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Immunology and Infection

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatorischen T - Zellen (Tregs) unterdrücken andere Immunzellen und sind kritische Vermittler der peripheren Toleranz, die Verhütung von Autoimmun- und übermäßige Entzündung 1. Die Bedeutung der Treg wird von der menschlichen Krankheit immunodysregulation Polyendokrinopathie Enteropathie X-chromosomal-Syndrom (IPEX), in dem Verlust von Treg aufgrund von Mutationen in der `Master' Treg Transkriptionsfaktor forkhead Feld P3 (FOXP3) führt zu schweren systemischen Autoimmunerkrankung exemplifiziert, tödlich in einem frühen Alter. Allerdings wirken Tregs als zweischneidiges Schwert in das Immunsystem , wie sie auch Antitumor - Immunität in bestimmten Einstellungen 2 behindern. Die therapeutische Beeinflussung von Treg Anzahl und Funktion ist deshalb Gegenstand zahlreicher klinischer Untersuchungen. Bei Krebs Erschöpfung der Tregs kann wünschenswert sein , und einige Erfolg klinischer Ansätze fördert die weitere Forschung 3. In Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, zusätzlich zu den therapeutischen Wirkungen von Treg in seveNeueste in-Man - Studien von Adoptiv Treg Transfer ral Maus Krankheitsmodelle, um zu verhindern Graft - versus -host Erkrankung (GvHD) 4 - 7 und die Sicherheit zu bewerten bei Typ - 1 - Diabetes 8 zeigten vielversprechende Ergebnisse zu behandeln.

Natürlich vorkommende Treg (nTregs) Thymus abgeleitete tTregs umfassen und peripher induzierte pTregs, mit nicht-redundanten wesentlichen Funktionen in die Aufrechterhaltung der Gesundheit von 9 bis 11. Allerdings sind nTreg Zahlen begrenzt, die komplementären Ansatz zur Induktion Tregs (iTregs) in vitro aus naiven T - Zell - Vorläufer 12 ermutigend. Noch Stabilität iTregs, vermutlich aufgrund des Fehlens von Demethylierung in der sogenannten Treg-spezifischen demethylierten Bereich (TSDR) im FOXP3 Genlocus 13 bleibt ein Problem und einige Studien zeigen , dass Treg in vivo induziert 14 stabiler sind.

Bis heute bleibt FOXP3 das beste Protein mArker für Tregs , aber es ist nicht absolut spezifisch , weil die menschliche konventionellen CD4 + CD25 - T - Zellen transient Zwischenstufen FOXP3 auf 15,16 Aktivierung auszudrücken. Obwohl erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der Regulation der Foxp3-Expression erzielt wurden, bleibt noch viel vor allem in menschlichen Zellen in Bezug auf die Induktion, Stabilität und Funktion von FOXP3 entdeckt zu werden. Trotz der Unterschiede zu nTregs, in vitro induzierten FOXP3 + CD4 + T - Zellen können als Modellsystem verwendet werden , um molekulare Mechanismen der FOXP3 Induktion zu studieren und als Ausgangspunkt zu entwickeln Protokolle in die Zukunft , die für die Erzeugung von iTregs ermöglichen , die mehr sind ähnlich wie in vivo erzeugt Tregs, die für Adoptivtransfer - Strategien in der Zukunft anwendbar sein könnte.

Es gibt keine `Gold Standard' Protokoll für die menschliche iTregs induzieren und aktuellen Protokolle auf nachahmt Treg-induzierenden Bedingungen in vivo entwickelt basiert: Interleukin 2 (IL-2) Und β - Wachstumsfaktor (TGF-β) Signalisierungs Transformation für FOXP3 Induktion in vivo entscheidend 17 und all-trans - Retinsäure (ATRA) - , die in vivo durch darmassoziierten dendritischen Zellen produziert wird - verwendet wird , häufig FOXP3 Induktion zu verbessern in vitro 18-21. Wir haben zusätzliche menschliche Treg-induzierende Protokolle Butyrat 22, einen Darmmikrobiota gewonnenen Fettsäure kurzkettigen mit entwickelt , die vor kurzem murine Treg Induktion 23,24 zu erhöhen wurde gezeigt. Wir stellten auch vor kurzem ein neues Protokoll für die Erzeugung von iTregs mit überragender Unterdrückungsfunktion in vitro durch eine Kombination von TGF-β mit ATRA und 22 Rapamycin, letztere eine klinisch zugelassenen mammalian target of Rapamycin (mTOR) sein Inhibitor, der bekannt ist , zu fördern FOXP3 Wartung während der menschlichen Treg Expansion 25,26.

Diese Methode beschreibt die reproduzierbarvitro - Erzeugung von humanen CD4 + FOXP3 + iTregs eine Reihe von verschiedenen Bedingungen verwendet, und deren anschließende Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie und quantitative reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) protokollspezifische Muster der Expression von FOXP3 und andere Treg Signatur - Moleküle zu offenbaren solche wie CD25, CTLA-4, EOS, sowie Unterdrückung von IFN-γ und SATB1 Ausdruck 22. Die erzeugten Zellpopulationen können für funktionelle Assays verwendet werden, unterdrückende Aktivität in Bezug auf oder für molekulare Studien, entweder allgemeine FOXP3 Regulierer über oder Effekte für bestimmte Verbindungen wie Butyrat oder Rapamycin zu studieren. Ein weiteres Verständnis der molekularen Mechanismen Treg Differenzierung der Fahrt ist sehr relevant für zukünftige therapeutische Ansätze für Autoimmun- oder Krebs gezielt Moleküle in Treg Generation und Funktion beteiligt Ziel.

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Protocol

Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden frisch isoliert von anonymisierten gesunden Spender Leukozytenfilmen erworben von der Karolinska University Hospital, Schweden. Ethische Genehmigung für die Versuche wurde vom regionalen Ethical Review Board in Stockholm erhalten (Reģionālā etikprövningsnämnden i Stockholm), Schweden (Zulassungsnummer: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. T-Zell-Isolierung aus dem peripheren Blut

  1. PBMC Isolation
    1. Pre-lagen 15 ml Dichtezentrifugation Medium (wie Ficoll) Lösung in 50-ml-Röhrchen (5 Tuben pro Leukozytenmanschette). Pre-auf Raumtemperatur erwärmt.
    2. Füllen Sie Leukozytenmanschette mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Raumtemperatur) bis 180 ml. Wenn frisches Blut verwendet wird, Blut mit dem gleichen Volumen von PBS verdünnen.
    3. Kipprohr zur Seite und langsam overlay Dichtezentrifugation Medium mit ~ 35 ml verdünntem Blut pro Röhrchen. Fügen Sie das Blut sehr sorgfältig, ohne Vermischung der Dichtezentrifugation medium Phase und Blutschicht.
    4. Zentrifuge 20 min bei 1150 × g bei Raumtemperatur ohne Bremse. Betreiben Sie die Zentrifuge ohne Bremse und wenn möglich mit geringer bis mittlerer Beschleunigung zu verhindern Vermischung der Schichten.
    5. Nehmen Sie den weißen Ring aus PBMCs zwischen dem Dichtezentrifugation Medium und der Plasmaphase enthält. Übertragen auf ein neues 50-ml-Röhrchen (1 Mal mit 5 ml Pipette und 2-mal mit 2 ml Kunststoff-Pasteurpipette). Nehmen Sie so wenig wie möglich Plasma und Dichtezentrifugation Medium. Sie nicht die roten Erythrozyten-Pellet berühren.
    6. Wash PBMCs. Teilen Sie die PBMCs in 50-ml-Röhrchen (4 Tuben pro Leukozytenmanschette). Füllen Sie jeweils auf 50 ml mit PBS.
    7. Zentrifuge 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur.
    8. Entfernen und entsorgen Überstand, bündeln die Zellen in 1 Röhrchen mit 10 ml RPMI / 10% fötales Kälberserum (FCS) Medium und resuspendieren gut. Wenn Zellklumpen vorhanden sind, Stamm-Zellen durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb.
    9. Übertragen Zellen in T175 Zellkulturflasche für AnzeigeHerent Zellen. Spülen Sie Röhrchen mit 40 ml Medium und verbinden sich mit Zellen (50 ml insgesamt). Falls erforderlich, eine aliquote Menge für die Durchflusszytometrie-Analyse zu entfernen (siehe Schritt 1.4). Üblicherweise umfassen CD4 + T - Zellen etwa 30-40% der Zellen in der Lymphocyten - Schranke und naiven T - Zellen umfassen etwa 30 bis 60% der CD4 + T - Zellen in Abhängigkeit von dem Spender.
    10. Inkubiere Zellen in Kolben bei 37 ° C / 5% CO 2 für 45 bis 90 min gelegt. Dieser Schritt wird durch Monozyten Kunststoffadhärenz erschöpfen. Es ist nicht zwingend, aber der Prozentsatz T-Zell-Ausbeute pro Menge an PBMCs in den folgenden Schritten erhöhen.
    11. Die Zellen (in der 50 ml Medium in der Flasche enthalten ist) und die Zellschicht auf dem Boden des Kolbens gut abspülen. Verteilen Zellen gleichmäßig in zwei 50-ml-Röhrchen (die vorherigen Rohre werden für den gleichen Spender wiederverwendet). Spülen Sie Kolben mit 50 ml frischem RPMI / 10% FCS-Medium, und gleichen Teilen in den gleichen zwei Röhren.
      HINWEIS: PBMCs kann über Nacht bei 4 ° C mit Rohren Auflegen gelagert werdendie Seite, oder im Idealfall direkt für T-Zell-Isolierung verwendet.
  2. nTreg Isolation durch Magnetic-Activated Cell Sorting
    1. Bereiten Isolationspuffer: 0,5% (w / v) Humanserumalbumin und 2 mM EDTA in PBS. Halten Sie immer Puffer bei 4 ° C. Alternativ zu Humanalbumin, verwenden Rinderalbumin.
    2. Resuspendieren und zählen PBMCs mit einer automatischen oder manuellen Zellzähler in Gegenwart von Trypanblau (nicht zählen kleine Plättchen). Wenn Zellklumpen beobachtet werden, Stamm-Zellen durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb.
    3. Zentrifuge PBMCs bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur.
    4. Die Zellen (mit 1 ml - Pipette) in 90 & mgr; l Isolationspuffer pro 10 7 PBMCs eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Halten Sie Zellen in den ursprünglichen 50-ml-Röhrchen (2 Tuben pro Leukozytenmanschette).
    5. In 2 ul CD25 Perlen pro 10 7 Zellen, zu mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C.
    6. Füllen Sie mit PBS auf 30 ml. Zentrifuge bei 450 × g für 10 min bei 46; C.
    7. Bereiten Sie LS-Säulen (2 pro Leukozytenmanschette): äquilibrieren mit 3 ml Isolationspuffer, und entsorgen Sie durchströmen. Rohre können wiederverwendet werden, um weitere Spalten zu spülen.
    8. Die Zellen in 3 ml Isolationspuffer pro Röhrchen (mit 1-ml-Pipette). Transfer-Zellen zu LS-Säule und sammeln Fluss durch frische 15-ml-Röhrchen.
    9. Spülen Sie die 50-ml-Röhrchen mit 2 ml Isolation jeder Puffer. Transferpuffer zu den Spalten Spülen.
    10. Waschkolonne 2x mit 3 ml Isolierungspuffer jeweils. Warten Sie immer, bis die Säule tropft gestoppt, bevor sie eine neue Flüssigkeit hinzugefügt wird. Speicher fließen durch bei 4 ° C für den späteren Schritten.
    11. Entfernen Sie Spalte von Magneten. Eluieren 2x mit 3 ml Isolationspuffer pro Spalte in 15-ml-Tube.
      HINWEIS: Das Eluat aus 2 Spalten pro Spender können kombiniert werden. Sie nicht die Spalte in die Flüssigkeit eintauchen.
    12. Vorbereiten und äquilibrieren neue LS-Säulen (1 Spalte pro Leukozytenmanschette). Übertragen des Eluats aus 1.2.11 an die Säule. Die Strömung durch kann verworfen werden. Nach dem Eluat hat Passed durch die Säule gründlich Rohr und waschen Säule 3x mit 3 ml Isolationspuffer.
      HINWEIS: Die zweite Säule wird entscheidend zu erhöhen Reinheit benötigt.
    13. Entfernen Sie Spalte von Magneten. Eluieren CD25 ++ "nTregs" 2x mit 3 ml Isolationspuffer.
    14. Zentrifuge bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C. Vollständig entfernen Überstand.
    15. Wasche die Zellen mit 15 ml T-Zell-Kulturmedium, Zentrifuge bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C. Vollständig entfernen Überstand.
    16. Die Zellen in 0,5 ml T-Zell-Kulturmedium, supplementiert mit 100 IU / ml IL-2, jeweils. Transfer-Zellen auf 24-Well-Platte. Rinse Röhrchen mit 0,5 ml Medium (+ 100 IU / ml IL-2) und kombinieren in 24-Well-Platte.
    17. Zählen nTregs (wie in Schritt 1.2.2). Die Ausbeute ist in der Regel etwa 1-4 x 10 6 Tregs pro Leukozytenmanschette. Einstellen Dichte von Treg auf 1-2 x 10 6 Zellen / ml mit T - Zell - Kulturmedium + 100 IU / ml IL-2.
    18. Inkubieren Treg bei 37 ° C / 5% CO 2 bis zur Verwendung.
    Naiver CD4 + T - Zell - Isolation durch Magnetic-Activated Cell Sorting
    HINWEIS: Nehmen Sie durch aus Schritt fließen 1.2.8-1.2.10 mit Zellisolierung, um fortzufahren. Alternativ kann, wenn keine nTregs isoliert wurden, gehen Sie direkt von PBMCs.
    1. Kombinieren Sie zwei Röhren pro Spender von Treg-verarmten PBMCs in 50-ml-Tube. Füllen mit PBS auf 50 ml bei Raumtemperatur.
    2. Zentrifuge PBMCs bei 200 xg für 5 bis 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendiere Zellen in 50 ml PBS.
    3. Wiederholen Sie Schritt 1.3.2 zweimal.
      HINWEIS: Die PBS-Waschungen zur Entfernung von Blutplättchen sind von entscheidender Bedeutung, die mit der folgenden negativen Isolation Kit entfernt werden nicht. Plättchen bleiben im Überstand bei dieser Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit. Platelet Abreicherung kann in den einzelnen Stufen auf einem mikroskopischen Objektträger beobachtet werden. Die Schritte müssen durchgeführt werden, mit PBS und Zentrifugationen bei Raumtemperatur.
    4. Resuspendieren PBMCs in 50 ml PBS. Zählen von Zellen, wie in Schritt 1.2.2.
    5. Zentrifuge PBMCs bei 450 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 40 ul Isolierungspuffer (4 ° C) pro 10 7 Zellen.
    6. In 10 ul Naïve CD4 + T - Zell - Biotin-Antikörper - Cocktail II pro 10 7 Zellen.
    7. Mischen, und Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
    8. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 40 ml PBS (4 ° C) und Zentrifugation bei 450 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in 80 ul Isolationspuffer pro 10 7 Zellen.
    9. Geben Sie 20 & mgr; l anti-Biotin - Mikrokügelchen pro 10 7 Zellen. Gut mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C.
    10. Füllen auf 50 ml mit kaltem PBS und zentrifugieren 450 xg für 10 min bei 4 ° C.
    11. Bereiten Sie LS-Säulen (mit 3 ml Isolationspuffer ins Gleichgewicht). Um zu vermeiden , Spaltenüberlast, verwenden Sie eine Spalte für maximal 250 x 10 6 PBMCs oder weniger , wenn PBMCs viele rote Blutkörperchen enthalten.
    12. Überstand entfernen und resuspendieren cells in 3 ml Isolationspuffer. Transfer Zellen LS Säule. Sammeln Sie Fluss durch, die die naive CD4 + T - Zellen enthält, in 15 - ml - Röhrchen.
    13. Spülen Sie Röhrchen mit 2 ml Isolationspuffer. Übertragen auf die Säule.
    14. Waschen der Säule 3x mit 3 ml Isolationspuffer. Warten Sie immer, bis die Säule tropft stoppt, bevor sie eine neue Flüssigkeit hinzugefügt wird.
    15. Nehmen die Strömung durch (naive CD4 + T - Zellen) und Zentrifuge 450 xg für 10 min bei 4 ° C. Spalten können verworfen werden.
    16. Vollständig entfernen Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 15 ml Medium, Zentrifuge 450 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und vollständig zu entfernen Überstand.
      HINWEIS: Isolation Puffer enthält EDTA, die Calciumionen chelatisiert und beeinträchtigt somit T-Zell-Aktivierung. Vor jeder Stimulation Assays, entfernen Sie den Isolationspuffer vollständig und waschen Sie die Zellen zweimal mit 15 ml Medium.
    17. Die Zellen in T - Zellkulturmedium zu 2-3 x 10 6 Zellen pro ml. Rest-Zellen in geeigneten Kolben or weit über Nacht im Inkubator. Wenn Zellen direkt für die Stimulation Assays verwendet werden, waschen Sie sie noch einmal mit Medium.
  3. Reinheit Kontrollfärbung
    1. Nehmen Sie ~ 50.000 Zellen (Tnaïve; nTreg; PBMCs), die jeweils in 20 & mgr; l.
      HINWEIS: Wenn beide Tnaïve und nTreg Platte gefärbt werden, nehmen zwei Proben jeder.
    2. Bereiten Sie 2x konzentrierte Antikörper Vormischung (in PBS) als geeignet für das Instrument, zum Beispiel: Tnaïve Platte: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10 CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Für Treg-Panel, CD45RO-PE mit CD25-PE, 01.10 ersetzen.
      HINWEIS: Nur bestimmte CD25-Antikörper, die verschiedene Epitope als die CD25-Microbeads erkennen, verwendet werden nTregs zu färben mit CD25 Microbeads isoliert.
    3. In 20 ul Antikörper-Vormischung zu 20 & mgr; l Zellen. Bereiten auch einzelne Färbungen für jedes Fluorochrom (unter Verwendung einer Probe positiven Zellen enthalten, zB PBMCs) und eine ungefärbte Probe, für die Durchflusszytometrie settings und Entschädigung.
    4. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    5. Füllen Sie jede Probe mit 200 ul PBS, und Zentrifuge 450 g für 5-10 min.
    6. Nehmen Zellen in Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) Puffer (= Isolierungspuffer ohne EDTA) und Analyse durch Durchflusszytometrie. Die Reinheit von naiven CD4 + T - Zellen ist in der Regel> 95% (siehe Abbildung 2).

2. Treg Induktion Kultur

  1. Vorbereitung der Stimulation Medien und Platten
    1. Vorbereiten und vorwärmen T-Zellkulturmedium: Serum-freien hämatopoetischen Medium, ergänzt mit 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin.
    2. Bereiten Sie Cytokin, Stimulation Antikörper und Verbindung Stammkonzentrationen.
      1. Bereiten Sie IL-2-Stammlösung: 400.000 IU / ml in steril filtriert (mit säurebeständigen Filter) 100 mM Essigsäure (167 ug / ml, wenn Aktivität der verwendeten Menge ist 2.400 IE pro 1 & mgr; g; mit bestätigen Anbieter). Aliquotieren zu sterilisierten proteinarme 0,5-ml-Röhrchen Bindung, Dichtung mit Parafilm, einfrieren auf Trockeneis und bei -80 ° C für die langfristige Lagerung oder -20 ° C bis zu 3 Monaten.
      2. Bereiten Sie TGF-β1-Stammlösung (10 & mgr; g Fläschchen, trägerfrei): Centrifuge TGF-β1-Pulver (1000 · g 3 min), 100 ul 4 mM HCl (sterilfiltriert mit säurebeständigen Filter) Stammlösung zu mit 100 ug / ml, vollständig auflösen; Wirbel. Aliquotieren 5 ul jeweils zu sterilisierten niedrigem Proteinbindung 0,5-ml-Röhrchen, Dichtung mit Parafilm, einfrieren auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zu 6 Monaten.
      3. Bereiten Sie ATRA Stammlösung: Man löst Pulver bei 20 mg / ml (66,6 mM) in DMSO. Bereiten Stammlösung von 10 mM durch weitere Verdünnung in DMSO und speichern Aliquots, vor Licht geschützt, bei -80 ° C für bis zu 1 Jahr. ATRA ist empfindlich gegenüber Licht, Wärme und Luft.
      4. Bereiten Sie Rapamycin-Stammlösung: 1 mg / ml (1,11 mM) in DMSO, lagern in Aliquots bei -80 ° C fürbis zu 1 Jahr.
      5. Bereiten Sie Natriumbutyrat Stammlösung: 0,908 M (0,1 mg / ml) Lager in sterilen ultrareinem H 2 O und Sterilfilter. Aliquotieren und bei -20 ° C.
    3. Bereiten 4x konzentrierte Vormischungen (50 ul pro Vertiefung) in T - Zellkulturmedium , wie in Tabelle 1.
    4. Am Vortag, Mantel-Platten mit Anti-CD3-Antikörper. Coat gewünschte Anzahl von Vertiefungen von 96 U-Well-Platte mit 5 & mgr; g / ml anti-CD3-Antikörper in PBS, 65 ul / Vertiefung. Wickeln Sie Platte mit Folie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
      HINWEIS: Verwenden Sie nicht die Rand Wells von 96-Well-Platten verwendet werden. Bigger Vertiefungen verwendet werden können, sondern U-förmige Vertiefungen erleichtern die Verwendung der gleichen Zellzahl pro Fläche in Experimenten. Wenn mehr Zellen benötigt werden, bündeln die erforderliche Menge an Vertiefungen nach Kultur. Üblicherweise nach 4-6 Tagen Expansions 2 Vertiefungen jede Probe sind ausreichend für die Durchflusszytometrie-Analyse und RNA-Analyse.
      1. Am Tag der Plattierung, kurz vor dem Plattieren zu entfernen anti-CD3 Lösung aus Brunnen. Füllen Vertiefungen mit 200 ul / Vertiefung PBS. Entfernen PBS. Wiederholen Sie das Waschen mit 200 ul / Vertiefung PBS. Entfernen PBS vollständig und verwenden Platten sofort.
    5. Bereiten Sie Platten (nicht verwenden Marge Wells):
      1. Für jede Vertiefung wurden 50 ul anti-CD28 / IL-2-Vormischung 4x hinzufügen, 50 ul 4x TGF-β1-Vormischung (für alle iTregs) oder 50 ul T-Zellkultur (mit Ausnahme von "nicht-stimulierten" Zellen, T-Zellkulturmedium hinzufügen) Medium für "Stimulation nur" Scheinkontrolle, 50 ul 4x ATRA, ATRA / Rapamycin oder Butyrat Vormischung (wo anwendbar) oder Medium
      2. Füllen Sie alle leeren Brunnen, einschließlich der Marge Brunnen, mit 200 ul PBS. Pre-warmen Platten bei 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Bereiten Sie naiver T - Zellen für Plating
    1. Zellen, Transfer in 15-ml-Röhrchen, spülen Kolben / Brunnen mit vorgewärmten T-Zellkulturmedium und Pool Rohr Nach einer Ruhepause. Füllrohr zu 15 ml mit T-Zell-Kulturmedium. </ Li>
    2. Zentrifugen Zellen bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur.
    3. Entfernen Sie Medium und nehmen Zellen in frischen, vorgewärmte T - Zellkulturmedium bis zu einer Dichte von 2,2 bis 2,6 x 10 6 / ml. Zählen von Zellen, wie in Schritt 1.2.2 und passen Dichte, wenn nötig.
    4. In Zellen bereit Stimulation Platten (siehe 2.1), 50 & mgr; l Zellen / Well (110,000-130,000 Zellen / Vertiefung). Jede Vertiefung sollte nun mit einem Gesamtvolumen von 200 ul enthalten.
    5. Wickeln Sie Platten in Aluminiumfolie zu schützen ATRA von Licht; bei 37 ° C / 5% CO 2 für die gewünschten Zeiträume inkubiert.
  3. Monitor - Treg Induktion Kultur
    1. Monitor-Treg Kulturen durch Lichtmikroskopie (40-facher Vergrößerung). Von etwa Tag 2 bis 3 sollten kleine Cluster von proliferierenden Zellen sichtbar, die in größere Cluster zu späteren Zeitpunkten verschmelzen. Kulturen mit Rapamycin gewachsen wachsen im Allgemeinen weniger. Siehe auch 3.
    2. Zu gewünschten Zeitpunkten, nehmen Proben für die RNA-eXtraction oder Durchflusszytometrie Phänotypisierung (siehe unten). Zur späteren Zeitpunkten mit der Zellproliferation, 1 auch jeweils ausreichend ist , nehmen sonst 1 x 10 & sup5 ; -1 · 10 & sup6 ; Zellen jeweils für RNA und 3 x 10 & sup5 ; -1 · 10 & sup6 ; Zellen für die Durchflusszytometrie.
  4. Die Beurteilung FOXP3 Stabilität
    1. Für die Stabilität des Phänotyps iTreg Beurteilung , wie zuvor beschrieben 22,27, wasche iTregs zweimal mit T - Zell - Kulturmedium, und die Kultur iTregs weiter in T - Zell - Kulturmedium , entweder ohne oder mit anti-CD3 und anti-CD28 - Restimulation wie in 2.1 und 2.2 beschrieben . Hinzufügen, Cytokine, wie zum Beispiel 50 IU / ml IL-2, zu studieren, deren Einfluss auf FOXP3 Stabilität.
    2. Zu gewünschten Zeitpunkten Proben für die RNA - Extraktion, Durchflusszytometrie Phänotypisierung (siehe unten), und TSDR Methylierungsanalyse als 22,28 beschrieben.

3. Die phänotypische Analyse von iTregs durch qRT-PCR

  1. Vorbereitung vonProben
    1. Zu gewünschten Zeitpunkten, nehmen Sie 1 × 10 5 bis 1 x 10 6 Zellen pro Probe für die RNA - Extraktion. Transfer-Zellen auf ein RNase-freies 1,5 ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 500 xg für 5 min.
    2. Falls erforderlich, ein Teil der Überstand entfernen und für enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) oder ähnliche Analyse einzufrieren. Entfernen Sie vollständig aus den Zellen verbleibende Überstand. Gehen Sie direkt auf die RNA-Extraktion oder gefrierZellPellet auf Trockeneis und bei -20 ° C bis -80 ° C für bis zu 2 Wochen.
    3. Extrahieren RNA und führen qRT-PCR für FOXP3 und ein Housekeeping - Gen (wie RPL13A) nach Standardprotokollen. Darüber hinaus messen Expression anderer Treg Signatur Gene (zum Beispiel `Treg up' Gene IL2RA, CTLA4, IKZF4 und` Treg down' Gene IFNG, SATB1).

4. Die phänotypische Analyse durch Durchflusszytometrie

Hinweis: Dieses Protokoll wird für stain optimierting in 96U Well - Plattenformat mit 3 x 10 5 -1 × 10 6 Zellen. Wenn es weniger Zellen pro Vertiefung, beginnen Sie mit mehreren Brunnen und Pool wie unten beschrieben.

  1. Handy Restimulation (Optional)
    1. Wenn Färbung für intrazelluläre Zytokine gewünscht wird, Puls Zellen mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) / Ionomycin in Gegenwart eines Protein-Transport-Hemmer.
      Hinweis: Dieses Verfahren hat keinen Einfluss auf FOXP3 Expression in oben beschriebenen iTreg Kulturen, aber auch andere Markierungen ändern kann - zum Beispiel, ist CD4 herunter reguliert.
    2. Bereiten 10x Brefeldin A / PMA / Ionomycin-Vormischung (20 & mgr; l pro Vertiefung) in T-Zell-Kulturmedium: Brefeldin A-Stammlösung 1: 100, Ionomycin (Lager 5 ug / ul) 1: 1.300, PMA (Lager 12,35 ug / ul, pre -Nachbehandlung 1: 1235) 1: 100 vorverdünnter Lager.
    3. 4 Stunden vor der Färbung, fügen Sie 20 ul Brefeldin A / PMA / Ionomycin 10x Mischung pro Vertiefung Ende Konzentrationen von 1 zu erhalten: 1000 Brefeldin A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomycin, 10 ng / ml PMA.
    4. Inkubieren für 4 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2
  2. Oberflächenfärbung
    HINWEIS: Das Panel hier vorgeschlagen ist ein Vorschlag; andere Platten können in Abhängigkeit von den Antigenen von Interesse und Gerätekonfiguration verwendet werden.
    1. Kühle PBS auf Eis. Bereiten Sie FACS-Puffer (PBS mit 0,5% humanes Serumalbumin, HSA) und kühle auf Eis. BSA oder FBS kann als Alternative zu HSA verwendet werden.
    2. Re-Platte Zellen in Färbung Platte: Die Zellen mit einer Pipette und übertragen Sie die Zellen in eine neue Well-Platte 96U, um jede Vertiefung ein gut frei bleibt (zur Verhinderung von Spill-over in späteren Färbeverfahren). Wenn weniger als die gewünschte Zellzahlen in der ursprünglichen gut sind, auch Teil des Überstandes vor der Resuspension und auf den Pool mehrere Brunnen in eine Färbung zu entfernen.
    3. Zentrifugenplatte 400 xg für 10 min bei Raumtemperatur.
    4. Entfernen Sie den Überstand. Gieße Überstand in Abfallbehälter, lassen Sie die Platte den Kopfnach unten und sofort (ohne die Platte drehen zurück) tippen Sie auf die Platte einmal auf saugfähigem Papier. Dann schalten Sie sofort die Platte zurück. Vortex Platte Zellen zu suspendieren Flüssigkeit in zu bleiben.
    5. In 25 ul Oberflächenfärbung Vormischung (CD25-PE 01.20, CD4-PerCP 1: 5 in FACS-Puffer) und resuspendieren.
      HINWEIS: umfassen auch einzelne Anfärbungen für jede der verwendeten Fluorochrome mit Proben, die positive Zellen für das jeweilige Antigen enthalten; und beinhalten eine ungefärbte Probe. Diese werden für die Geräte Kompensation Setup benötigt werden. Alternativ dazu können Sie Entschädigung Perlen.
    6. Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln.
    7. Mit 200 & mgr; l PBS, Zentrifugenplatte 400 xg für 10 min bei 4 ° C und entfernen Überstand, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben. Vortex Platte.
    8. Wiederholen Sie Schritt 4.2.7 zweimal.
  3. Viability Anfärben
    HINWEIS: Viability Färbung ist unverzichtbar, da nach der Fixierung / Permeabilisierung toten Zellen nicht ausreichend ausgeschlossen werdenfsc / ssc und kann zu unspezifischen Signale geben. A fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff verwendet werden.
    1. Die Zellen in 130 & mgr; l Lebensfähigkeit Fleck Vormischung (fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff-eFlour780 1: 1400 in PBS) und sofort mit dem mehrkanaligen Pipette resuspendieren Zellen.
      HINWEIS: auch eine einzelne Färbung für die Lebensfähigkeit Farbstoff tote Zellen enthalten, zB nicht - stimulierten T - Zellen, die für mehrere Tage oder Zellen töten , indem sie die Anwendung von Wärme , wie durch den Anweisungen des Herstellers. Diese werden für die Kompensation benötigt.
    2. Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln.
    3. Zentrifugenplatte bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand entfernen, wie in Schritt 4.2.4. Vortex Platte.
    4. Füllen Sie mit 200 ul FACS-Puffer. Wiederholen Sie Schritt 4.3.3.
    5. Füllen Sie mit 200 ul PBS. Wiederholen Sie Schritt 4.3.3.
  4. Intrazelluläre Färbung mit FOXP3 Färbepuffers Set
    1. Für jeden gut vorbereiten: 150 ul Fix / Perm Puffer (verdünnte Fix / Perm konzentrate 1: 4 mit Verdünnungsmittel); 850 ul 1x Permeabilisierung Puffer (verdünnt 10x Permeabilisierung Puffer 1:10 mit ultrareinem H 2 O).
    2. Nach dem Vortexen resuspendieren Zellen in 150 ul Fix / Perm Puffer und sofort mit Pipette resuspendieren. Es ist wichtig, sofort zu resuspendieren Fixierung von Zellklumpen zu vermeiden.
      Achtung: Die Fixierung Puffer enthält Paraformaldehyd und sollte entsprechend behandelt und entsorgt werden.
    3. Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln.
    4. 100 l kaltem PBS. Zentrifuge bei 850 × g für 10 min bei 4 ° C.
      HINWEIS: Von diesem Schritt an sind die Zentrifugation Geschwindigkeit erhöht wird Verlust von Zellen zu vermeiden. Nach der Fixierung werden Zellen unsichtbar und Sorgfalt sollte die Überstände entnommen werden zu entfernen, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben, und unmittelbar nach der Zentrifugation beendet Verlust von Zellen zu minimieren.
    5. Überstand entfernen, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben. Vortex Platte.
      HINWEIS: Die Färbung kann bei diesem Schritt angehalten werden; imdieser Fall, waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 & mgr; l PBS; dann nehmen Sie in 250 ul PBS und lagern bei 4 ° C, geschützt vor Licht. Die Zellen können für einige Tage gespeichert werden, gehen Sie dann mit Permeabilisierung. Jedoch werden optimale Ergebnisse erzielt, wenn direkt nach Permeabilisierung fortgesetzt.
    6. Nach Vortexen, fügen Sie 200 ul Permeabilisierungs Puffer. Zentrifuge bei 850 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand entfernen, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben. Vortex Platte.
    7. In 200 ul Permeabilisierung Puffer wieder zu suspendieren.
      HINWEIS: Hier können die Proben in die intrazelluläre Färbung und Isotyp Kontrollprobe (wegnehmen Hälfte jeder Probe) aufgeteilt werden. Wenn die Zellzahlen begrenzen, kann eine gepoolte Isotyp Probe hergestellt werden (wegzunehmen 10-20 ul jeder Probe und Pool). Außerdem können Proben für die Fluoreszenz-Minus-One (FMO) Kontrollen genommen werden.
    8. Zentrifuge bei 850 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand entfernen, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben. Vortex Platte.
    9. Pellet in44 & mgr; l Permeabilisierungs Puffer plus 1 ul normales Mausserum (vorgemischten) unspezifische Bindung zu blockieren.
      ANMERKUNG: Dies gilt, wenn in dem folgenden Schritt verwendet, um Antikörper von Maus-Isotyp sind. Wenn andere Antikörper, wie beispielsweise aus der Ratte abgeleitet sind , verwendet werden, umfassen die entsprechenden Serums für die Blockierung (beispielsweise Rattenserum).
    10. bei 4 ° C inkubieren 15 min im Dunkeln.
    11. In Antikörper:
      HINWEIS: Informieren Sie die Antikörperkonzentrationen für die spezifischen Posten. Wenn nicht in Schritt 4.2 mit Antikörpern gegen Oberflächenantigenen durchgeführt (beispielsweise CD4) mit den jeweiligen Fluorochrome umfassen auch einzelne Anfärbungen für jede der verwendeten Fluorochrome mit Proben , die positive Zellen zur Kompensation enthalten.
      1. In 15 ul Antikörper-Vormischung Proben (mit Ausnahme von einzelnen Färbungen, ungefärbten Proben, Isotyp Kontrollproben und FMO Kontrollen): Premix pro Probe: 0,7 & mgr; l (0,35 ug) anti-Interferon gamma (IFN-γ) -FITC (ggf. nach Restimulation ),2,3 ul (0,115 ug) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 ul (0,05 ug) Anti-FOXP3-APC, 10 & mgr; l PBS.
      2. Zur Kontrollproben Isotyp, fügen Sie 15 ul-Isotyp-Antikörper-Vormischung, die gleichen Mengen an Antikörper verwendet wird wie für die verwendeten Antikörper in 4.4.11.1: Premix pro Probe: 0,7 & mgr; l (0,35 ug) Maus IgG1 K Isotypenkontrolle FITC (falls zutreffend), 0,58 ul (0,115 ug) Maus-IgG2a-BV421 Isotyp, 0,5 ul (0,05 ug) Maus IgG1 K Isotypenkontrolle APC, 13,2 ul PBS.
      3. Für FMO-Steuerelemente, Add-Antikörper wie in 4.4.11.1, ersetzt ein Antikörper jeweils mit PBS.
    12. bei 4 ° C inkubieren für 30 min im Dunkeln.
    13. In 200 ul Permeabilisierung Puffer. Zentrifuge, entfernen Sie den Überstand und Wirbel, wie in Schritt 4.4.8. Wiederholen Sie einmal.
    14. Die Zellen in kaltem FACS-Puffer (Volumen nach dem Instrument verwendet wird) und zu erwerben, im Idealfall sofort auf dem Durchflusszytometer.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein Schema des experimentellen Aufbaus. Figur 2 zeigt eine repräsentative Reinheitskontrolle Färbung für magnetisch isoliert naive CD4 + T - Zellen und nTregs.

B ild 3A zeigt die Durchflusszytometrie Gating - Strategie und 3B zeigt repräsentative FOXP3 und CD25 - Zytometrie Anfärbungen am Tag fließen 6 der Kultur unter den angegebenen iTreg oder Kontrollbedingungen. Nach in vitro Stimulation upregulate meisten Zellen CD25, die in Gegenwart von Rapamycin reduziert wird. Nur unter Zugabe von iTreg auslösenden Faktoren eine klare Population von FOXP3 + Zellen zeigt sich , was auch in CD25 + Zellen unter iTreg Bedingungen angereichert ist. 3C zeigt die phänotypischen Erscheinungsbild iTreg Kulturen im Mikroskop mit Zellen gesehen als dunkle Cluster vermehren. Jede i Treg Zustand zeigt eine spezifische und reproduzierbare Muster der Zellproliferation: Unter diesen Kulturbedingungen, TGF-β erhöht Proliferation leicht und ATRA erhöht die weitere Verbreitung. Zur gleichen Zeit wird die Hemmung der Proliferation von Rapamycin ist durch die stark reduzierte Clustergröße deutlich. Das mikroskopische Bild der Proliferation Stärke entspricht auch Gesamtzellzahlen (Daten nicht enthalten).

Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse der qRT-PCR - Analysen von FOXP3 mRNA Induktion in iTreg (und Kontrolle) Kulturen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Wie für FOXP3 Protein ist FOXP3 mRNA - Expression in allen iTregs höher im Vergleich stimulierten Zellen zu steuern, mit Rapamycin behandelten iTregs einem relativ niedrigen Niveau, die im Vergleich zu anderen iTregs. FOXP3 mRNA in nTregs höher ist als in iTregs.

es / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Abbildung 1: Versuchsschema für iTreg Induktion, nTreg Isolation und Treg - Analyse. Menschliche naive CD4 + T - Zellen wurden aus buffy coats isoliert und in Serum-freiem Medium mit anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper stimuliert plus 100 U / ml IL-2 für bis zu 6 Tage, entweder in Abwesenheit ( `mock Kontrollzellen ') oder Anwesenheit verschiedener Treg-induzierende Faktoren ( `iTreg') wie angegeben. nTregs werden isoliert und parallel getestet. Die phänotypische Analyse kann mittels Durchflusszytometrie und qRT-PCR erfolgen. Geändert von Schmidt, A. et al. 2016 22. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Zell Reinheit der Bevölkerung beginnen. Naïve menschliche CD 4 + T - Zellen wurden durch die Naïve CD4 T - Zell - Isolation Kit II, Mensch isoliert. Oberplatte: Naive CD4 + T - Zell - Reinheit, bezogen auf CD4, CD45RA und CD45RO, war 94 bis 98% und die Reinheit für einen repräsentativen Spender von mehr als 30 gezeigt ( `Tnaïve'). Ex vivo Treg ( `nTreg') wurden isoliert durch begrenzte Mengen an CD25 Microbeads verwenden und als positive Kontrolle für iTreg Experimente verwendet. nTreg Reinheit eines repräsentativen Spenders, basierend auf CD25 und CD4, dargestellt ist. Untere Tafel: Intrazelluläre FOXP3 Färbung (durchgeführt , wie in 3 und pre-gated an lebenden CD4 + Zellen) für naive CD4 + T - Zellen und nTregs jeweils gezeigten Zellen vom gleichen Spender wie in der oberen Tafel verwendet wird . Geändert von Schmidt, A. et al. 2016 22. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Abbildung 3: Die phänotypische Erscheinung iTregs und nTregs. Menschliche naive CD4 + T - Zellen wurden in serumfreien Medium unter den angegebenen Bedingungen. T-Zellen wurden mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper plus 100 U / ml IL-2 ( `Stim.') stimuliert. Wo angegeben, TGF-β1 ( `TGF'), Rapamycin (` Rapa'), all-trans-Retinsäure ( `ATRA') oder Butyrat zugegeben. nTregs (ex vivo isolierten peripheren Blut CD25 ++ Zellen) wurden unstimulierte links ( `unstim.') und als positive Kontrolle verwendet. Unstimulierten naiver T-Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet. (A) Am Tag 6 der Kultur wurden die Zellen gefärbt mit Oberflächen Antikörper einschließlich anti-CD25 und anti-CD4, dann mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff gefärbt und anschließend fixiert / permeabilisiert und intrazellulär mit anti-FOXP3 und Anti-CTLA-4 oder Isotyp gefärbten Fortsetzung rol Antikörper. Akquisitions- und Kompensations wurde auf einem Cyan ADP Durchflußzytometer durchgeführt und die Daten wurden mit der FlowJo Software analysiert. Die Gating-Strategie wird durch die roten Pfeile angedeutet, und das gezeigte Beispiel ist ein iTreg Probe induziert mit TGF + ATRA. (B) Zellen wurden wie in (A) gefärbt, und FOXP3 und CD25 - Expression in T - Zellen und Kontroll iTregs durch verschiedene Protokolle induziert gezeigt. Die Pseudo Plots zeigen repräsentative FOXP3 und CD25 Anfärbungen für einen Spender, auf Singulett - pre-gated, leben CD4 + Zellen , wie in (A). Der Isotyp Beispiel ist für eine iTreg gezeigt (Stim. + TGF + ATRA) Probe. (C) Repräsentative Mikroskopiebilder (40 - facher Vergrößerung) der einzelnen 96U-Plattenvertiefungen von kultivierten Zellen für 4 Tage. Dunkle Cluster von Zellen repräsentieren wuchernden Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 4
Abbildung 4: FOXP3 mRNA - Expression bei der Verwendung von verschiedenen Protokollen für iTreg Differenzierung. iTregs wurden wie in Abbildung 3 unter den angegebenen Bedingungen erzeugt werden , und zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und Zell RNA extrahiert wurde. Unstimulierten naiven T - Zellen und nicht - stimulierten nTregs, wurden am Tag 0 entnommen Proben durch qRT-PCR analysiert, und FOXP3 mRNA - Expression wurde für jede Probe zu RPL13A Expression normalisiert. FOXP3 mRNA - Expression in nicht - stimulierten naiven T - Zellen wurde auf 1 gesetzt, und mehrfache Änderung der FOXP3 mRNA berechnet wurde. Dargestellt sind Mittelwerte und den Bereich der PCR replizieren Brunnen für einen repräsentativen Spender. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die robuste Induktion von menschlichen CD4 + FOXP3 + iTregs von menschlichen naiven CD4 + T - Zellen. Es enthält ein neues Protokoll , das wir vor kurzem beschrieben, eine Kombination aus TGF-β unter Verwendung ATRA und Rapamycin, für die Induktion von iTregs mit überlegener in vitro suppressive Funktion 22. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen, ist ein weiterer Vorteil der Induktion verschiedener iTreg Populationen parallel von unterschiedlichen Protokollen, die den direkten Vergleich der Wirkungen bestimmter iTreg induzierende Faktoren ermöglicht, zusammen mit Kontrollzellen, die in Gegenwart von IL-2 allein aktiviert werden, . Die beschriebenen Protokolle ermöglichen reproduzierbare Induktion von FOXP3 mit geringer Spender Variation. Naiver CD4 + T - Zellen in diesem Protokoll sind durch magnetisch aktivierte Zellsortierung isoliert, sondern fluoreszenzaktivierte Zellsortierung ist ebenfalls möglich. Die erwartete Rendite von naiven CD4 + T - Zellen , die mit diesem Protokoll ist in der Regel zwischen 5-10%, sondern hängt stark von dem Spender (Alter) und erscheint auch niedriger, wenn hohe Anteile an Erythrozyten vorhanden sind. Wenn eine Schätzung erforderlich ist, kann PBMCs gefärbt werden (siehe Schritt 1.4) während der Monozytendepletion Schritt. Typischerweise ist die Ausbeute von naiven CD4 + T - Zellen etwa die Hälfte der "percentage naiven CD4 + T - Zellen der Lymphozyten - Gate" in der PBMC - Färbung. Dieses Protokoll verwendet begrenzte Mengen an CD25 beads 29 CD25-hoch (nTreg) Zellen zu erhalten. Diese sind jedoch nicht rein Tregs, aber diese sind nur in Tregs angereichert als Positivkontrolle verwendet werden. Wenn reine Tregs benötigt werden, sollten andere Kits verwendet werden (wie zum Beispiel in Kombination mit CD4 - Anreicherung und CD127-Depletion) oder alternativ CD25 + Zellen mit 8 ul CD25 Perlen vorangereicherte pro 10 7 Zellen und gefärbt und sortiert durch Fluoreszenz-aktivierte Zell Sortierung mit hohen CD4 + CD25 ++ Gating. Auch die Aufnahme von anderen Markern, wie beispielsweise CD127 Ausschluss, sollte berücksichtigt werden.

_content "> Es ist wichtig , dass FOXP3 ist zu prüfen, aber nicht ausreichend Treg Identität zu verleihen 30. Während iTregs verwendet werden können , bestimmte Aspekte, beispielsweise zu untersuchen, FOXP3 Regulierung, es ist jedoch wichtig zu beachten , dass iTregs von nTregs abweichen in mehreren Aspekten. Es ist daher von entscheidender Bedeutung für Kultur nTregs (idealerweise vom selben Spender stamm) parallel zu iTregs in allen Tests zum Vergleich. die Differenz zwischen nTregs und iTregs durch nur eine teilweise Überlappung der nTreg und iTreg Transkriptom veranschaulicht wird, wie gemessen in murine iTregs 31. Andere Treg Unterschrift Gene zusätzlich zu FOXP3 aus diesem Grund sollte gemessen werden, und in menschlichen Zellen Diskriminierung von aktivierungsinduzierten FOXP3 Expression zu gewährleisten. zum Beispiel sollte iTregs höhere Expression von CD25, CTLA-4 und EOS zeigen im Vergleich auf aktivierten T-Zellen, während die Expression von IFN-γ und SATB1 sollten von den hier beschriebenen Protokolle induziert in nTregs und iTregs niedrig sein, wie zuvor veröffentlicht 13. Auch auf einer genomweiten Maßstab, wurde beschrieben , dass epigenetische Muster von DNA - Methylierung und Histon - Modifikationen in murine iTregs nicht die Muster in nTregs 30 gefunden zu reflektieren. Wir haben bereits zuvor, dass durch die hier induzierte iTregs Protokolle beschrieben, im Gegensatz zu nTregs, zeigte keine TSDR Demethylierung. Dementsprechend verloren iTregs FOXP3 wenn restimuliert, aber beibehalten FOXP3 Ausdruck , wenn eine weitere, die in Gegenwart von IL-2 und ohne Restimulation 22. Interessanterweise durch ein alternatives Protokoll M2 induzierten iTregs Makrophagen mit Stände angezeigt FOXP3 Stabilität verbessert, trotz Mangel an TSDR Demethylierung und TGF-β ist ursächlich für FOXP3 Induktion 27.

Änderung der iTreginduzierenden Protokolle durch Zugabe von Verbindungen (wie Vitamin C oder Schwefelwasserstoff) , die Ten-elf Translokation (TET) Methylcytosin Dioxygenase Enzyme beeinflussen, wie 32 kürzlich beschrieben - 34, darf die DNA - Methylierung in FOXP3 Stabilisieren von beeinflussen. Auch die Stimulationsstärke und Timing hat einen Einfluss auf Foxp3 - Expression und Stabilität 35. In diesem Sinne wurde die Verwendung von bead-gekoppelter CD3 / CD28 - Antikörper anstelle von platten gebundenen Antikörper gezeigt , wenn auch 36 TSDR Demethylierung unabhängigen murine iTreg in vivo suppressive Funktion und Stabilität zu erhöhen. Ein weiterer Faktor, der als eine mögliche Quelle der Variation berücksichtigt werden muss, ist die Verwendung von Serum, das nicht definierte Faktoren, einschließlich TGF-β enthält, die auch aus Rinderquelle 100% kreuzreaktiv mit humanen Zellen ist. Ebenso kann die Quelle und der Aktivität von IL-2 drastisch die Ergebnisse FOXP3 Induktions beeinflussen.

Ein wichtiger feature von Treg ist ihre suppressive Fähigkeit, die anschließend in diesem Protokoll generiert mit iTregs getestet werden muss. Es sollte beachtet werden, dass die Unterdrückung Assays mit iTregs nicht trivial und die Literatur zu suppressive Fähigkeiten iTregs ist umstritten. Mehrere Methoden und Protokolle suppressive Funktion der menschlichen Treg anderswo 22,37 veröffentlicht wurden zur Beurteilung - 41, mit in vitro Proliferationsassays die am häufigsten verwendete basierend auf Durchflusszytometrie Auslesungen wie Verdünnung von Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) ist. Es ist wichtig, vor der Verwendung in iTregs Unterdrückungs Assays zu waschen und zu ruhen, und es muss berücksichtigt werden, dass iTregs im Gegensatz zu nTregs nicht anergischen sein können, aber sich während der Unterdrückung Assays proliferieren. Wir halten es für äußerst wichtig, zu verwenden `mock' stimulierten T-Zellen als Kontrolle Suppressorzellen den Grad der unspezifischen Unterdrückung (wie durch CTLA-4-Expression, IL-2 consum zu identifizierenption und Kultur übermäßiges Wachstum von aktivierten T-Zellen), die auf FOXP3 + Treg-spezifischen Wirkungen in keinem Zusammenhang ist, und das häufige Fehlen dieser Regelung kann auf einige Kontroversen in der Literatur beitragen. Mit dieser Steuerung definierten wir , dass nur TGF-β / ATRA / Rapa-induzierte iTregs unterdrückende Aktivität in vitro 22 angezeigt. Daraus schließen wir, dass suppressive Aktivität bezüglich (wenn auch nicht höchsten Anteil an FOXP3 + Zellen), TGF-β / ATRA / Rapa die beste Kombination von Faktoren der beschriebenen Protokolle iTregs zu induzieren. Trotzdem ist suppressive Aktivität in vitro nicht notwendigerweise unterdrückende Aktivität in vivo zu reflektieren, und in der Tat haben wir festgestellt , daß menschliche durch diese Protokolle erzeugt iTregs nicht in einem xenogenen Modell Graft - versus -host Krankheit unterdrücken hat zumindest unter den Bedingungen 22 getestet. Dies kann zu einer instabilen FOXP3 Expression in Beziehung gesetzt werden , die in iTregs auf Restimulation verloren wurde, im Einklang mit einem Mangel an TSDR Demethylierung 22

Abhängig davon, welcher Aspekt iTreg Merkmale (hoher Anteil an FOXP3 + Zellen, überlegene unterdrückende Aktivität, FOXP3 Stabilität) ist am wichtigsten für eine spezielle Fragestellung können unterschiedliche Protokolle geeignetsten sein, diese Fragen zu untersuchen, wodurch es schwierig wird die allgemein zu definieren "besten "Protokoll für die Treg Induktion. Weiterhin mehrere oben beschriebenen experimentellen subtile Unterschiede können die Ergebnisse beeinflussen und kann zu Kontroversen im Hinblick auf Phänotyp und suppressive Funktion der TGF-β-induzierte iTregs die zwischen Berichten auch bei scheinbar ähnlichen Protokollen für iTreg Generation 42 erscheinen beitragen. Beispielsweise auch innerhalb eines Labors, beobachteten wir , dass mit TGF-β und IL-2 in Serum enthaltendem RPMI Medium induziert iTregs einige suppressive Aktivität zeigten verglichen Zellen 27 zu steuern, während TGF-β / IL-2-induzierte iTregs erzeugten definierten serumfreien T - Zellenkulturmedium war nicht 22, drotz ähnliche Niveaus von FOXP3.

Zukünftige Anwendungen auf diesen Protokollen basieren sollte sich bemühen, weitere Treg Induktion Bedingungen zu optimieren, einen Phänotyp mit stabiler FOXP3 Expression zu erreichen, TSDR Demethylierung, stabilen Phänotyp ohne Umwandlung in Zytokin-produzierende Effektor-T-Zellen und optimal unterdrückende Aktivität. Die Weiterentwicklung von iTreg Induktionsprotokollen kann nützlich sein, für adoptiven Transfer in die Zukunft nähert, in welcher Therapie von Treg-Transfer für die potenzielle Behandlung von Autoimmun- und Entzündungserkrankungen vielversprechend ist.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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Immunologie Heft 118 regulatorische T-Zellen Treg CD4 + T-Zellen magnetische Zellisolierung, Cytokinen FOXP3 TGF-β IL-2 intrazelluläre Durchflusszytometrie qRT-PCR
<em>In vitro</em> Differenzierung von humanen CD4 <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup> Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 <sup>+</sup> T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll
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Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

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