoic एसिड ( `ATRA') या butyrate जोड़ा गया था। nTregs (पूर्व vivo पृथक परिधीय रक्त CD25 ++ कोशिकाओं) unstimulated ( `unstim.') छोड़ दिया गया है और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया। Unstimulated भोले टी कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। (ए) संस्कृति के 6 दिन, कोशिकाओं विरोधी CD25 और विरोधी सीडी 4 सहित सतह एंटीबॉडी, तो फिक्स व्यवहार्यता डाई के साथ दाग और बाद में निर्धारित / permeabilized और विरोधी Foxp3 और विरोधी CTLA -4 या निर्धारण के साथ intracellularly दाग के साथ दाग थे शेष भाग ROL एंटीबॉडी। अधिग्रहण और मुआवजा एक सियान ADP प्रवाह कोशिकामापी पर प्रदर्शन किया गया था और डेटा FlowJo सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया। gating रणनीति लाल तीर द्वारा संकेत दिया है, और दिखाया उदाहरण के एक iTreg नमूना TGF + ATRA के साथ प्रेरित है। (बी) कोशिकाओं (ए) के रूप में दाग थे, और नियंत्रण टी कोशिकाओं और अलग प्रोटोकॉल से प्रेरित iTregs में Foxp3 और CD25 अभिव्यक्ति दिखाया गया है। Pseudocolor भूखंडों, एक दाता, स्वेटर पर पूर्व-गेटेड के लिए प्रतिनिधि Foxp3 और CD25 stainings दिखाने में (ए) के रूप में रहने सीडी 4 + कोशिकाओं। निर्धारण उदाहरण के एक iTreg के लिए दिखाया गया है (stim। + TGF + ATRA) नमूना। (सी) प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियों 4 दिनों के लिए संवर्धित कोशिकाओं के व्यक्तिगत 96U-प्लेट कुओं की (40x बढ़ाई)। कोशिकाओं की डार्क समूहों proliferating कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ntent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4: iTreg भेदभाव के लिए अलग प्रोटोकॉल के उपयोग पर Foxp3 mRNA अभिव्यक्ति। iTregs संकेत दिया की शर्तों के तहत 3 चित्र में के रूप में उत्पन्न हुए थे, और दिए गए समय के बिंदुओं पर, सेल के नमूने ले जाया गया और आरएनए निकाला गया था। Unstimulated भोले टी कोशिकाओं, और unstimulated nTregs, दिन 0. नमूने QRT- पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया पर नमूना थे, और Foxp3 mRNA अभिव्यक्ति प्रत्येक नमूना के लिए Rpl13a अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत था। Unstimulated भोले टी कोशिकाओं में Foxp3 mRNA अभिव्यक्ति 1 पर सेट है, और Foxp3 mRNA की परिवर्तन गुना गणना की गई था। दिखाया गया हैं मतलब मूल्यों और पीसीआर की सीमा के एक प्रतिनिधि दाता के लिए कुओं को दोहराने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल मानव सीडी 4 + Foxp3 + मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से iTregs के मजबूत प्रेरण सक्षम बनाता है। यह एक नए प्रोटोकॉल है कि हम हाल ही में वर्णित है, TGF-β, ATRA और rapamycin के संयोजन का उपयोग बेहतर इन विट्रो दमनकारी समारोह 22 के साथ iTregs के शामिल होने के लिए, शामिल हैं। अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में, एक और लाभ यह अलग प्रोटोकॉल से समानांतर में विभिन्न iTreg आबादी की प्रेरण, जो कुछ iTreg उत्प्रेरण कारकों के प्रभाव का प्रत्यक्ष तुलना में सक्षम बनाता है, नियंत्रण कक्षों की उपस्थिति है कि अकेले आईएल -2 में सक्रिय कर रहे हैं के साथ है । वर्णित प्रोटोकॉल कम दाता बदलाव के साथ Foxp3 की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रेरण सक्षम करें। इस प्रोटोकॉल में अनुभवहीन सीडी 4+ टी कोशिकाओं चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई से अलग कर रहे हैं, लेकिन प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई भी संभव है। इस प्रोटोकॉल के साथ भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की उम्मीद की उपज है, आमतौर पर 5-10% के बीच है लेकिन दृढ़ता से दाता (उम्र) पर निर्भर करता है और भी कम आता है, जब एरिथ्रोसाइट्स की उच्च अंशों मौजूद हैं। एक अनुमान की जरूरत है, PBMCs कलंकित किया जा सकता (1.4 कदम देखें) एककेंद्रकश्वेतकोशिका कमी चरण के दौरान। आमतौर पर, भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की उपज के बारे में PBMC दाग में "लिम्फोसाइट गेट का प्रतिशत भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं" का आधा है। इस प्रोटोकॉल CD25 मोतियों की सीमित मात्रा में उपयोग करता CD25 उच्च (nTreg) कोशिकाओं 29 प्राप्त करने के लिए। हालांकि, इन शुद्ध Tregs नहीं हैं, लेकिन ये सिर्फ Tregs में समृद्ध कर रहे सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। अगर शुद्ध Tregs की जरूरत है, अन्य किट (जैसे सीडी 4 संवर्धन और CD127 कमी के साथ संयुक्त) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए या वैकल्पिक रूप से, CD25 + कोशिकाओं 10 7 कोशिकाओं प्रति 8 μl CD25 मोतियों के साथ प्री-समृद्ध और दाग और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के अनुसार क्रमबद्ध कड़े सीडी 4 + CD25 ++ gating साथ छँटाई। इसके अलावा ऐसे CD127 बहिष्कार के रूप में अन्य मार्कर, के शामिल किए जाने पर विचार किया जाना चाहिए।

_content "> यह विचार करना है कि Foxp3 आवश्यक है, लेकिन Treg पहचान 30 प्रदान करने के लिए पर्याप्त नहीं है। iTregs के कुछ पहलुओं, उदाहरण के लिए अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, Foxp3 विनियमन, यह ध्यान दें कि iTregs nTregs से अलग महत्वपूर्ण है लेकिन महत्वपूर्ण है में मापा जाता है के रूप में कई पहलुओं के बारे में। यह तुलना के लिए इसलिए सभी assays में iTregs के समानांतर में संस्कृति nTregs (आदर्श एक ही दाता से व्युत्पन्न) के लिए महत्वपूर्ण है। nTregs और iTregs के बीच अंतर nTreg और iTreg transcriptome का केवल आंशिक ओवरलैप द्वारा उदाहरण है murine iTregs 31। Foxp3 के अलावा अन्य Treg हस्ताक्षर जीन इस कारण से मापा जाना चाहिए, और मानव कोशिकाओं में सक्रियण प्रेरित Foxp3 अभिव्यक्ति से भेदभाव सुनिश्चित करते हैं। उदाहरण के लिए, iTregs CD25 के उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शित करना चाहिए, CTLA-4 और EOS तुलना सक्रिय टी कोशिकाओं के लिए है जबकि IFN-γ और SATB1 की अभिव्यक्ति, nTregs और यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल से प्रेरित iTregs में कम किया जाना चाहिए, जैसा कि पहले प्रकाशित 13 में Foxp3 लोकस में TSDR क्षेत्र के मेथिलिकरण से मेल खाती है। एक जीनोम व्यापक पैमाने पर इसके अलावा, यह बताया गया था कि murine iTregs में डीएनए मेथिलिकरण और हिस्टोन संशोधनों के epigenetic पैटर्न पैटर्न nTregs 30 में पाया प्रतिबिंबित नहीं करते। हम पहले से वर्णित है कि यहाँ से प्रेरित iTregs nTregs करने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है, इसके विपरीत, TSDR demethylation प्रदर्शन नहीं किया था। जब restimulated तदनुसार, iTregs Foxp3 खो दिया है, लेकिन Foxp3 अभिव्यक्ति आईएल -2 की और restimulation 22 बिना उपस्थिति में जब आगे सुसंस्कृत बनाए रखा। दिलचस्प है, एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल M2 बृहतभक्षककोशिका supernatants का उपयोग करके प्रेरित iTregs Foxp3 स्थिरता बढ़ाया प्रदर्शित, Foxp3 प्रेरण 27 के लिए TSDR demethylation और TGF-β प्रेरणा का होने की कमी के बावजूद।

iTreg का संशोधनके रूप में बहुत हाल ही में वर्णित 32, यौगिकों (जैसे विटामिन सी या हाइड्रोजन सल्फाइड के रूप में) है कि दस-ग्यारह translocation (टीईटी) मिथाइलसिटोसाइन dioxygenase एंजाइमों को प्रभावित के अलावा द्वारा प्रोटोकॉल -inducing - 34, डीएनए मेथिलिकरण को प्रभावित करने से Foxp3 स्थिर रखने में जोड़ सकते हैं। इसके अलावा, उत्तेजना शक्ति और समय Foxp3 अभिव्यक्ति और स्थिरता 35 पर एक प्रभाव है। इन पंक्तियों के साथ, थाली बाध्य एंटीबॉडी के बजाय मनका-युग्मित CD3 / CD28 एंटीबॉडी का उपयोग TSDR demethylation 36 के स्वतंत्र यद्यपि murine iTreg इन विवो दमनकारी समारोह और स्थिरता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था। एक और पहलू भिन्नता का एक संभावित स्रोत के रूप में विचार करने की जरूरत है कि सीरम का उपयोग करते हैं, जो TGF-β जो भी गोजातीय स्रोत से मानव कोशिकाओं के साथ 100% पार प्रतिक्रियाशील है सहित अपरिभाषित कारकों में शामिल है। इसके अलावा, स्रोत और आईएल -2 की गतिविधि काफी Foxp3 प्रेरण के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं।

एक महत्वपूर्ण चTregs की eature उनकी दमनकारी क्षमता है, जो इस प्रोटोकॉल में उत्पन्न iTregs के साथ बाद में परीक्षण किया जा करने की जरूरत है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि iTregs साथ दमन assays तुच्छ नहीं हैं और iTregs की दमनकारी क्षमताओं के बारे में साहित्य विवादास्पद है। ऐसे Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के कमजोर पड़ने के रूप में readouts प्रवाह cytometry के आधार पर 41, इन विट्रो प्रसार assays के साथ सबसे अधिक इस्तेमाल किया जा रहा है - कई तरीकों और प्रोटोकॉल दमनकारी समारोह के मानव Tregs कहीं और प्रकाशित किया गया है 22,37 आकलन करने के लिए। इसे धोने और दमन assays में उपयोग करने से पहले आराम iTregs करने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह कि iTregs, nTregs के विपरीत, नहीं anergic हो सकता है लेकिन दमन assays के दौरान खुद को पैदा कर सकता है पर विचार करने की जरूरत है। हम यह अत्यंत महत्वपूर्ण `उपयोग करने के mock' टी कोशिकाओं को प्रेरित के रूप में नियंत्रण शमन कोशिकाओं unspecific दमन (जैसे CTLA -4 अभिव्यक्ति के माध्यम के रूप में की डिग्री की पहचान करने के लिए विचार करना है, आईएल -2 consumption और सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा संस्कृति अतिवृद्धि) कि Foxp3 + Treg विशेष प्रभाव से संबंधित नहीं है, और इस पर नियंत्रण की लगातार कमी साहित्य में कुछ विवादों में योगदान कर सकते। इस पर नियंत्रण का उपयोग करना, हम परिभाषित किया है कि केवल TGF-β / ATRA / Rapa प्रेरित iTregs विट्रो 22 में दमनकारी गतिविधि का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, हम निष्कर्ष है कि दमनकारी गतिविधि के बारे में (Foxp3 + कोशिकाओं की नहीं उच्चतम अंश यद्यपि), TGF-β / ATRA / Rapa वर्णित प्रोटोकॉल के कारकों iTregs के लिए प्रेरित करने का सबसे अच्छा संयोजन है। फिर भी, इन विट्रो में दमनकारी गतिविधि जरूरी विवो में दमनकारी गतिविधि प्रतिबिंबित नहीं करता है, और वास्तव में हम निर्धारित किया है कि मानव इन प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न iTregs कम से कम 22 की स्थिति का परीक्षण के तहत एक xenogeneic graft- बनाम मेजबान रोग मॉडल में दबा नहीं था। इस TSDR demethylation 22 की कमी के साथ लाइन में अस्थिरता Foxp3 अभिव्यक्ति है जो restimulation पर iTregs में खो गया था से संबंधित हो सकता है,

जो iTreg सुविधाओं का पहलू (Foxp3 + कोशिकाओं की उच्च अंश, बेहतर दमनकारी गतिविधि Foxp3 स्थिरता) पर निर्भर करता है एक विशेष अनुसंधान प्रश्न के लिए सबसे महत्वपूर्ण है, अलग प्रोटोकॉल सबसे इन सवालों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है, यह मुश्किल आम तौर पर 'सर्वश्रेष्ठ परिभाषित करने के लिए प्रतिपादन Treg शामिल करने के लिए 'प्रोटोकॉल। इसके अलावा, कई ऊपर वर्णित सूक्ष्म प्रयोगात्मक मतभेद परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और TGF-β प्रेरित iTregs है कि भले iTreg पीढ़ी 42 के लिए जाहिरा तौर पर इसी तरह के प्रोटोकॉल के साथ रिपोर्टों के बीच दिखाई देते हैं के phenotype और दमनकारी समारोह के संबंध में विवादों में योगदान कर सकते। उदाहरण के लिए, एक भी प्रयोगशाला के भीतर, हम ने कहा कि TGF-β और सीरम युक्त RPMI माध्यम में आईएल -2 के साथ प्रेरित iTregs प्रदर्शित कुछ दमनकारी गतिविधि जबकि TGF-β / आईएल -2 प्रेरित iTregs में उत्पन्न कोशिकाओं, 27 को नियंत्रित करने की तुलना परिभाषित, सीरम मुक्त टी सेल संस्कृति के माध्यम से किया था 22 नहीं, घFoxp3 के समान स्तर espite।

इन प्रोटोकॉल के आधार पर भविष्य अनुप्रयोगों आगे साइटोकाइन उत्पादन प्रेरक टी कोशिकाओं और इष्टतम दमनकारी गतिविधि के लिए रूपांतरण के बिना स्थिर Foxp3 अभिव्यक्ति, TSDR demethylation, स्थिर phenotype के साथ एक phenotype प्राप्त करने के लिए Treg प्रेरण शर्तों का अनुकूलन करने के लिए प्रयास करना चाहिए। के लिए दत्तक हस्तांतरण भविष्य है, जो चिकित्सा Treg हस्तांतरण द्वारा स्व-प्रतिरक्षित में और भड़काऊ रोगों के संभावित इलाज के लिए बेहद होनहार है में दृष्टिकोण iTreg प्रेरण प्रोटोकॉल के आगे विकास के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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भोले सीडी 4 <sup>+</sup> टी कोशिकाओं से मानव सीडी 4 <sup>+</sup> Foxp3 <sup>+</sup> प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं (iTregs) एक TGF-β युक्त प्रोटोकॉल का उपयोग की <em>इन विट्रो</em> भेदभाव <em>में</em>
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Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

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