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Immunology and Infection

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 +調節性T細胞（Tregは）他の免疫細胞を抑制し、末梢寛容の重要なメディエーターであり、自己免疫及び過度の炎症1を防止します 。 Tregの重要性は、重度の全身性の自己免疫疾患につながるTregの損失による `master'のTreg転写因子フォークヘッドボックスP3における変異にヒトの疾患immunodysregulationの多発性内分泌腺の腸のX連鎖症候群（IPEX）、（FOXP3）が例示されます早い年齢で致死。しかし、Tregは、彼らはまた、特定の設定2での抗腫瘍免疫を妨げることができますように免疫系における両刃の剣として作用します。 Treg細胞の数および機能の治療的操作は、したがって、多数の臨床研究の対象です。癌では、Tregの枯渇が望ましい可能性があると臨床的アプローチのいくつかの成功は、さらなる研究3を奨励しています。自己免疫および炎症性疾患において、セベにおけるTregの治療効果に加えてRALマウス疾患モデル、-host病（GVHD）4 対移植片を防ぐために、養子のTreg転送の最近の最初の人の試験- 7と1型糖尿病8は非常に有望な結果を示した治療の安全性を評価すること。

11 -当然のTreg（nTregs）を発生することは健康に9を維持する上で非冗長本質的な機能で、胸腺由来tTregsおよび末梢誘導さpTregsを備えます。しかし、nTreg番号は、ナイーブT細胞前駆体12からのin vitroで誘導したTreg（iTregs）の補完的なアプローチを奨励し、限られています。まだiTregsの安定性は、おそらくFOXP3遺伝子座13におけるいわゆるTreg細胞に特異的脱メチル化領域（TSDR）における脱メチル化の欠如のため、懸念のままであり、いくつかの研究は、 生体内でのTregを誘導することを示している14以上の安定しています。

現在までに、FOXP3は、最良のタンパク質メートルのままTregのためのarker人間従来のCD4 + CD25-T細胞は一過性の活性化15,16時FOXP3の中間レベルで発現するので、それは絶対に固有のものではありません。重要な進歩は、FOXP3発現の調節を明らかにしたが、多くは、特にヒト細胞におけるFOXP3の誘導、安定性及び機能に関する発見されていません。 nTregsの違いにもかかわらず、in vitroでの FOXP3誘導さ+ CD4 + T細胞はFoxp3誘発の分子機構を研究するためのモデル系として使用することができ、 中に、より類似しているiTregsの生成を可能にする将来のプロトコルを開発するための出発点として将来的に養子移入戦略の適用可能性が生成されたTregを、 生体内 。

そこに人間iTregsを誘導する全く`金standard'プロトコルはなく、現在のプロトコルは、 生体内でのTreg誘導条件を模倣することに基づいて開発されている：2（IL-2、インターロイキン）およびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）シグナル伝達は、 インビボ 17 における Foxp3誘発のために重要であり、全トランスレチノイン酸（ATRA） -腸管関連樹状細胞によってインビボで産生される-頻繁Foxp3誘発を増強するために使用されます21 - 試験管 18インチ我々は、酪酸22、最近マウスのTreg誘導23,24を増強することが示された腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸を使用して、追加のヒトTregの誘導プロトコールを開発しました。我々はまた、最近、それが促進することが知られている阻害剤、後者はラパマイシン（mTORの）の臨床的に承認された哺乳類の対象となる、TGF-β、ATRAの組み合わせを使用し、22ラパマイシン することにより、in vitroでの優れた抑制機能付きiTregsの世代のための新しいプロトコルを確立しました人間のTreg拡張25,26の間にFOXP3のメンテナンス。

この方法は、再現性の中での説明しますFOXP3の発現のプロトコル固有のパターンや、その他のTreg署名分子を明らかにするために、フローサイトメトリーおよび定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）により、異なる条件のセット、およびその後続の表現型を用いて、ヒトCD4 + FOXP3 + iTregsのインビトロでの生成CD25、CTLA-4、EOS、ならびにIFN-γおよびSATB1 式 22の抑制など。生成された細胞集団は、一般的なFOXP3レギュレータに関するあるいは酪酸またはラパマイシンなどの特定の化合物に特有の効果を研究するか、抑制活性に関する機能アッセイまたは分子的研究のために使用することができます。 Treg細胞の分化を駆動する分子メカニズムのさらなる理解は、具体的Treg細胞の発生と機能に関与する分子を標的とする自己免疫または癌における今後の治療的アプローチのために非常に関連性があります。

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Protocol

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を新たにカロリンスカ大学病院（スウェーデン）から購入した匿名の健常ドナーのバフィーコートから単離しました。実験のための倫理的許可は、ストックホルムの地域倫理審査委員会（RegionalaetikprövningsnämndenIストックホルム）から入手した、スウェーデン（承認番号：2013/1458から31/1）。

末梢血から1 T細胞の単離

  1. PBMCの単離
    1. 15ミリリットル密度遠心分離培地50mlチューブ（軟膜あたり5チューブ）中（例えばフィコールなど）ソリューションを事前横たわっていました。予め室温に暖かいです。
    2. 180ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（室温）でバフィーコートを埋めます。新鮮な血液を使用する場合は、等量のPBSで血液を希釈します。
    3. 側への傾斜チューブとチューブ当たりの血液を希釈〜35ミリリットルでゆっくりオーバーレイ密度遠心分離媒体。 medの密度遠心分離のいずれかの混合することなく、非常に慎重に血液を追加します。イウム相と血液層。
    4. ブレーキなしの室温で1150×gで遠心分離20分。層の混合を防止するための媒体加速度に低いとブレーキなしに、可能であれば遠心機を操作してください。
    5. 密度遠心分離媒体及びプラズマ相との間のPBMCを含む白色リングを取り出します。 （2ミリリットルプラスチックパスツールピペットで1時間で5ミリリットルピペットと2回）新しい50mlチューブに移します。可能なプラズマと密度遠心分離媒体限り少なくしてください。赤い赤血球ペレットに触れないでください。
    6. ウォッシュのPBMC。 50mlチューブ（軟膜あたり4管）へのPBMCを分割します。 PBSで50mlにそれぞれを埋めます。
    7. 室温で10分間遠心分離450×gで。
    8. 削除し、上清を捨て、10で1チューブに細胞をプールミリリットルRPMI / 10％ウシ胎児血清（FCS）培地、よく懸濁します。細胞塊は、40μmのセルストレーナーを介して、株細胞に存在している場合。
    9. 広告のT175細胞培養フラスコ中の細胞を移しますエラン細胞。培地40mlでチューブを洗浄し、細胞（50ミリリットルの合計）と結合します。必要に応じて、（ステップ1.4を参照）、フローサイトメトリー分析のためにアリコートを削除します。通常、CD4 + T細胞は、リンパ球ゲート内の細胞の約30〜40％を含み、ナイーブT細胞は、ドナーに依存して、CD4 + T細胞の約30〜60％を含みます。
    10. 37℃/ 5％CO 2で45〜90分間、フラスコを敷設中で細胞をインキュベートします。このステップは、プラスチック接着によって単球を枯渇されます。これは必須ではありませんが、次の手順でPBMCの量あたりの割合T細胞の収量を増加します。
    11. 細胞を再懸濁し（50ミリリットルでは、媒体のフラスコに含まれている）とよくフラスコの底に細胞層をすすぎます。等しく（50ml×2回）のチューブに細胞を分配する（前のチューブは、同じドナーのために再使用することができます）。 50ミリリットルの新鮮なRPMI / 10％FCS培地でフラスコをすすぎ、そして同じ2チューブに均等に移します。
      注：PBMCをチューブに敷設して4℃で一晩保存してもよいです側は、または理想的には、直接T細胞の単離のために使用されます。
  2. 磁気活性化細胞選別によってnTregの分離
    1. ヒト血清アルブミン、PBS中2mMのEDTA（w / v）の0.5％：分離バッファを準備します。常に4℃でバッファを保持します。あるいは、ヒトアルブミンに、ウシアルブミンを使用します。
    2. 再懸濁し、トリパンブルーの存在下で、自動または手動の細胞カウンターでのPBMCを数える（小さな血小板をカウントされません）。細胞塊は、40μmのセルストレーナーを介して、株細胞を観察している場合。
    3. 室温で10分間、450×gで遠心分離したPBMC。
    4. 再懸濁細胞を10 7のPBMCあたり90μlの単離緩衝液（1 mlのピペットを用いて）、単一細胞懸濁液を得ました。元の50mlチューブ（軟膜あたり2チューブ）で細胞を保管してください。
    5. 、10 7個の細胞当たり2μlのCD25ビーズを加え混合し、4℃で15分間インキュベートします。
    6. 30ミリリットルにPBSで記入してください。 4で10分間、450×gで遠心分離6; C。
    7. LSカラム（軟膜あたり2）を準備します。3ミリリットルの分離緩衝液で平衡化し、フロースルー捨てます。チューブをさらにカラムをリンスするために再使用することができます。
    8. チューブあたり3ミリリットル単離緩衝液中で細胞を再懸濁し（1ミリリットルピペットで）。転送LSカラムに細胞、新鮮な15ミリリットルチューブに流れる集めます。
    9. 2ミリリットルの単離と50ミリリットルチューブをすすぎ、それぞれをバッファリング。列にバッファをすすぐ転送します。
    10. 3ミリリットルの分離と洗浄カラムの2倍は、それぞれをバッファリング。カラムは、新しい液体を追加する前に、滴下停止されるまで、必ず待ってください。ストアは、後の工程のために4℃で流れます。
    11. 磁石から列を削除します。 15ミリリットルチューブに列ごとに3ミリリットル単離緩衝液で溶出2回。
      注：ドナーあたり2カラムからの溶出液を組み合わせることができます。液体中に列を浸漬しないでください。
    12. 新しいLSカラム（軟膜あたり1列）を準備し、平衡化します。列に1.2.11からの溶出液を転送します。廃棄可能流れます。溶出液は盛りを過ぎを持っていた後、カラムを通るdは、チューブを洗浄し、3ミリリットル単離緩衝液でカラムを3回洗います。
      注：第二列は決定的純度を高めるために必要とされます。
    13. 磁石から列を削除します。 3ミリリットルの単離緩衝液を用いて溶出CD25 ++ "nTregs" 2倍。
    14. 4℃で10分間、450×gで遠心分離します。完全に上清を取り除きます。
    15. 15mlのT細胞培養培地を用いて4℃で10分間、450×gで遠心分離し、細胞を洗浄します。完全に上清を取り除きます。
    16. 100 IU / mlのIL-2を、それぞれを補充0.5 mlのT細胞培養培地中で細胞を再懸濁し、。 24ウェルプレートに移す細胞。培地0.5ミリリットル（+ 100 IU / mlのIL-2）でチューブを洗浄し、24ウェルプレートに結合します。
    17. （ステップ1.2.2のように）nTregsをカウントします。収量は通常、軟膜あたり約1-4×10 6のTregです。 T細胞培養培地+ 100 IU / mlのIL-2で1~2×10 6細胞/ mlにTregの密度を調整します。
    18. 使用するまでCO 2、37℃/ 5％のTregをインキュベートします。
    磁気活性化細胞選別によってナイーブCD4 + T細胞の単離
    注：細胞の単離を進めるために、ステップ1.2.8-1.2.10から流れるください。何nTregsが単離されなかった場合あるいは、PBMCから直接進みます。
    1. 50ミリリットルチューブ内のTreg枯渇PBMCのドナーあたり2チューブを兼ね備えています。室温で50 mlにPBSで記入してください。
    2. 室温で5〜10分間、200×gで遠心分離したPBMC。削除し、上清を捨てます。 50ミリリットルのPBSで細胞を再懸濁し。
    3. 二回ステップ1.3.2を繰り返します。
      注：PBS洗浄には、以下の負の単離キットを用いて除去されることはありませんこれは、血小板の除去のために重要です。血小板は、この低速遠心分離で上清中に残ります。血小板枯渇は顕微鏡スライド上の個々のステップで監視することができます。手順は、室温でPBSと遠心分離を用いて実施されなければなりません。
    4. 50ミリリットルのPBSで再懸濁したPBMC。ステップ1.2.2のように細胞をカウントします。
    5. 4℃で10分間、450×gで遠心分離したPBMC。 10 7個の細胞あたり40μlの単離緩衝液（4℃）で上清と再懸濁細胞を捨てます。
    6. 10 7細胞あたりのナイーブCD4 + T細胞ビオチン抗体カクテルIIの10μLを加えます。
    7. 混合し、4℃で10分間インキュベートします。
    8. 4℃で40ミリリットルのPBS（4°C）を添加すること、および10分間、450×gで遠心分離して細胞を洗浄します。 10 7個の細胞あたり80μlの単離緩衝液中で上清と再懸濁細胞を除去します。
    9. 10 7個の細胞当たり抗ビオチンマイクロビーズの20μlを添加します。よく混合し、4℃で15分間インキュベートします。
    10. 冷PBSで50mlに記入し、そして4℃で10分間の遠心分離器450 XG。
    11. 準備LSカラム（3 mlの単離緩衝液で平衡化）。 PBMCを、多くの赤血球が含まれている場合、列の過負荷を回避するために、最大で250×10 6 PBMCを、以下のために1列を使用します。
    12. 上清および再懸濁Cを削除します3ミリリットル単離緩衝液でells。 LSカラムに細胞を移します。 15 mlチューブに、ナイーブCD4 + T細胞を含む、フロースルーを収集します。
    13. 2ミリリットルの分離緩衝液でチューブを洗浄します。カラムに移します。
    14. 3ミリリットル単離緩衝液でカラム3回洗浄します。カラムは、新しい液体を追加する前に、滴下を停止するまで、必ず待ってください。
    15. （ナイーブCD4 + T細胞）と4℃で10分間遠心450 XGを通る流れを取ります。列は廃棄することができます。
    16. 完全に上清を取り除きます。室温で15ミリリットル媒体、遠心分離機450×gで10分間で細胞を洗浄し、完全に上清を除去します。
      注：分離バッファはカルシウムイオンをキレートするEDTAを含有するので、T細胞活性化を阻害します。任意の刺激アッセイの前に、完全に分離緩衝液を除去し、15 mlの培地で細胞を2回洗浄します。
    17. 1mlあたり2~3×10 6細胞にT細胞培養培地中で細胞を再懸濁。適切なフラスコOで細胞を休まRよくインキュベーターで一晩。細胞を刺激アッセイのために直接使用される場合、それらを培地で一回洗浄します。
  3. 純度コントロール染色
    1. 20μlに、それぞれ〜50,000細胞（PBMC; nTregTnaïve）を取ります。
      注：TnaïveとnTregパネルの両方を染色する場合、2つのサンプルそれぞれを取ります。
    2. 例えば、楽器に合わせて2倍に濃縮抗体プレミックスを（PBS中）準備：Tnaïveパネル：CD4-PerCPを1：5; CD45RA-FITC 1時10分、CD45RO-PE 1：5、CD8-eFlour450 1：8。 Tregのパネルについては、CD25-PE、1：10でCD45RO-PEを交換してください。
      注：CD25-マイクロビーズとは異なるエピトープを認識するのみ、特定のCD25抗体は、CD25マイクロビーズを用いて単離しnTregsを染色するために使用することができます。
    3. 20μlの細胞に20μlの抗体プレミックスを追加します。また設フローサイトメトリーのために、各蛍光色素（ 例えば 、陽性細胞を含有したPBMCの試料を使用）、未染色試料のための単一の染色を準備GSと補償。
    4. 暗所で室温で15分間インキュベートします。
    5. 200μlのPBSで各サンプルを入力し、5〜10分間の遠心分離450×gで。
    6. 蛍光活性化セルソーティング（FACS）バッファー（=分離バッファEDTAなし）で細胞を取り、フローサイトメトリーによって分析します。ナイーブCD4 + T細胞の純度は通常> 95％である（ 図2参照）。

2. Tregの誘導文化

  1. 刺激メディアとプレートの調製
    1. 準備し、前加温T細胞培養培地：2mMのL-アラニル-L-グルタミンを補充した無血清造血媒体。
    2. サイトカイン、刺激抗体および化合物ストック濃度を準備します。
      1. IL-2ストック溶液を準備します。40万IU / mlで滅菌濾過し（耐酸性フィルター付き）を100mM酢酸に（167μgの/ mlで使用される多くの活動が1μgのあたり2,400 IUである場合には、プロバイダに確認）。 0.5ミリリットルチューブを結合滅菌低タンパクに一定分量は、パラフィルムで密封し、長期保存のために-80℃でドライアイスや店舗にフリーズまたは-20までの3ヶ月間℃です。
      2. （10μgのバイアル、無担体のために）TGF-β1のストック溶液を準備します、遠心分離TGF-β1粉末（千XG 3分）4 mMのHClを100μlのを追加ストック溶液を調製し（耐酸性フィルターで濾過滅菌） 100μg/ mlので、完全に溶解することができます。渦。 0.5ミリリットルチューブを結合滅菌低タンパクに各アリコート5μlを、パラフィルムで密封までの6ヶ月間-80℃でドライアイスや店舗で凍結します。
      3. ATRAストック溶液を準備しますDMSO中の20mg / mlの（66.6ミリモル）で粉末を溶かします。最大1年間-80℃で、光から保護DMSOと店舗アリコートでさらに希釈により10mMのストック溶液を準備します。 ATRAは、光、熱、空気に敏感です。
      4. ラパマイシンストック溶液を準備しますアリコート中1mg / mlの（1.11 mM）のDMSO中で、店舗を-80℃で1年まで。
      5. 滅菌超純H 2 Oおよび滅菌フィルターで0.908 M（0.1 mg / mlで）ストック：酪酸ナトリウムストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。
    3. 表1のように T細胞培養培地中で4倍に濃縮プレミックス（ウェルあたり50μl）を準備します。
    4. 前の日に、抗CD3抗体でコートプレート。コートは、65μlの/ウェル、PBS中5μg/ mlの抗CD3抗体で96 Uウェルプレートからのウェルの数を希望します。ホイルでプレートをラップし、4℃で一晩インキュベートします。
      注：96ウェルプレートのマージン井戸を使用しないでください。大きなウェルを使用することができるが、U字形のウェルは、実験を横切る面積当たり同じ細胞数の使用を容易にします。より多くの細胞が必要な場合は、培養後、ウェルの必要量をプールします。通常、膨張の4~6日後に、2ウェルの各サンプルは、フローサイトメトリー分析及びRNA分析のために十分です。
      1. メッキの日に、すぐにメッキする前に、抗削除ウェルから-CD3ソリューション。 200μL/ウェルのPBSでウェルを埋めます。 PBSを削除してください。 200μL/ウェルのPBSで洗浄を繰り返します。完全にPBSを削除し、直ちにプレートを使用しています。
    5. プレートを準備します（マージン井戸を使用しないでください）：
      1. 各ウェル、4倍の抗CD28 / IL-2プレミックスの50μlを添加するために（すべてのiTregs用）、50μlの4倍のTGF-β1のプレミックスまたは50μlのT細胞培養物（「刺激されていない」細胞を除いて、T細胞培養培地を追加） 「刺激のみ」モック制御、50μlの4倍ATRA、ATRA /ラパマイシンまたは酪酸プレミックス（適用）または媒体のための媒体
      2. 200μlのPBSで、マージンウェルを含め、すべての空のウェルを埋めます。 37℃/ 5％CO 2でのプレ暖かいプレート。
  2. めっきのためのナイーブT細胞を準備します
    1. 休止細胞た後、15ミリリットルチューブに移す、チューブに予め温めたT細胞培養培地とプールでフラスコ/井戸を洗い流します。 T細胞培養培地で15ミリリットルにチューブを埋めます。</李>
    2. 室温で10分間、450×gで遠心分離細胞。
    3. 培地を除去し、2.2から2.6×10 6 / mlの密度に新鮮な、予め温めておいたT細胞培養培地中の細胞を取ります。ステップ1.2.2のように細胞を計数し、必要に応じて濃度を調整。
    4. （2.1参照）、50μlの細胞/ウェル（110,000-130,000細胞/ウェル）を調製し、刺激プレートに細胞を加えます。各ウェルは現在、全量200μlを含める必要があります。
    5. 光からATRAを保護するためにアルミホイルでプレートを包み、所望の期間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。
  3. Tregの誘導文化を監視
    1. 光学顕微鏡（40倍の倍率）によりTreg細胞培養を監視します。約2日目から3に、増殖細胞の小さなクラスターは、後の時点で大きなクラスターにマージする、見えるようになるはずです。ラパマイシンで増殖した培養物は、一般的にあまり成長します。また、 図3を参照してください。
    2. 所望の時点で、RNA Eのサンプルを取りますxtractionまたは表現型フローサイトメトリー（下記参照）。細胞増殖と後の時点では、1各ウェルそうでないRNAのための1×10 5 -1×10 6個の細胞それぞれおよびフローサイトメトリーのために3×10 5 -1×10 6個の細胞を取り、十分です。
  4. FOXP3の安定性を評価します
    1. 2.1および2.2に記載したように、以前22,27記載のようにiTreg表現型の安定性を評価するために、抗CD3および抗CD28再刺激なしで、またはのいずれかでT細胞培養培地中でさらにT細胞培養培地で2回iTregsを洗い、そして培養iTregs 。 FOXP3の安定性に及ぼす影響を研究するために、このような50 IU / mlのIL-2のように、サイトカインを追加します。
    2. 所望の時点で、22,28に記載されているように（下記参照）表現型フローサイトメトリー、及びTSDRのメチル化分析、RNA抽出のためのサンプルを取ります。

定量RT-PCRによるiTregsの3表現型分析

  1. の準備サンプル
    1. 所望の時点で、サンプルあたり1×10 5×10 1〜6の細胞を、RNA抽出のために取ります。 RNaseフリー1.5mlチューブに移し、細胞を、そして5分間、500×gで遠心。
    2. 必要に応じて、上清の一部を除去し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）または類似の分析のために凍結します。細胞から完全に残りの上清を取り除きます。 RNA抽出に直接進むか、2週間まで-80℃-20℃のドライアイスや店舗に細胞ペレットを凍結します。
    3. 標準的なプロトコルに従ってRNAを抽出し、FOXP3と（例えばRPL13Aなど）ハウスキーピング遺伝子のための定量RT-PCRを行います。また、他のTregシグネチャー遺伝子の発現（例えば`のTreg up'遺伝子IL2RA、CTLA4、IKZF4、および`のTreg down'遺伝子IFNG、SATB1）を測定。

フローサイトメトリーによる4表現型分析

注：このプロトコルは、染色のために最適化されています3×10 5 -1×10 6個の細胞で96Uウェルプレートフォーマットでる。ウェル当たり少ないセルがある場合は、以下に説明するように、いくつかの井戸やプールで始まります。

  1. セル再刺激（オプション）
    1. 細胞内サイトカイン染色が望まれる場合、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）のパルス細胞/タンパク質輸送の阻害剤の存在下でイオノマイシン。
      注：この手順は、前述したiTreg培養でFoxp3発現には影響しませんが、他のマーカーが変更されることがあります - 例えば、CD4をダウンレギュレートされます。
    2. 100、イオノマイシン（株式を5μg/μl）を1：1ブレフェルジン原液：T細胞培養培地中に10倍ブレフェルジンA / PMA /イオノマイシンのプレミックス（ウェルあたり20μl）を準備し1300、PMA（株12.35μgの/μlで、前-dilute 1：1235）1：予め希釈株式の100。
    3. 染色の前に4時間、1の最終濃度を得るために、ウェルあたり20μlのブレフェルジンA / PMA /イオノマイシン10倍ミックスを追加：1,000ブレフェルジンA、0.5μM（375 ngの/ ml）のイオノマイシン、10ng / mLのPMA。
    4. 37℃/ 5％CO 2で4時間インキュベート
  2. 表面染色
    注：ここで提案パネルが提案です。他のパネルは、目的と機器設定の抗原に応じて使用することができます。
    1. 氷上でPBSを冷却します。 （0.5％ヒト血清アルブミン、HSAを含むPBS）FACS緩衝液を用意し、氷上で冷却します。 BSAまたはFBSはHSAの代わりに使用することができます。
    2. プレート-再染色プレート内の細胞：細胞を再懸濁しピペットでと（後染色手順における波及を防ぐために）各ウェルの周りにも無料のものを残して、新しい96Uウェルプレートに細胞を移します。所望の細胞数よりも少ないが、元のウェル中に存在している場合は、よく染色に複数の井戸を再懸濁する前に、上清の一部を削除し、プール。
    3. 遠心機のプレートを室温で10分間、400×gで。
    4. 上清を取り除きます。 、廃棄ボックスに上清を注ぐ逆さまプレートを残しますダウンし、すぐに（プレートを後戻りせずに）吸収紙に一度のプレートをタップします。その後、すぐにプレートを元に戻します。渦プレートは、液体の残りの中に細胞を再懸濁します。
    5. 再懸濁：25μlの表面染色プレミックス（FACS緩衝液で5 CD25-PE 1：20、CD4-PerCPを1）を追加します。
      注：また、それぞれの抗原陽性の細胞を含むサンプルで使用される蛍光色素のそれぞれのための単一の染色を含みます。および染色されていないサンプルが含まれます。これらは、機器の補償のセットアップのために必要とされるであろう。また、補償ビーズを使用しています。
    6. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    7. 4℃で10分間、200μlのPBS、遠心プレート400 XGを追加し、ステップ4.2.4で説明したように、上清を除去します。渦プレート。
    8. 二回ステップ4.2.7を繰り返します。
  3. 生存率染色
    注：固定/透過処理した後に死んだ細胞が十分で除外することはできないので、生存率染色は、不可欠ですFSC / SSCおよび非特異的シグナルを生じさせる可能性があります。固定可能な生存色素を使用しなければなりません。
    1. 再懸濁細胞130μlの生存能力染色プレミックス（固定可能な生存性色素eFlour780 PBS中1：1400）で、すぐには、マルチチャンネルピペットを用いて細胞を懸濁します。
      注：また、数日間培養例えば、非刺激T細胞、死細胞を含む生存性色素のための単一の染色を含めたり、製造者の指示などによって熱を加えることによって細胞を死滅させます。これらは、補償のために必要とされるであろう。
    2. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    3. 4℃で10分間、400×gで遠心分離プレート。ステップ4.2.4のように上清を取り除きます。渦プレート。
    4. 200μlのFACS緩衝液で満たします。手順を繰り返し4.3.3。
    5. 200μlのPBSで記入してください。手順を繰り返し4.3.3。
  4. FOXP3染色緩衝液セットと細胞内染色
    1. 各ウェルについては、準備：150μlの修正/パーマバッファ（修/パーマ濃塩酸を希釈entrate 1：希釈剤で4）。 850μlの1×透過化バッファー（超純H 2 Oで10倍の透過化バッファ1:10に希釈します）。
    2. 150μlの修正/パーマバッファに、再懸濁細胞をボルテックスした後、すぐにピペットで再懸濁します。すぐに細胞塊の固定を避けるために再懸濁することが重要です。
      注意：固定バッファは、パラホルムアルデヒドが含まれており、取り扱い、適切に廃棄されるべきです。
    3. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    4. 100μlの冷PBSを追加します。 4℃で10分間、850×gで遠心分離します。
      注：このステップで以降の遠心分離速度は細胞の喪失を回避するために増加されます。固定後、細胞が見えなくなると、ステップ4.2.4に記載したように、遠心分離、細胞の損失を最小限にするために終了した直後に注意が、上清を除去するために取られるべきです。
    5. ステップ4.2.4で説明したように上清を取り除きます。渦プレート。
      注：染色はこの段階で一時停止することができます。にこの場合は、200μlのPBSで2回細胞を洗浄します。その後、250μlのPBS中に取り、光から保護し、4℃で保存してください。細胞は透過化を進め、その後、数日間保存することができます。直接透過化を続けしかし、最適な結果が達成されます。
    6. ボルテックスした後、200μlの透過化バッファを追加します。 4℃で10分間、850×gで遠心分離します。ステップ4.2.4で説明したように上清を取り除きます。渦プレート。
    7. 再懸濁する200μlの透過化バッファーを追加します。
      注：ここでは、サンプルは細胞内染色し、アイソタイプコントロールサンプルに分割することができます（各サンプルの半分を奪います）。細胞数が制限されている場合、プールされたアイソタイプサンプルは（離れサンプルプールの10〜20μLを取る）を調製することができます。また、試料は、蛍光マイナスワン（FMO）を制御するために取ることができます。
    8. 4℃で10分間、850×gで遠心分離します。ステップ4.2.4で説明したように上清を取り除きます。渦プレート。
    9. 再懸濁ペレット（予混合）44μlの透過化緩衝液+ 1μlの正常マウス血清は、非特異的結合をブロックします。
      注：次のステップで使用される抗体は、マウスアイソタイプである場合、これが適用されます。例えば、ラット由来するような他の抗体は、使用される場合、（ 例えば、ラット血清）をブロックするための適切な血清を含みます。
    10. 暗所で15分間、4℃でインキュベートします。
    11. 抗体を追加します。
      注：特定のロットのための抗体濃度をお問い合わせください。それぞれの蛍光色素を用いた表面抗原に対する抗体（ 例えば 、CD4）とステップ4.2で行われていない場合、また、補償のための陽性細胞を含むサンプルで使用される蛍光色素のそれぞれのための単一の染色が含まれます。
      1. （単一染色、染色されていないサンプルを、アイソタイプコントロールサンプルとFMOのコントロールを除いて）サンプルに15μlの抗体プレミックスを追加します：サンプルあたりのプレミックス：0.7μL（0.35μgの）抗インターフェロンγ（IFN-γ）-FITCを（再刺激後に該当する場合）、2.3μL（0.115μgの）CTLA-4ブリリアントバイオレット421、2μL（0.05μgの）抗FOXP3-APC、10μlのPBS。
      2. 、コントロールサンプルをアイソタイプ4.4.11.1に用いられる抗体のためのような抗体の同じ量を用いて、15μlのアイソタイプ抗体プレミックスを追加するには、次のサンプルあたりのプレミックス：0.7μL（0.35μgの）マウスのIgG1 KアイソタイプコントロールをFITC（該当する場合）、0.58 μL（0.115μgの）マウスIgG2a-BV421アイソタイプ、0.5μL（0.05μgの）マウスのIgG1 KアイソタイプコントロールAPC、13.2μlのPBS。
      3. FMOのコントロールのために、PBSで各1抗体を置き換え、4.4.11.1のように抗体を追加します。
    12. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    13. 200μlの透過化バッファーを追加します。遠心分離機は、ステップ4.4.8のように上清と渦を削除します。一回繰り返します。
    14. （ボリューム使用される機器に応じて）およびフローサイトメーター上で、理想的にはすぐに、取得の冷FACS緩衝液中で細胞を再懸濁し。

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Representative Results

図1は、実験のスキームを示します。 図2は、磁気的に分離されたナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのための代表的な純度制御染色を示します。

Fのigure 3Aはゲート戦略フローサイトメトリーを示し、 図3Bは 、代表FOXP3及びCD25が示さiTregまたは制御条件下での培養6日目に染色フローサイトメトリーを示しています。 in vitroでの刺激を受けると、ほとんどの細胞は、ラパマイシンの存在下で還元されたCD25をアップレギュレートします。唯一のiTreg誘導因子の添加下で、FOXP3 +細胞の明確な集団はまた、iTregの条件の下でCD25 +細胞内に濃縮されている、明らかになります。 図3Cは、暗いクラスタとして見られる増殖細胞と顕微鏡でiTreg培養物の表現型の外観を示しています。各I Tregの条件は、細胞増殖の特異的かつ再現可能なパターンを示している：これらの培養条件下では、TGF-βは、わずかに増殖を増加させ、ATRAはさらなる増殖を増加させます。同時に、ラパマイシンによる増殖の阻害が著しく減少クラスタサイズによって明らかです。増殖力の微視的な外観はまた、全細胞数に相当する（データは含まれません）。

定量RT-PCRの図4のディスプレイ代表的な結果は、iTreg（およびコントロール）におけるFOXP3 mRNA誘導の異なる時点での文化の分析します。 FOXP3タンパク質としては、FOXP3 mRNA発現はラパマイシン処置iTregsが他iTregsに比べて相対的に低いレベルを有すると、刺激された細胞をコントロールと比較して、すべてのiTregsが高いです。 nTregsにおけるFOXP3 mRNAはiTregsに比べて高くなっています。

エス/ ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
図1：実験iTreg誘導のためのスキーム、nTreg分離、およびTregの分析。ヒトナイーブCD4 + T細胞をバフィーコートから単離し、抗CD3および抗CD28抗体を加えた100 U / mlのIL-2のための6日まで、いずれかの非存在下での（ `モック対照細胞を無血清培地中で刺激しました'）または異なるTregの誘導因子の存在を示すように（ `iTreg'）。 nTregsを単離し、並行してアッセイされています。表現型分析をフローサイトメトリー及び定量RT-PCRによって行うことができます。シュミット、A. らから変更。 2016年22。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2：集団を開始する細胞の純度。ナイーブ人間CD 4 + T細胞は、ナイーブCD4 + T細胞単離キットII、人間によって単離しました。上のパネル：ナイーブCD4 + T細胞の純度、CD4、CD45RAおよびCD45ROに基づいて、94〜98％であり、30以上の代表的なドナーのための純度は（ `Tnaïve'）に示されています。 ex vivoでのTreg（ `nTreg'）CD25マイクロビーズの制限された量を用いて単離し、iTreg実験の陽性対照として使用しました。 CD25とCD4に基づいて、代表的なドナーのnTreg純度が示されています。下のパネル：細胞内FOXP3染色は、（ 図3のように行い、生CD4 +細胞上に予めゲーティング）は、上部パネルと同一のドナーからの細胞を用いて、それぞれナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのために示されています。シュミット、A. らから変更。 2016年22。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ntent「FO：キープtogether.withinページ= "1"> 図3
図3：iTregsとnTregsの表現型の外観。ヒトナイーブCD4 + T細胞を、示された条件下で、無血清培地中で培養しました。 T細胞を抗CD3および抗CD28抗体を加えた100 U / mlのIL-2（ `Stim.'）で刺激しました。示された場合には、TGF-β1（ `TGF'）、ラパマイシン（` Rapa'）、オールトランスレチノイン酸（ `ATRA'）または酪酸を添加しました。 nTregs（ex vivoで単離された末梢血CD25 ++細胞）は非刺激（ `unstim.'）左及び陽性対照として使用しました。刺激されていないナイーブT細胞を陰性対照として使用しました。 （A）培養の6日目に、細胞を抗CD25及び抗CD4含む表面抗体、次いで固定可能生存性色素で染色し、続いて、固定/透過処理し、抗FOXP3および抗CTLA-4またはアイソタイプにより細胞内染色で染色しました続き ROL抗体。取得及び補償は、サイトメーターシアンADPフローに対して実行し、データをFlowJoソフトソフトウェアで分析しました。ゲーティング戦略は、赤い矢印で示され、図示の例では、TGF + ATRAで誘導iTregのサンプルです。 （B）細胞は（A）のように染色し、異なるプロトコルにより誘発される対照T細胞とiTregsにおけるFOXP3及びCD25の発現を示します。擬似カラープロットは、（A）のようにCD4 +細胞を生き、一人のドナー、一重に事前にゲーティングのための代表的なFOXP3及びCD25染色を示します。アイソタイプ例はiTreg（STIM。+ TGF + ATRA）のサンプルのために示されています。 4日間培養した細胞の個々の96U-プレートウェルの（C）代表顕微鏡画像（40X倍率）。細胞のダーククラスターは、増殖細胞を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ntent「FO：キープtogether.withinページ= "1"> 図4
図4：iTregの分化のための異なるプロトコルの使用時にFOXP3 mRNA発現。 iTregsを示す条件下で、図3のように生成し、所定の時点で、細胞試料を採取し、RNAを抽出しました。刺激されていないナイーブT細胞、および非刺激nTregsは、0サンプルは、定量RT-PCRによって分析した日に採取し、そしてFOXP3 mRNAの発現は、各サンプルについてRPL13A発現に対して正規化しました。刺激されていないナイーブT細胞におけるFOXP3 mRNA発現を1に設定し、FOXP3 mRNAの変化倍率を算出しました。示した平均値とPCRの範囲の代表的なドナーのための複製ウェルです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

記載されているプロトコルは、人間のナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 + iTregsの堅牢な誘導を可能にします。それは我々が優れたin vitroでの抑制機能22とiTregsの誘導のために、TGF-β、ATRA及びラパマイシンの組み合わせを使用して、最近記載新しいプロトコルが含まれています。他の公表されたプロトコルに比べ、他の利点は、単独で、IL-2の存在下で活性化されたコントロール細胞と一緒に、特定のiTreg誘導因子の効果の直接比較を可能にする、異なるプロトコルによって並列に異なるiTreg集団の誘導であります。記載されているプロトコルは、低ドナー変動とFOXP3の再現可能な誘導を可能にします。このプロトコルでのナイーブCD4 + T細胞を、磁気活性化細胞選別により単離したが、蛍光活性化細胞選別も可能であるしています。このプロトコルにナイーブCD4 + T細胞の予想収量は、典型的には5〜10％の間でありますしかし、強くドナー（年齢）に依存し、赤血球の高い画分が存在する場合にも、下に表示されます。推定値が必要な場合は、PBMCを単球枯渇工程の間（ステップ1.4参照）を染色することができます。典型的には、ナイーブCD4 + T細胞の収量は、PBMCの染色における「リンパ球ゲートのパーセンテージナイーブCD4 + T細胞」の約半分です。このプロトコルは、CD25-高（nTreg）のセル29を得るために、CD25ビーズの限られた量を使用しています。しかし、これらは、純粋のTregはないが、これらは単に正の対照として使用するためのTregに富んでいます。純粋のTregが必要な場合は、他のキットは、（例えばCD4濃縮およびCD127-枯渇と組み合わせるように）使用されるべきであるか、あるいは、CD25 +細胞は、10 7個の細胞当たり8μlのCD25ビーズで事前に富むと染色し、蛍光活性化細胞によってソート厳しいCD4 + CD25 ++ゲーティングで並べ替え。また、そのようなCD127の除外などの他のマーカーの包含は、考慮すべきです。

_contentは"> FOXP3を考慮することが重要であるiTregsは、特定の局面を研究するために使用することができるが。Tregのアイデンティティ30を付与するのに十分必要ではなく、例えば、FOXP3調節は、それがiTregsがnTregs異なることに留意することが重要ですnTregsとiTregsとの差をnTregとiTregトランスクリプトームの一部のみの重なりが例示されるいくつかの側面で。それは比較のために、全てのアッセイでiTregsに平行に（理想的には同じドナー由来）培養nTregsすることが重要である。中で測定しましたマウスiTregs 31。FOXP3に加えて他のTregシグネチャー遺伝子は、この理由のために測定されるべきであり、ヒト細胞における活性化誘導FOXP3発現からの識別を確実にするために、例えば、iTregsはCD25の高い発現を表示する必要があり、CTLA-4およびEOS比較します活性化T細胞に以前に公開されたように、IFN-γおよびSATB1の発現は、ここに記載されているプロトコルによって誘発されるnTregsとiTregsに低くあるべきである一方で13におけるFOXP3遺伝子座にTSDR領域のメチル化に対応iTregsで安定FOXP3発現の欠如、です。また、ゲノムワイドスケールで、それはネズミiTregsにおけるDNAメチル化とヒストン修飾のエピジェネティックなパターンがnTregs 30で見つかったパターンを反映していないことを説明しました。我々は以前nTregsとは対照的に、ここに記載されたプロトコルによって誘導されiTregsは、TSDR脱メチル化を示さなかったことを説明しました。したがって、iTregsは再刺激したときにFOXP3を失ったが、IL-2の再刺激22なしの存在下でさらに培養Foxp3発現を維持しました。興味深いことに、M2マクロファージ上清を用いて、代替プロトコルによって誘発されるiTregsはTSDR脱メチル化の欠如およびFoxp3誘発27のためのTGF-βであることの原因にもかかわらず、強化されたFOXP3安定性を示しました。

iTregの変更テン-11転座（TET）メチルジオキシゲナーゼ酵素に影響を与える（例えばビタミンCや硫化水素など）の化合物を添加することによってプロトコルを-inducing、ごく最近32記載されているように- 34を 、DNAメチル化に影響を与えることによってFOXP3の安定化を追加することができます。また、刺激強度およびタイミングは、FOXP3発現および安定性35に影響を与えます。これらの線に沿って、代わりに、プレートに結合した抗体のビーズ結合CD3 / CD28抗体の使用は、TSDR脱メチル化36の独立したにもかかわらず、マウスiTreg インビボ抑制機能および安定性を増加させることが示されました。変動の潜在的な供給源として考慮される必要がある別の要因も、ウシ供給源からヒト細胞と100％の交差反応性であるTGF-βを含む未定義の因子を含有する血清の使用です。また、IL-2の供給源と活性が大幅にFOXP3誘導の結果に影響を与えることができます。

重要なFTregのeatureは、このプロトコルで生成iTregsに続いてテストする必要がありますそれらの抑制能力、です。 iTregsと抑制アッセイは些細なことではないことに留意すべきであるとiTregsの抑制能力に関する文献は議論の余地があります。このようなカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）の希釈などのフローサイトメトリーの読み出しに基づいてin vitroでの増殖アッセイは、最も一般的に使用されると、41 -人間のTregの抑制機能を評価するためのいくつかの方法およびプロトコルは、他の場所22,37を発表されています。洗浄および抑制アッセイで使用する前にiTregsを置くことが重要であり、それはiTregsは、nTregsとは対照的に、アネルギー性ではないかもしれないが、抑制アッセイの間に自分自身を増殖することを考慮する必要があります。我々は、CTLA-4の発現、IL-2は消耗品を通るように（それが `mock'を使用することが非常に重要な非特異的抑制の程度を識別するために、制御サプレッサー細胞としてT細胞を刺激した検討します活性化T細胞によるptionおよび培養の異常増殖）FOXP3 + Treg細胞特異的効果とは無関係であり、この制御の頻繁な欠如は文献にいくつかの論争に寄与することができます。このコントロールを使用して、我々は唯一のTGF-β/ ATRA /ラパ誘発性iTregsがインビトロ 22 で抑制活性を示すことを定義しました。したがって、我々は（FOXP3 +細胞のない最高の端数はあるが）そのに関する抑制活性を締結、TGF-β/ ATRA /ラパはiTregsを誘導する記載されているプロトコルの要因の最適な組み合わせです。それにもかかわらず、in vitroでの抑制活性は、必ずしもin vivoでの抑制活性を反映していない、と確かに我々は、これらのプロトコルによって生成された人間iTregsは少なくとも22を試験した条件の下での異種移植片対 -host疾患モデルでは抑制されなかったと判断しました。これはTSDR脱メチル化22の欠如と一致して、再刺激の際にiTregsで失われた不安定Foxp3発現に関連している可能性があり

これはiTregの機能の側面に応じて（FOXP3 +細胞の割合が高い、優れた抑制活性、FOXP3安定性）は、特定の研究課題のために最も重要であり、異なるプロトコルは、それが困難な一般的に「ベストを定義するには、レンダリング、これらの質問を勉強するのが最も適切ですTregの誘導のための」プロトコル。また、いくつかの上記の微妙な実験の違いが結果に影響を与えることができ、さらにはiTreg世代42のため、明らかに同様のプロトコルを使用したレポートの間に表示されるTGF-βによって誘導されるiTregsの表現型と抑制機能に関して論争に寄与することができます。例えば、一つでも実験室の中、我々はで生成TGF-β/ IL-2誘導iTregsながら、血清を含むRPMI培地中でTGF-βおよびIL-2で誘導iTregsは、いくつかの抑制活性は、細胞27を制御するために比較表示することが観察され定義された、無血清のT細胞培養培地D、22なかったですFOXP3の同様のレベルをespite。

これらのプロトコルに基づいて将来のアプリケーションは、さらに、サイトカイン産生エフェクターT細胞と最適な抑制活性に変換することなく、安定したFoxp3発現、TSDR脱メチル化、安定した表現型と表現型を達成するためのTregの誘導条件を最適化するために努力すべきです。 iTreg誘導プロトコルのさらなる開発は、養子移入のために有用である可能性のTreg転送による治療は、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療の可能性のために非常に有望である、将来的に近づきます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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免疫号118、調節性T細胞、Treg細胞、CD4 + T細胞を、磁気細胞分離、
TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 <sup>+</sup> T細胞からのヒトCD4 <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup>誘導された調節性T細胞（iTregs）の<em>インビトロ</em>分化<em>における</em>
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Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

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