Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro differentiering af humane CD4 + Foxp3 + Induced Regulatory T-celler (iTregs) fra naive CD4 + T-celler under anvendelse et TGF-β-holdige protokol

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver den reproducerbare generation og fænotypebestemmelse af humane inducerede regulatoriske T-celler (iTregs) fra naive CD4 + -T-celler in vitro. Forskellige protokoller for Foxp3 induktion muliggøre undersøgelsen af ​​særlige iTreg fænotyper opnået med respektive protokoller.

Introduction

CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatoriske T-celler (tregs) undertrykker andre immunceller og er kritiske formidlere af perifer tolerance, forhindrer autoimmunitet og overdreven inflammation 1. Betydningen af ​​tregs er eksemplificeret ved den humane sygdom immunodysregulation polyendocrinopathy enteropati X-bundet syndrom (IPEX), hvori tab af tregs skyldes mutationer i den `master' Treg transkriptionsfaktor forkhead kasse P3 (Foxp3) fører til alvorlig systemisk autoimmun sygdom, dødbringende i en tidlig alder. Men tregs fungere som en tveægget sværd i immunsystemet som de også kan hæmme anti-tumor immunitet i visse indstillinger 2. Terapeutisk manipulation af treg nummer og funktion er derfor underlagt talrige kliniske undersøgelser. I kræft, kan udtømning af tregs være ønskeligt og vis succes af kliniske tilgange tilskynder til yderligere forskning 3. Ved autoimmune og inflammatoriske sygdomme, foruden terapeutiske virkninger af tregs i several mus sygdomsmodeller, de seneste første i-mand forsøg med adoptiv treg overførsel for at forhindre graft- versus -host sygdom (GvHD) 4 - 7 og til at vurdere sikkerheden i behandling af type 1-diabetes 8 viste meget lovende resultater.

Naturligt forekommende tregs (nTregs) omfatter thymiske-afledte tTregs og perifert inducerede pTregs, med ikke-redundante væsentlige funktioner i at bevare sundhed 9-11. Men nTreg tal er begrænset, tilskynde til komplementære tilgang inducerende tregs (iTregs) in vitro fra naive T-celle forstadier 12. Stadig stabilitet iTregs, formentlig på grund af manglende demethylering i den såkaldte Treg-specifik demethyleret region (TSDR) i Foxp3 gen locus 13, er fortsat en bekymring, og flere undersøgelser viser, at in vivo-induceret tregs er mere stabile 14.

Til dato fortsat Foxp3 den bedste protein marker for tregs men det er ikke absolut specifik Eftersom humane konventionelle CD4 + CD25- T-celler transient udtrykker mellemliggende niveauer af foxp3 ved aktivering 15,16. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med at belyse reguleringen af ​​foxp3 udtryk, stadig meget at blive opdaget med hensyn til induktion, stabilitet og funktion af foxp3 især i humane celler. Trods forskelle i forhold til nTregs, in vitro inducerede foxp3 + CD4 + T-celler kan anvendes som et modelsystem til at studere molekylære mekanismer for Foxp3 induktion og som et udgangspunkt for at udvikle protokoller i fremtiden, som tillader generering af iTregs der er mere ligner i vivo genereret tregs, som kunne være gældende for adoptiv overførsel strategier i fremtiden.

Der er ingen `guld standard' protokol til at fremkalde menneskelige iTregs, og nuværende protokoller er blevet udviklet på baggrund af efterligne Treg-inducerende betingelser in vivo: interleukin 2 (IL-2) Og transformerende vækstfaktor β (TGF-β) signalering er afgørende for Foxp3 induktion in vivo 17, og all-trans-retinsyre (ATRA) - som produceres in vivo ved tarmassocieret dendritceller - bruges ofte til at forbedre Foxp3 induktion in vitro 18 -. 21 Vi har udviklet yderligere menneskelige Treg-inducerende protokoller under anvendelse butyrat 22, en gut mikrobiota-afledt kortkædede fedtsyre, der for nylig blev vist at forøge murine Treg induktion 23,24. Vi har også for nylig etableret en ny protokol til generation af iTregs med overlegen undertrykkende funktion in vitro ved hjælp af en kombination af TGF-β, ATRA og rapamycin 22, hvor sidstnævnte er en klinisk godkendt pattedyr mål for rapamycin (mTOR-hæmmer), der er kendt for at fremme foxp3 vedligeholdelse under human treg ekspansion 25,26.

Denne metode beskriver reproducerbar ivitro dannelse af humane CD4 + Foxp3 + iTregs ud fra en række forskellige betingelser, og deres efterfølgende fænotypebestemmelse ved flowcytometri og kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) for at afsløre protokol-specifikke mønstre af ekspression af foxp3 og andre Treg signatur molekyler sådanne som CD25, CTLA-4, EOS, samt undertrykkelse af IFN-γ og SATB1 ekspression 22. De genererede cellepopulationer kan anvendes til funktionelle assays vedrørende suppressive aktivitet, eller for molekylære undersøgelser, enten vedrørende generelle Foxp3 regulatorer eller studere virkninger er specifikke for visse forbindelser, såsom butyrat eller rapamycin. Yderligere forståelse af molekylære mekanismer kørsel treg differentiering er yderst relevant for fremtidige terapeutiske tilgange i autoimmunitet eller kræft til specifikt retter sig mod molekyler involveret i treg generation og funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) blev frisk isoleret fra anonymiserede rask donor fibrinlag købt fra Karolinska University Hospital, Sverige. Etisk tilladelse til forsøgene blev opnået fra det regionale Etisk Review Board i Stockholm (regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Sverige (godkendelsesnummer: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. T Cell Isolation fra perifert blod

  1. PBMC Isolation
    1. Pre-lay 15 ml densitetscentrifugering (såsom Ficoll) opløsning i 50 ml rør (5 rør pr buffy coat). Pre-varme til stuetemperatur.
    2. Fyld op buffy coat med phosphatbufret saltvand (PBS) (stuetemperatur) til 180 ml. Hvis der anvendes frisk blod fortyndes blod med samme volumen PBS.
    3. Tilt rør til siden og langsomt overlay densitetscentrifugering medium med ~ 35 ml fortyndet blod per rør. Tilføj blodet meget nøje, uden nogen blanding af densitetscentrifugering withium fase og blod lag.
    4. Centrifuger 20 min ved 1.150 xg ved stuetemperatur uden bremse. Betjen centrifugen uden bremse og om muligt med lav til middel acceleration for at forhindre sammenblanding af lagene.
    5. Tag den hvide ring indeholdende PBMC'er mellem densitetscentrifugering medium og plasmaet fase. Overførsel til en ny 50 ml rør (1 gang med 5 ml pipette og 2 gange med 2 ml plast-Pasteur pipette). Tag så lidt som muligt plasma og tæthed centrifugering medium. Rør ikke den røde erythrocyt pellet.
    6. Wash PBMC'er. Split PBMC'erne i 50 ml rør (4 rør pr buffy coat). Fyld hver til 50 ml med PBS.
    7. Centrifuger 450 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    8. Fjern og kassér supernatanten, pool cellerne i 1 rør med 10 ml RPMI / 10% føtalt kalveserum (FCS) medium og resuspenderes godt. Hvis celleklumper er til stede, stamme celler gennem en 40 um cellefilter.
    9. Overfør celler i T175 cellekultur kolbe til adHerent celler. Skyl rør med 40 ml medium og kombinere med celler (50 ml i alt). Hvis det er nødvendigt, fjerne en portion til flowcytometri analyse (se trin 1.4). Normalt CD4 + T-celler omfatter omkring 30-40% af cellerne i lymfocytporten, og naive T-celler omfatter ca. 30 til 60% af CD4 + -T-celler afhængigt af donor.
    10. Cellerne inkuberes i æglæggende kolbe i 45 til 90 min ved 37 ° C / 5% CO2. Dette skridt vil udtømme monocytter af plast vedhæftning. Det er ikke obligatorisk, men vil øge procentdelen T udbytte celle pr mængde PBMC'er i de følgende trin.
    11. Resuspender celler (i 50 ml medium anbragt i kolben) og skyl cellelag på bunden af ​​kolben godt. Fordel celler ligeligt i to 50 ml rør (de tidligere rør kan genanvendes til samme donor). Skyl kolbe med 50 ml frisk RPMI / 10% FCS medium, og overføre lige ind i de samme 2 rør.
      BEMÆRK: PBMC'er kan opbevares natten over ved 4 ° C med rør liggende påden side, eller ideelt, direkte anvendes til T-celle-isolation.
  2. nTreg Isolation ved magnetisk cellesortering
    1. Forbered isolation buffer: 0,5% (vægt / volumen) humant serumalbumin og 2 mM EDTA i PBS. Hold altid buffer ved 4 ° C. Alternativt til humant albumin, bruge bovint albumin.
    2. Resuspender og tælle PBMC'er med en automatisk eller manuel celletæller i tilstedeværelse af trypanblåt (tæller ikke små blodplader). Hvis der observeres celleklumper, stamme celler gennem en 40 um celle si.
    3. Centrifugér PBMC'er ved 450 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Resuspender celler (med 1 ml pipette) i 90 pi isolation buffer per 10 7 PBMC'er til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Holde cellerne i de oprindelige 50 ml rør (2 rør pr buffy coat).
    5. Tilsæt 2 pi CD25 perler per 10 7 celler, blandes, og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
    6. Fyld med PBS til 30 ml. Centrifuger ved 450 xg i 10 min ved 46; C.
    7. Forbered LS søjler (2 per buffy coat): ligevægt med 3 ml isolation puffer, og kassér flyde igennem. Rør kan genanvendes til skylning yderligere kolonner.
    8. Resuspender celler i 3 ml isolation buffer pr rør (med 1 ml pipette). Overfør celler til LS-søjle, og indsamle strømning gennem i friske 15 ml rør.
    9. Skyl de 50 ml rør med 2 ml Isolation buffer hver. Overførsel skyllepuffer til søjlerne.
    10. Vaskesøjle 2x med 3 ml Isolation buffer hver. Vent altid, indtil kolonnen stoppet dryp, før du tilføjer en ny væske. Store strømme igennem ved 4 ° C i senere trin.
    11. Fjern kolonne fra magneten. Eluer 2x med 3 ml isolation puffer pr kolonne i 15 ml rør.
      BEMÆRK: Eluatet fra 2 kolonner pr donor kan kombineres. Dyp ikke søjlen i væsken.
    12. Forberede og ligevægt nye LS søjler (1 kolonne pr buffy coat). Overfør eluatet fra 1.2.11 til søjlen. Flow gennem kan kasseres. Efter eluat har passed gennem kolonnen, skylles rør og vask kolonne 3x med 3 ml isolation puffer.
      BEMÆRK: Den anden kolonne er afgørende nødvendig for at øge renheden.
    13. Fjern kolonne fra magneten. Elute CD25 ++ "nTregs" 2x med 3 ml Isolation puffer.
    14. Centrifuger ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten fuldstændigt.
    15. Vask cellerne med 15 ml T-celle dyrkningsmedium, centrifugeres ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten fuldstændigt.
    16. Resuspender celler i 0,5 ml T-celle dyrkningsmedium suppleret med 100 IU / ml IL-2, hver. Overfør celler til 24-brønds plade. Skyl rør med 0,5 ml medium (+ 100 IU / ml IL-2) og kombinere til 24-brønds plade.
    17. Count nTregs (som i trin 1.2.2). Udbyttet er sædvanligvis ca. 1-4 x 10 6 tregs pr buffy coat. Juster densitet på tregs til 1-2 x 10 6 celler / ml med T-celle dyrkningsmedium + 100 IU / ml IL-2.
    18. Inkuber tregs ved 37 ° C / 5% CO2 indtil anvendelse.
    Naive CD4 + T-celle Isolation ved magnetisk cellesortering
    BEMÆRK: Tag gennemstrømning fra trin 1.2.8-1.2.10 at gå videre med celle isolation. Alternativt, hvis der ikke nTregs blev isoleret, fortsætte direkte fra PBMC'er.
    1. Kombiner 2 rør pr donor af treg-udtømte PBMC'er i 50 ml rør. Fyld med PBS til 50 ml ved stuetemperatur.
    2. Centrifugér PBMC'er ved 200 xg i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Fjern og kassér supernatanten. Resuspender celler i 50 ml PBS.
    3. Gentag trin 1.3.2 to gange.
      BEMÆRK: PBS vasker er afgørende for fjernelse af blodplader, som ikke vil blive fjernet med følgende negative isolation kit. Blodplader bliver i supernatanten ved denne lave hastighed centrifugering. Trombocyt udtynding kan overvåges i de enkelte trin på en mikroskopisk dias. De trin skal udføres med PBS og centrifugeringer ved stuetemperatur.
    4. Resuspender PBMC'er i 50 ml PBS. Tæl celler som i trin 1.2.2.
    5. Centrifugér PBMC'er ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres og resuspender cellerne i 40 pi Isolation puffer (4 ° C) per 10 7 celler.
    6. Tilsæt 10 pi af naive CD4 + T-celle Biotin-Antibody Cocktail II pr 10 7 celler.
    7. Bland og inkuber i 10 min ved 4 ° C.
    8. Vask cellerne ved tilsætning af 40 ml PBS (4 ° C), og der centrifugeres ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 80 pi isolation buffer per 10 7 celler.
    9. Tilsæt 20 pi anti-biotin mikroperler pr 10 7 celler. Bland godt, og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
    10. Fyld til 50 ml med kold PBS og centrifuger 450 xg i 10 min ved 4 ° C.
    11. Forbered LS søjler (ligevægt med 3 ml isolation puffer). For at undgå overbelastning af kolonnen, bruge en kolonne til maksimalt 250 x 10 6 PBMC'er, eller mindre, hvis PBMC'er indeholder mange røde blodlegemer.
    12. Fjern supernatanten og resuspender calen i 3 ml isolation puffer. Overfør celler til LS-søjle. Indsamle gennemstrømningen, som indeholder de naive CD4 + -T-celler, i 15 ml rør.
    13. Skyl rør med 2 ml isolation buffer. Overførsel til søjlen.
    14. Vaskesøjle 3x med 3 ml isolation puffer. Vent altid, indtil kolonnen stopper dryp, før du tilføjer en ny væske.
    15. Tag strømmen gennem (naive CD4 + T-celler) og centrifuge 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Kolonner kan kasseres.
    16. Fjern supernatanten fuldstændigt. Vask cellerne med 15 ml medium, centrifuge 450 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og fjerne supernatanten fuldstændigt.
      BEMÆRK: Isolation puffer indeholder EDTA, som chelaterer calciumioner og forringer således T-celleaktivering. Før nogen stimulering analyser, fjerne isolation bufferen helt og vask cellerne to gange med 15 ml medium.
    17. Resuspender celler i T-celle dyrkningsmedium til 2-3 x 10 6 celler pr. Rest celler i passende kolbe or godt over natten i inkubatoren. Hvis der anvendes celler direkte til stimulering analyser, vaske dem en gang mere med medium.
  3. Renhed Kontrol Farvning
    1. Tag ~ 50.000 celler (Tnaïve; nTreg; PBMC'er) hver, i 20 pi.
      BEMÆRK: Hvis både Tnaïve og nTreg panel skal farves, tage 2 prøver hver.
    2. Forbered 2x koncentreret antistof premix (i PBS) som er relevant for instrumentet, for eksempel: Tnaïve panel: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. For treg panel, erstatte CD45RO-PE med CD25-PE, 01:10.
      BEMÆRK: Kun bestemte CD25 antistoffer, der genkender forskellige epitoper end CD25-mikroperler, kan anvendes til at farve nTregs isoleret med CD25 mikroperler.
    3. Tilsæt 20 pi antistof premix til 20 pi celler. Forberede Også enkelte farvninger for hver fluorokrom (ved hjælp af en prøve indeholdende positive celler, f.eks PBMC'er) og en ufarvet prøve, for flowcytometri settings og kompensation.
    4. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    5. Fyld hver prøve med 200 pi PBS og centrifuger 450 xg i 5-10 min.
    6. Optager celler i fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) buffer (= isolation puffer uden EDTA) og analysere ved flowcytometri. Renheden af naive CD4 + -T-celler er normalt> 95% (se figur 2).

2. treg Induktion Kultur

  1. Udarbejdelse af Stimulation Medier og Plader
    1. Klargør og for varm T-celle dyrkningsmedium: serumfrit hæmatopoietisk medium suppleret med 2 mM L-alanyl-L-glutamin.
    2. Forbered cytokin, stimulering antistof og sammensatte stamkoncentrationer.
      1. Forbered IL-2 stamopløsning: 400.000 IU / ml i sterilfiltreret (med syrefast filter) 100 mM eddikesyre (167 mg / ml, hvis aktiviteten af ​​det anvendte parti er 2400 IE per 1 pg; bekræfte med udbyder). Alikvot til steriliseret lav proteinbinding 0,5 ml rør, forsegle med Parafilm, fryse på tøris og opbevares ved -80 ° C til langsigtet opbevaring eller -20 ° C i op til 3 måneder.
      2. Forbered TGF-β1 stamopløsning (for 10 ug hætteglas, bærerfri): Centrifuge TGF-β1 pulver (1.000 xg 3 min), tilsættes 100 pi 4 mM HCI (sterilfiltreret med syrefast filter) til fremstilling af stamopløsning med 100 mg / ml, lad det opløses fuldstændigt; vortex. Alikvote 5 pi hver til steriliseret lav proteinbinding 0,5 ml rør, forsegle med Parafilm, fryse på tøris og opbevares ved -80 ° C i op til 6 måneder.
      3. Forbered ATRA stamopløsning: Opløs pulver i 20 mg / ml (66,6 mM) i DMSO. Forbered stamopløsning af 10 mM ved yderligere fortynding i DMSO og gemme alikvoter, beskyttet mod lys, ved -80 ° C i op til 1 år. ATRA er følsomme over for lys, varme og luft.
      4. Forbered rapamycin stamopløsning: 1 mg / ml (1.11 mM) i DMSO, opbevares i alikvoter ved -80 ° C iop til 1 år.
      5. Forbered natriumbutyrat stamopløsning: 0,908 M (0,1 mg / ml) stamopløsning i sterilt ultrarent H2O og sterilt filter. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    3. Forbered 4x koncentrerede forblandinger (50 pi per brønd) i T-celle dyrkningsmedium som i tabel 1.
    4. På den foregående dag, pels plader med anti-CD3-antistof. Coat ønskede antal brønde fra 96 ​​U-brønds plade med 5 ug / ml anti-CD3-antistof i PBS, 65 pi / brønd. Wrap plade med folie og inkuberes natten over ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Brug ikke margin brønde på plader med 96 brønde. Større brønde kan anvendes, men U-formede brønde lettere at anvende de samme celletal per område på tværs eksperimenter. Hvis der er behov for flere celler, pool den nødvendige mængde af brønde efter kultur. Normalt, efter 4-6 dages ekspansion, 2 brønde hver prøve er tilstrækkelige til flowcytometri analyse og RNA-analyse.
      1. På dagen for plating, kort før plating, fjerne anti-CD3 Opløsning fra brønde. Fyld brøndene med 200 pl / brønd PBS. Fjern PBS. Gentag vask med 200 pl / brønd PBS. Fjern PBS fuldstændigt og bruge plader straks.
    5. Forbered plader (brug ikke margin brønde):
      1. For hver brønd, tilsættes 50 pi 4x anti-CD28 / IL-2 forblanding (undtagen "ustimulerede" celler, tilføje T-celle dyrkningsmedium), 50 pi 4x TGF-β1 premix (for alle iTregs) eller 50 pi T cellekultur medium for "kun stimulation" mock kontrol, 50 pi 4x ATRA, ATRA / rapamycin eller butyrat premix (hvis relevant) eller medium
      2. Udfyld alle tomme brønde, herunder margin brønde, med 200 pi PBS. Pre-varme plader ved 37 ° C / 5% CO2.
  2. Forbered naive T-celler til Plating
    1. Efter hvilende celler, overførsel til 15 ml rør, skylles kolbe / brønde med forvarmet T-celle dyrkningsmedium og pool til rør. Fyld røret til 15 ml med T-celle-dyrkningsmediet. </ Li>
    2. Centrifuger cellerne ved 450 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
    3. Fjern medium og optager cellerne i frisk, forvarmet T-celle dyrkningsmedium til en tæthed på 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Tæl celler som i trin 1.2.2 og justere tætheden, hvis nødvendigt.
    4. Tilføj celler til tilberedte stimulation plader (se 2.1), 50 pi celler / brønd (110,000-130,000 celler / brønd). Hver bør vel nu indeholde et samlet volumen på 200 pi.
    5. Wrap plader i aluminiumfolie for at beskytte ATRA mod lys; inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2 i ønskede tidsrum.
  3. Overvåg treg Induktion Kultur
    1. Overvåg Treg kulturer ved lysmikroskopi (40X forstørrelse). Fra omkring dag 2 til 3, bør små klynger af prolifererende celler bliver synlige, som fusionerer i større klynger på senere tidspunkter. Kulturer dyrket med rapamycin generelt vokse mindre. Se også figur 3.
    2. På ønskede tidspunkter, tage prøver til RNA extraction eller flowcytometri fænotypebestemmelse (se nedenfor). For senere tidspunkter med celledeling, en godt hver er tilstrækkeligt, ellers tage 1 x 10 5 -1 x 10 6 celler hver til RNA og 3 x 10 5 -1 x 10 6 celler til flowcytometri.
  4. Vurdering Foxp3 Stabilitet
    1. For vurdering af stabiliteten af iTreg fænotype som beskrevet tidligere 22,27, vask iTregs to gange med T-celle dyrkningsmedium, og kultur iTregs yderligere i T-celle-dyrkningsmediet, enten uden eller med anti-CD3 og anti-CD28-restimulering som beskrevet i 2.1 og 2.2 . Tilføj cytokiner, såsom 50 IU / ml IL-2, for at studere deres indflydelse på Foxp3 stabilitet.
    2. På ønskede tidspunkter, udtage prøver til RNA ekstraktion, flowcytometri fænotypebestemmelse (se nedenfor), og TSDR methylering analyse som beskrevet 22,28.

3. Fænotypisk analyse af iTregs ved QRT-PCR

  1. Fremstilling afPrøver
    1. Ved ønskede tidspunkter, tage 1 x 10 5 til 1 x 10 6 celler pr prøve til RNA-ekstraktion. Overfør celler til en RNase-fri 1,5 ml rør, og der centrifugeres ved 500 xg i 5 min.
    2. Hvis det er nødvendigt, fjerne en del af supernatanten og fryse til enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller lignende analyse. Fjern resterende supernatant fuldstændigt fra celler. Fortsætte direkte til RNA-ekstraktion eller fryse cellepellet på tøris og opbevares ved -20 ° C til -80 ° C i op til 2 uger.
    3. Uddrag RNA og udføre QRT-PCR for Foxp3 og en housekeeping-gen (såsom RPL13A) ifølge standardprotokoller. Desuden måle ekspressionen af andre Treg signatur gener (fx `treg up' gener IL2RA, CTLA4, IKZF4 og` Treg down' gener IFNg, SATB1).

4. Fænotypisk analyse af flowcytometri

BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til plettening i 96U brønde format med 3 x 10 5 -1 x 10 6 celler. Hvis der er færre celler per brønd, starte med flere brønde og pool som beskrevet nedenfor.

  1. Cell Restimulering (valgfri)
    1. Hvis der ønskes farvning for intracellulære cytokiner, puls celler med phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) / ionomycin i nærvær af et protein transport inhibitor.
      BEMÆRK: Denne procedure påvirker ikke Foxp3 udtryk i ovenfor beskrevne iTreg kulturer, men andre markører kan ændre sig - for eksempel CD4 nedreguleres.
    2. Forbered 10x Brefeldin A / PMA / ionomycin præmix (20 pi per brønd) i T-celle dyrkningsmedium: Brefeldin En stamopløsning 1: 100, ionomycin (lager 5 pg / pl) 1: 1.300, PMA (lager 12,35 pg / pl, præ -dilute 1: 1235) 1: 100 forfortyndet lager.
    3. 4 timer før farvning, tilsættes 20 pi Brefeldin A / PMA / ionomycin 10x mix per brønd for at opnå endelige koncentrationer på 1: 1.000 Brefeldin A, 0,5 μM (375 ng / ml) ionomycin 10 ng / ml PMA.
    4. Der inkuberes i 4 timer ved 37 ° C / 5% CO2
  2. Surface Farvning
    BEMÆRK: Panelet foreslog her er et forslag; andre paneler kan anvendes afhængigt af antigener af interesse og instrument setup.
    1. Cool PBS på is. Forbered FACS buffer (PBS med 0,5% human serum albumin, HSA) og afkøles på is. BSA eller FBS kan anvendes som et alternativ til HSA.
    2. Re-plade celler i farvning plade: Resuspender celler med en pipette og overføre cellerne til en ny brønd plade 96U, efterlader man godt fri omkring hver brønd (for at forhindre afsmitning i senere farvning procedure). Hvis mindre end ønsket celletal er til stede i den oprindelige brønd, fjernes en del af supernatanten før resuspension, og puljen flere brønde i en farvnings- godt.
    3. Centrifuge plade 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Fjern supernatanten. Hæld ud supernatant til affald boks, forlader pladen på hovedetned og det samme (uden at vende tilbage pladen) trykke pladen én gang på absorberende papir. Derefter straks vende pladen. Vortex plade for at resuspendere cellerne i resterende væske.
    5. 25 pi overfladefarvning premix (CD25-PE 1:20 CD4-PerCP 1: 5 i FACS-buffer) og resuspender.
      BEMÆRK: omfatter også enkelte farvninger for hver af de anvendte fluorokromer med prøver, der indeholder positive celler til den respektive antigen; og indeholder et ufarvet prøve. Disse vil være behov for instrument kompensation setup. Alternativt kan du bruge kompensation perler.
    6. Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørke.
    7. Tilsæt 200 pi PBS, centrifugeres plade 400 xg i 10 min ved 4 ° C og fjern supernatanten som beskrevet i trin 4.2.4. Vortex plade.
    8. Gentag trin 4.2.7 to gange.
  3. levedygtighed Farvning
    BEMÆRK: Levedygtighed farvning er uundværlig, da efter fiksering / permeabilisering døde celler kan ikke i tilstrækkelig grad udelukkes afFSC / SSC og kan give anledning til uspecifikke signaler. En fixable viabilitetsfarvestoffet skal anvendes.
    1. Resuspender celler i 130 pi levedygtighed pletten premix (fixable levedygtighed farvestof-eFlour780 1: 1.400 i PBS) og straks resuspender celler med multikanal pipette.
      BEMÆRK: omfatter også en enkelt farvning for levedygtighed farvestof indeholder døde celler, fx stimulerede T-celler dyrket i flere dage eller dræbe celler ved at anvende varme som ved producentens anvisninger. Disse vil være behov for kompensation.
    2. Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørke.
    3. Centrifuge plade ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten som i trin 4.2.4. Vortex plade.
    4. Fyld med 200 pi FACS-buffer. Gentag trin 4.3.3.
    5. Fyld med 200 pi PBS. Gentag trin 4.3.3.
  4. Intracellulær farvning med Foxp3 Staining Buffer Set
    1. For hver brønd, forberede: 150 pi Fix / Perm buffer (fortyndet Fix / Perm koncentrate 1: 4 med fortyndingsmiddel); 850 pi 1x permeabilisering buffer (fortyndet 10x permeabilisering buffer 1:10 med ultrarent H2O).
    2. Efter hvirvelbehandling, resuspender cellerne i 150 pi Fix / Perm buffer og umiddelbart resuspender med pipette. Det er vigtigt at straks resuspendere at undgå fiksering af celleklumper.
      Advarsel: Fiksering buffer indeholder paraformaldehyd og bør håndteres og kasseres korrekt.
    3. Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørke.
    4. Tilsæt 100 pi kold PBS. Centrifuger ved 850 xg i 10 min ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Fra dette trin fremefter centrifugeringen hastigheden forøges for at undgå tab af celler. Efter fiksering celler bliver usynlig og der skal sørges for at fjerne supernatanter som beskrevet i trin 4.2.4 og umiddelbart efter centrifugering er færdig for at minimere tab af celler.
    5. Fjern supernatanten som beskrevet i trin 4.2.4. Vortex plade.
      BEMÆRK: farvning kan sættes på pause på dette trin; idette tilfælde vaskes cellerne to gange med 200 pi PBS; derefter tage op i 250 pi PBS og opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys. Cellerne kan opbevares i nogle dage, hvorefter der fortsættes med permeabilisering. optimale resultater er imidlertid opnået, når direkte videre til permeabilisering.
    6. Efter hvirvelbehandling tilsættes 200 pi Permeabilisering buffer. Centrifuger ved 850 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten som beskrevet i trin 4.2.4. Vortex plade.
    7. Tilføj 200 pi Permeabilisering buffer at resuspendere.
      BEMÆRK: Her kan prøverne opdeles i intracellulær farvning og isotypekontrol prøve (take away halvdelen af ​​hver prøve). Hvis celle tal er begrænsende, kan en samlet isotype prøve være forberedt (tage væk 10-20 pi af hver prøve og pool). Også, kan tages prøver til Fluorescens-Minus-One (FMO) kontrol.
    8. Centrifuger ved 850 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten som beskrevet i trin 4.2.4. Vortex plade.
    9. Resuspender pellet i44 pi Permeabilisering buffer plus 1 pi normalt museserum (færdigblandet) for at blokere uspecifik binding.
      BEMÆRK: Dette gælder, hvis antistoffer anvendt i det følgende trin er af murin isotype. Hvis der anvendes andre antistoffer, såsom afledt fra rotte, indeholde passende serum til blokering (f.eks rotteserum).
    10. Der inkuberes ved 4 ° C i 15 minutter i mørke.
    11. Tilføj antistoffer:
      BEMÆRK: Spørg de antistof koncentrationer for de specifikke Lots. Hvis det ikke gøres i trin 4.2 med antistoffer mod overfladeantigener (f.eks CD4) med de respektive fluorochromer, omfatter ligeledes enkelte farvninger for hver af de anvendte fluorochromer med prøver, der indeholder positive celler til erstatning.
      1. Tilsæt 15 pi antistof premix til prøver (undtagen til enkelte farvninger, ufarvede prøver, prøver isotypekontrol og FMO kontroller): Forblandet per prøve: 0,7 pi (0,35 ug) anti-Interferon gamma (IFN-γ) FITC (hvis relevant efter restimulering ),2.3 pi (0,115 ug) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 pi (0,05 ug) Anti-Foxp3-APC, 10 pi PBS.
      2. At isotypekontrol prøver, tilsættes 15 ul isotype antistof premix, med de samme mængder af antistof som for de anvendte antistoffer i 4.4.11.1: Forblandet per prøve: 0,7 pi (0,35 ug) mus IgG1 K isotypekontrol FITC (hvis relevant), 0,58 pi (0,115 ug) muse-IgG2a-BV421 isotype, 0,5 pi (0,05 ug) muse IgG1 K isotypekontrol APC, 13,2 pi PBS.
      3. For FMO kontroller, tilføje antistoffer som i 4.4.11.1, der erstatter ét antistof hver med PBS.
    12. Der inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter i mørke.
    13. Der tilsættes 200 pi Permeabilisering buffer. Centrifuge, fjern supernatanten og vortex som i trin 4.4.8. Gentag en gang.
    14. Resuspender cellerne i kold FACS-buffer (volumen efter det anvendte instrument) og erhverve, ideelt straks, på flowcytometeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser et arrangement med forsøgsopstillingen. Figur 2 viser et repræsentativt renhed kontrol farvning for magnetisk isolerede naive CD4 + T-celler og nTregs.

F igur 3A viser flowcytometri gating-strategi og Figur 3B viser repræsentative Foxp3 og CD25 flowcytometri farvninger på dag 6 i kultur under de angivne iTreg eller kontrol betingelser. Efter in vitro-stimulering, de fleste celler opregulerer CD25, som reduceres i nærvær af rapamycin. Kun under tilsætning af iTreg-inducerende faktorer, en klar population af foxp3 + -celler viser sig, som også er beriget i CD25 + celler under iTreg betingelser. Figur 3C viser den fænotypiske udseende iTreg kulturer i mikroskopet med prolifererende celler ses som mørke klynger. hver i Treg tilstand viser en specifik og reproducerbar mønster af celleproliferation: Under disse dyrkningsbetingelser, TGF-β forøger proliferation lidt, og ATRA øger proliferation yderligere. Samtidig, inhibering af proliferation med rapamycin fremgår af den stærkt reducerede klynge størrelse. Den mikroskopiske udseende spredning styrke svarer også til de samlede celletal (data ikke inkluderet).

Figur 4 viser repræsentative resultater af QRT-PCR-analyser af foxp3 mRNA-induktion i iTreg (og kontrol) kulturer på forskellige tidspunkter. Som for foxp3 protein, Foxp3 mRNA-ekspression er højere i alle iTregs sammenlignet med kontrolgruppen stimulerede celler, med rapamycin-behandlede iTregs har relativt lavt niveau sammenlignet med andre iTregs. Foxp3 mRNA i nTregs er højere end i iTregs.

es / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Figur 1: Eksperimentel ordning for iTreg induktion, nTreg isolation, og Treg analyse. Humane naive CD4 + T-celler blev isoleret fra fibrinlag og stimuleret i serumfrit medium med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer plus 100 U / ml IL-2 i op til 6 dage, enten i fravær ( `mock kontrolceller ') eller nærvær af forskellige Treg-inducerende faktorer ( `iTreg') som angivet. nTregs isoleres og analyseres parallelt. Fænotypisk analyse kan udføres ved flowcytometri og QRT-PCR. Modificeret fra Schmidt, A. et al. 2016 22. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Cell renhed af udgangsmaterialer populationer. Naïve menneskelige CD 4 + T-celler blev isoleret ved den naive CD4 T Cell Isolation Kit II, humant. Øvre panel: naive CD4 + T-celle renhed, baseret på CD4, CD45RA og CD45RO, på 94 til 98% og renheden for en repræsentativ donor af mere end 30 er vist ( `Tnaïve'). Ex vivo tregs ( `nTreg') blev isoleret ved anvendelse af begrænsede mængder af CD25 mikroperler og anvendes som en positiv kontrol for iTreg eksperimenter. nTreg renhed af en repræsentativ donor, baseret på CD25 og CD4, er vist. Nedre panel: Intracellulær Foxp3 farvning (udført som i figur 3 og præ-gatet på levende CD4 + -celler) er vist for naive CD4 + T-celler og nTregs henholdsvis anvendelse af celler fra den samme donor som i det øverste panel. Modificeret fra Schmidt, A. et al. 2016 22. Klik her for at se en større version af dette tal.

ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 3
Figur 3: Fænotypisk udseende iTregs og nTregs. Humane naive CD4 + T-celler blev dyrket i serumfrit medium under de angivne betingelser. T-celler blev stimuleret med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer plus 100 U / ml IL-2 ( `Stim.'). Hvor det er angivet, blev TGF-β1 ( `TGF'), rapamycin (` Rapa'), all-trans-retinsyre ( `ATRA') eller butyrat tilsat. nTregs (ex vivo isolerede perifere blod CD25 ++ celler) blev efterladt ustimuleret ( `unstim.') og anvendt som positiv kontrol. Ustimulerede naive T-celler blev anvendt som negativ kontrol. (A) På dag 6 af dyrkning blev cellerne farvet med overfladevandet antistoffer, herunder anti-CD25 og anti-CD4, derefter farvet med fixable viabilitetsfarvestoffet og efterfølgende faste / permeabiliserede og farvet intracellulært med anti-Foxp3 og anti-CTLA-4 eller isotype cont rol antistoffer. Erhvervelse og erstatning blev udført på et Cyan ADP flowcytometer og dataene blev analyseret med FlowJo software. Gating strategi er angivet med de røde pile, og det viste eksempel er en iTreg prøve induceret med TGF + ATRA. (B) Celler blev farvet som i (A), og Foxp3 og CD25-ekspression i kontrol T-celler og iTregs induceret af forskellige protokoller er vist. De pseudofarve plots viser repræsentative Foxp3 og CD25 farvninger for én donor, præ-gatet på singlet, lever CD4 + -celler som i (A). Isotypen eksempel er vist for en iTreg (STIM. + TGF + ATRA) prøve. (C) Repræsentative mikroskopi billeder (40X forstørrelse) af individuelle 96U-plade brønde af celler dyrket i 4 dage. Mørke klynger af celler repræsenterer prolifererende celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 4
Figur 4: Foxp3 mRNA-ekspression ved anvendelse af forskellige protokoller for iTreg differentiering. iTregs blev genereret som i figur 3 under de angivne betingelser, og på de givne tidspunkter blev celleprøver udtaget og RNA blev ekstraheret. Ustimulerede naive T-celler, og ikke-stimulerede nTregs, blev udtaget på dag 0. Prøverne blev analyseret ved QRT-PCR, og Foxp3 mRNA-ekspression blev normaliseret til RPL13A ekspression for hver prøve. Foxp3 mRNA-ekspression i ikke-stimulerede naive T-celler blev indstillet til 1, og fold skift af foxp3 mRNA blev beregnet. Vist er middelværdier og rækken af ​​PCR replikere brønde for en repræsentativ donor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne protokol muliggør robust induktion af humane CD4 + Foxp3 + iTregs fra humane naive CD4 + T-celler. Det omfatter en ny protokol, som vi beskrev for nylig, anvendelse af en kombination af TGF-β, ATRA og rapamycin, til induktion af iTregs med overlegen in vitro undertrykkende funktion 22. Sammenlignet med andre publicerede protokoller, en anden fordel er induktionen af ​​forskellige iTreg populationer parallelt af forskellige protokoller, som muliggør direkte sammenligning af virkningerne af visse iTreg-inducerende faktorer, sammen med kontrolceller, der aktiveres i nærværelse af IL-2 alene . De beskrevne protokoller muliggøre reproducerbar induktion af foxp3 med lav donor variation. Naive CD4 + T-celler i denne protokol isoleres ved magnetisk cellesortering, men fluorescens-aktiveret cellesortering er også muligt. Det forventede afkast af naive CD4 + T-celler med denne protokol er typisk mellem 5-10%, men stærkt afhænger af donor (alder) og synes også lavere, når høje fraktioner af erythrocytter er til stede. Hvis der er behov et skøn, kan PBMC'er farves (se trin 1.4) under monocytudtømning trin. Typisk udbyttet af naive CD4 + -T-celler er omkring halvdelen af de "procentvise naive CD4 + T-celler af lymfocyt gate" i PBMC pletten. Denne protokol bruger begrænsede mængder af CD25-perler til at opnå CD25-høj (nTreg) celler 29. Men disse er ikke rene tregs, men disse er blot beriget med tregs at blive brugt som positiv kontrol. Hvis der er behov rene tregs bør andre kits anvendes (såsom kombineret med CD4 berigelse og CD127-udtømning) eller alternativt, CD25 + celler præ-beriget med 8 pi CD25 perler pr 10 7 celler og farvede og sorteret efter fluorescens-aktiveret celle sortering med strenge CD4 + CD25 ++ gating. Også inddragelse af andre markører, såsom CD127 udelukkelse, bør overvejes.

_content "> Det er vigtigt at overveje, at foxp3 er nødvendig, men ikke tilstrækkelig til at give treg identitet 30. Mens iTregs kan bruges til at studere visse aspekter af for eksempel foxp3 regulering, er det imidlertid vigtigt at bemærke, at iTregs adskiller sig fra nTregs i flere aspekter. det er derfor afgørende at kultur nTregs (ideelt stammer fra den samme donor) sideløbende med iTregs i alle analyser til sammenligning. forskellen mellem nTregs og iTregs er eksemplificeret ved kun delvise overlapning mellem nTreg og iTreg transkriptom som målt i murine iTregs 31. Andre treg signatur gener ud over foxp3 bør måles af denne grund, og for at sikre diskrimination fra aktiverings-induceret foxp3 ekspression i humane celler. for eksempel bør iTregs vise højere ekspression af CD25, CTLA-4 og EOS sammenlignet til aktiverede T-celler, mens ekspression af IFN-γ og SATB1 bør være lav i nTregs og iTregs induceret af protokollerne, der beskrives her, som tidligere offentliggjort 13. Også på en genom-plan, blev det beskrevet, at epigenetiske mønstre af DNA methylering og histon modifikationer i murine iTregs ikke afspejler de mønstre der findes i nTregs 30. Vi har tidligere beskrevet, at iTregs induceret af den her beskrevne protokoller, i modsætning til nTregs, udviste ikke TSDR demethylering. Følgelig iTregs mistede foxp3 når restimuleret, men opretholdt Foxp3 udtryk, når yderligere dyrket i nærværelse af IL-2 og uden restimulering 22. Interessant iTregs induceret af en alternativ protokol ved at anvende M2 makrofag supernatanter de viste forøget foxp3 stabilitet trods manglende TSDR demethylering og TGF-β er forårsagende for Foxp3 induktion 27.

Ændring af iTreginducerende protokoller ved tilsætning af forbindelser (såsom vitamin C eller hydrogensulfid), der påvirker Ti-elleve Translokation (TET) methylcytosin dioxygenase enzymer, som beskrevet for nylig 32 - 34, kan tilføje stabilisere Foxp3 ved at påvirke DNA-methylering. Også stimulering styrke og timing har indflydelse på Foxp3 ekspression og stabilitet 35. Langs disse linjer, blev brugen af perle-koblede CD3 / CD28-antistoffer i stedet for plade-bundne antistoffer vist sig at øge murine iTreg in vivo undertrykkende funktion og stabilitet omend uafhængig af TSDR demethylering 36. En anden faktor, der skal overvejes som en potentiel kilde til variation er anvendelse af serum, der indeholder udefinerede faktorer, herunder TGF-β som selv fra bovin kilde er 100% krydsreaktiv med humane celler. Desuden kan kilden og aktivitet af IL-2 drastisk indvirkning på resultaterne af Foxp3 induktion.

En vigtig feature af tregs er deres undertrykkende evne, som skal efterfølgende testet med iTregs genereret i denne protokol. Det skal bemærkes, at suppression assays med iTregs er ikke trivielt og litteraturen om suppressive evner iTregs er kontroversiel. Adskillige metoder og protokoller til vurdering undertrykkende funktion af humane tregs er offentliggjort andetsteds 22,37 - 41, med in vitro proliferationsassays baseret på flowcytometri udlæsninger såsom fortynding af carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) er den mest almindeligt anvendte. Det er vigtigt at vaske og hvile iTregs før anvendelse i undertrykkelse assays, og det skal overvejes at iTregs, i modsætning til nTregs, kan ikke være anergiske men formere sig under undertrykkelse assays. Vi anser det ekstremt vigtigt at bruge `mock' stimulerede T-celler som kontrol suppressorceller at identificere graden af ​​uspecifik suppression (såsom gennem CTLA-4-ekspression, IL-2 forbrugerptio n og kultur overvækst af aktiverede T-celler), der er relateret til Foxp3 + treg-specifikke effekter, og den hyppige mangel på denne kontrol kan bidrage til nogle kontroverser i litteraturen. Ved hjælp af denne kontrol, vi definerede, at kun TGF-beta / ATRA / Rapa-inducerede iTregs vises undertrykkende aktivitet in vitro 22. Konkluderer vi derfor, at med hensyn til undertrykkende aktivitet (omend ikke højeste brøkdel af foxp3 + celler), TGF-β / ATRA / Rapa er den bedste kombination af faktorer af de beskrevne protokoller til fremkalde iTregs. Ikke desto mindre undertrykkende aktivitet in vitro ikke nødvendigvis afspejler undertrykkende aktivitet in vivo, og faktisk vi bestemt, at menneskelige iTregs genereres af disse protokoller ikke undertrykke i en xenogen graft- versus -host sygdomsmodel i det mindste under de testede 22 betingelser. Dette kan være relateret til ustabil Foxp3 udtryk, der blev tabt i iTregs upon restimulering, på linje med en mangel på TSDR demethylering 22

Afhængig af hvilket aspekt af iTreg funktioner (høj brøkdel af foxp3 + celler, overlegen undertrykkende aktivitet, foxp3 stabilitet) er vigtigst for en bestemt problemstilling, kan forskellige protokoller være mest egnet til at studere disse spørgsmål, hvilket gør det vanskeligt at definere den generelt 'bedst 'protokol for treg induktion. Endvidere kan flere ovenfor beskrevne subtile eksperimentelle forskelle påvirke resultater og kan bidrage til kontroverser med hensyn til fænotype og undertrykkende funktion af TGF-p-induceret iTregs der vises mellem rapporter selv med tilsyneladende lignende protokoller for iTreg generation 42. For eksempel, selv inden for et laboratorium, observerede vi, at iTregs induceret med TGF-β og IL-2 i serum-holdigt RPMI-medium viste nogle suppressiv aktivitet sammenlignet med kontrolceller 27, mens TGF-β / IL-2-inducerede iTregs frembragt i defineret, serumfrit T-celle-dyrkningsmediet ikke 22, då trods tilsvarende niveauer af foxp3.

Fremtidige applikationer baseret på disse protokoller bør stræbe efter at yderligere at optimere Treg induktion betingelser for at opnå en fænotype med stabil Foxp3 udtryk TSDR demethylering, stabil fænotype uden omformning til cytokin-producerende effektor T-celler og optimal undertrykkende aktivitet. Videreudvikling af iTreg induktion protokoller kan være nyttige til adoptiv overførsel tilgange i fremtiden, i hvilken terapi af Treg overførsel er meget lovende for potentiel behandling af autoimmune og inflammatoriske sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

Immunologi regulatoriske T-celler Treg CD4 + -T-celler magnetisk celleisolering, cytokiner Foxp3 TGF-β IL-2 intracellulær Flowcytometri QRT-PCR
<em>In vitro</em> differentiering af humane CD4 <sup>+</sup> Foxp3 <sup>+</sup> Induced Regulatory T-celler (iTregs) fra naive CD4 <sup>+ T-celler</sup> under anvendelse et TGF-β-holdige protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter