このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。
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方法論記事
TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
制御性T細胞(Treg)は、自己構造に対する免疫反応を抑制し、自己免疫疾患を予防する末梢耐性の不可欠な部分です。Tregsを養子として移植する、または癌のTregを枯渇させるための臨床的アプローチが進行中であり、有望な初期結果が得られています。
自然に発生するTreg（nTreg）の数は非常に限られているため、in vitro誘導Treg））iTreg）を使用して特定のTregの特徴を研究することは有利です。今日まで、制御性T細胞を描写するための最良の特異的タンパク質マーカーは、絶対的に特異的ではないものの、転写因子FOXP3です。末梢誘導性Tregの非冗長な役割を含むTregsの重要性にもかかわらず、iTregを生成するためのプロトコルは、特にヒト細胞について現在議論の余地があります。したがって、このプロトコルでは、さまざまなTreg誘導因子(TGF-βとIL-2のみ、またはレチノイン酸、ラパマイシン、または酪酸との組み合わせ)を並行して使用して、ヒトナイーブT細胞からのヒトCD4+FOXP3+ iTregsのin vitro分化について説明します。また、フローサイトメトリーとqRT-PCRによるこれらの細胞の表現型についても説明します。
これらのプロトコルは、FOXP3およびその他のTregシグネチャー遺伝子の再現性のある発現をもたらし、一般的なFOXP3制御メカニズムの研究だけでなく、特定の因子の影響を描写するためのプロトコル固有の効果の研究を可能にします。iTregは、Treg誘導の分子メカニズムだけでなく、さまざまな表現型の側面を研究するために利用することができます。詳細な分子研究は、比較的大きな細胞数を得ることができることによって促進されます。 >jove_content<これらのプロトコルによって生成されたiTregは、TGF-βとレチノイン酸およびラパマイシンによって誘導されたiTregが優れた抑制活性を示す抑制機能の研究などの機能アッセイにも使用できます。ただし、iTregの抑制能力はnTregとは異なる場合があり、適切な制御の使用が重要です。
概要
CD4 + CD25 + FOXP3 +調節性T細胞（Tregは）他の免疫細胞を抑制し、末梢寛容の重要なメディエーターであり、自己免疫及び過度の炎症1を防止します 。 Tregの重要性は、重度の全身性の自己免疫疾患につながるTregの損失による `master'のTreg転写因子フォークヘッドボックスP3における変異にヒトの疾患immunodysregulationの多発性内分泌腺の腸のX連鎖症候群（IPEX）、（FOXP3）が例示されます早い年齢で致死。しかし、Tregは、彼らはまた、特定の設定2での抗腫瘍免疫を妨げることができますように免疫系における両刃の剣として作用します。 Treg細胞の数および機能の治療的操作は、したがって、多数の臨床研究の対象です。癌では、Tregの枯渇が望ましい可能性があると臨床的アプローチのいくつかの成功は、さらなる研究3を奨励しています。自己免疫および炎症性疾患において、セベにおけるTregの治療効果に加えてRALマウス疾患モデル、-host病（GVHD）4 対移植片を防ぐために、養子のTreg転送の最近の最初の人の試験- 7と1型糖尿病8は非常に有望な結果を示した治療の安全性を評価すること。
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プロトコル
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を新たにカロリンスカ大学病院（スウェーデン）から購入した匿名の健常ドナーのバフィーコートから単離しました。実験のための倫理的許可は、ストックホルムの地域倫理審査委員会（RegionalaetikprövningsnämndenIストックホルム）から入手した、スウェーデン（承認番号：2013/1458から31/1）。
末梢血から1 T細胞の単離
- PBMCの単離
- 15ミリリットル密度遠心分離培地50mlチューブ（軟膜あたり5チューブ）中（例えばフィコールなど）ソリューションを事前横たわっていました。予め室温に暖かいです。
- 180ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（室温）でバフィーコートを埋めます。新鮮な血液を使用する場合は、等量のPBSで血液を希釈します。
- 側への傾斜チューブとチューブ当たりの血液を希釈〜35ミリリットルでゆっくりオーバーレイ密度遠心分離媒体。 medの密度遠心分離のいずれかの混合することなく、非常に慎重に血液を追加します。イウム相と血液層。
- ブレーキなしの室温で1150×gで遠心分離20分。層の混合を防止するための媒体加速度に低いとブレーキなしに、可能であれば遠心機を操作してください。
- 密度遠心分離媒体及びプラズマ相との間のPBMCを含む白色リングを取り出します。 （2ミリリットルプラスチックパスツールピペットで1時間で....
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結果
図1は、実験のスキームを示します。 図2は、磁気的に分離されたナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのための代表的な純度制御染色を示します。
Fのigure 3Aはゲート戦略フローサイトメトリーを示し、 図3Bは 、代表FOXP3及びCD25が示さiTregまたは制御条件下での培養6日目に染色フローサイトメトリーを示しています。 in vitroでの刺激を受けると、ほとんどの細胞は、ラパマイシンの存在下で還元されたCD25をアップレギュレートします。唯一のiTreg誘導因子の添加下で、FOXP3 +細胞の明確な集団はまた、iTregの条件の下でCD25 +細胞内に濃縮されている、明らかになります。 図3Cは、暗いク.......
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ディスカッション
記載されているプロトコルは、人間のナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 + iTregsの堅牢な誘導を可能にします。それは我々が優れたin vitroでの抑制機能22とiTregsの誘導のために、TGF-β、ATRA及びラパマイシンの組み合わせを使用して、最近記載新しいプロトコルが含まれています。他の公表されたプロトコルに比べ、他の利点は、単独で、IL-2の存在下で活性化されたコントロール細胞と一緒に、特定のiTreg誘導因子の効果の直接比較を可能にする、異なるプロトコルによって並列に異なるiTreg集団の誘導であります。記載されているプロトコルは、低ドナー変動とFOXP3の再現可能な誘導を可能にします。このプロトコルでのナイーブCD4 + T細胞を、磁気活性化細胞選別により単離したが、蛍光活性化細胞選別も可能であるしています。このプロトコルにナイーブCD4 + T細胞の予想収量は、典型的には5〜10％の間でありますしかし、強くドナー（年齢）に依存し、赤血球の高い画分が存在する場合にも、下に表示され.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
Nina Nagelは、ビデオ撮影と実験準備中の技術支援に感謝しています。細胞内FOXP3染色プロトコルの支援を提供してくださったEva-Maria Weiss氏と、nTreg分離プロトコルを確立してくださったElisabeth Suri-Payer氏とNina Oberle氏に感謝します。Matilda ErikssonとPeri Nooriは、ラボラトリーマネジメントで認められています。
Funding: A.S.は第7回欧州共同体フレームワークプログラム内のMarie Curie Intra European Fellowship、Dr. Åke Olsson Foundation、KI研究財団の支援を受けました。A.S.とJ.T.はCERIC(Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease)助成金の支援を受け、J.T.はVetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264)の支援を受けました。 Torsten Söderberg Foundation、FP7 STATegra、AFA Insurance、Stockholm County Council。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| オールトランスレチノイン酸 | シグマ アルドリッチ | R2625-50MG | |
| 抗ヒト Foxp3-APC クローン 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| 抗ヒト CD25 マイクロビーズ | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| 抗ヒト CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| 抗ヒト CD28 抗体、LEAF 精製 | バイオレジェンド | 302914 | |
| 抗ヒトCD3抗体 LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |
| anti-human CD45RA, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| 抗ヒトCTLA-4(CD152)、クローンBNI3、mIgG2ak、ブリリアントバイオレット421 | BD Biosciences | 562743 | |
| 抗ヒトIFN-g FITCクローン4S。B3 です。mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| ブレフェルジンA含有溶液:GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| cDNA合成キット:SuperScript VILO(逆転写酵素)cDNA合成キット | Invitrogen | 11754-250 | |
| 密度遠心分離媒体:Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99.7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS、熱不活化 | Invitrogen | 10082-147 | |
| 固定生存率色素、eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14または65-0865-18 | |
| Foxp3染色バッファーセット | eBioscience | 00-5523-00 | 注意:パラホルムアルデヒドが含まれています。抗体と組み合わせたキットでも購入できます。77-5774-40 抗ヒト Foxp3 染色セット APC クローン: 236A/E7 セット |
| GlutaMAX (200 mM L-アラニル-L-グルタミン) | Invitrogen | 35050-061 | |
| ヒトナイーブ CD4 T 細胞単離キット II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| ヒト血清アルブミン 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Streptomyces conglobatus 由来イオノマイシン >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| MACS LSカラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| マウス IgG1 K アイソタイプコントロール APC クローン: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| マウス IgG1 K アイソタイプコントロール FITC 50 μg | eBioscience | 11-4714-81 | |
| マウスIgG2aアイソタイプコントロール、ブリリアントバイオレット421、クローンMOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| パスツールピペットプラスチック、個別包装 | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| ラパマイシン | EMD(メルク) | 553210-100UG | |
| 組換えヒトIL-2、CF | R&D | 202-IL-050/CF | |
| 組換えヒト TGF-β 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| RNA 単離キット: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| RPMI 1640 ミディアム | インビトロジェン | 72400-054 | |
| 酪酸ナトリウム | シグマアルドリッチ | B5887-250MG | |
| T細胞培養液:X-Vivo 15培地、ゲンタマイシン+フェノールLonza | 04-418Q | ||
| TaqMan Gene Expression Assay、FOXP3(ベストカバレッジ) | Applied Biosystems | 4331182; アッセイID: Hs01085834_m1 | 注意: パラホルムアルデヒド |
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; アッセイID: Hs04194366_g1 | 注意:パラホルムアルデヒドが含まれています |
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
参考文献
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the litera....
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再版と許可
