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Immunology and Infection

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe la generación reproducible y el fenotipo de las células T reguladoras inducidas por el hombre (iTregs) a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro. Diferentes protocolos de inducción FOXP3 permiten el estudio de los fenotipos iTreg específicos obtenidos con los protocolos respectivos.

Introduction

Células T reguladoras CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) suprimen otras células inmunes y son mediadores críticos de la tolerancia periférica, la autoinmunidad y la prevención de la inflamación excesiva 1. La importancia de las células T reguladoras se ejemplifica por la enfermedad humana y el síndrome ligada al cromosoma X immunodysregulation poliendocrinopatía enteropatía (IPEX), en el que la pérdida de células T reguladoras debido a mutaciones en el `master' factor de transcripción caja forkhead P3 Treg (FOXP3) conduce a la enfermedad autoinmune sistémica grave, letal a una edad temprana. Sin embargo, las células T reguladoras actuar como una espada de doble filo en el sistema inmunológico, ya que también pueden obstaculizar la inmunidad antitumoral en ciertas configuraciones 2. La manipulación terapéutica del número y función de Treg es, por tanto, objeto de numerosas investigaciones clínicas. En el cáncer, agotamiento de las células T reguladoras puede ser deseable y algo de éxito de los enfoques clínicos alienta además a la investigación 3. En las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, además de los efectos terapéuticos de células T reguladoras en sevemodelos de enfermedad del ratón ral, los últimos primeros ensayos en el hombre de la transferencia adoptiva de Treg para prevenir la enfermedad injerto contra -host (EICH) 4 - 7 y para evaluar la seguridad en el tratamiento de la diabetes tipo 1 8 mostró resultados muy prometedores.

De origen natural Treg (nTregs) comprenden tTregs del timo derivados y pTregs periférica inducida, con funciones esenciales no redundantes en el mantenimiento de salud 9 - 11. Sin embargo, los números nTreg son limitados, fomentando el enfoque complementario de inducir Tregs (iTregs) in vitro a partir precursores de células T ingenuas 12. Aún así la estabilidad de iTregs, presumiblemente debido a la falta de la desmetilación en la llamada región desmetilado Treg-específico (TSDR) en el locus del gen FOXP3 13, sigue siendo una preocupación y varios estudios indican que in vivo inducida por células T reguladoras son más estables 14.

Hasta la fecha, FOXP3 sigue siendo la mejor proteína MArker para Tregs pero no es absolutamente específico porque las células CD4 + CD25- T convencionales humanos transitoriamente expresan niveles intermedios de FOXP3 tras la activación 15,16. Aunque se han hecho progresos significativos en el esclarecimiento de la regulación de la expresión de FOXP3, aún queda mucho por descubrir en cuanto a la inducción, la estabilidad y la función de FOXP3 en particular en las células humanas. A pesar de las diferencias a nTregs, in vitro inducida FOXP3 + células T CD4 + se pueden utilizar como un sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de inducción FOXP3 y como punto de partida para desarrollar protocolos en el futuro que permiten la generación de iTregs que son más similares en el vivo generada células T reguladoras, que podría ser aplicable para las estrategias de transferencia adoptiva en el futuro.

No existe un protocolo `standard' oro para inducir iTregs humanos y los protocolos actuales se han desarrollado sobre la base de condiciones que imitan Treg que inducen in vivo: la interleucina 2 (IL-2) Y la señalización de factor de crecimiento transformante β (TGF-β) son cruciales para la inducción FOXP3 in vivo 17, y el ácido trans-retinoico (ATRA) - que se produce in vivo por las células dendríticas asociados al intestino - se utiliza con frecuencia para mejorar la inducción FOXP3 in vitro 18-21. Hemos desarrollado protocolos de Treg inductores humanos adicionales utilizando butirato 22, un ácido graso de cadena corta derivado de la microbiota intestinal que recientemente ha presentado un incremento murino Treg inducción 23,24. También establecimos recientemente un nuevo protocolo para la generación de iTregs con función supresora superior en vitro mediante el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina 22, siendo este último un objetivo de mamíferos clínicamente aprobado de la rapamicina (mTOR) inhibidor que es conocido por promover FOXP3 de mantenimiento durante la expansión de Treg humanos 25,26.

Este método describe la reproducible enla generación in vitro de las células CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando un conjunto de condiciones diferentes, y su posterior fenotipificación mediante citometría de flujo y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) para revelar patrones específicos del protocolo de expresión de FOXP3 y otras firmas de moléculas Treg tales como CD25, CTLA-4, EOS, así como la represión de IFN-γ y expresión SATB1 22. Las poblaciones celulares generadas se pueden utilizar para ensayos funcionales respecto a la actividad de supresión o para estudios moleculares, ya sea en relación con los reguladores generales FOXP3 o para estudiar los efectos específicos a ciertos compuestos, tales como butirato o rapamicina. Una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación de Treg es altamente relevante para futuras estrategias terapéuticas en autoinmunidad o cáncer para apuntar específicamente a las moléculas que participan en la generación y la función de Treg.

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Protocol

Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) fueron recién aisladas de capas leucocitarias de donantes sanos anonimizados comprados en el Hospital Universitario Karolinska, Suecia. permiso ético para los experimentos se obtuvo de la Junta Regional de Revisión Ética en Estocolmo (reģionālā etikprövningsnämnden i Stockholm), Suecia (número de registro: 2013/1458/31/1).

1. T aislamiento de células de la sangre periférica

  1. Aislamiento de PBMC
    1. Pre-lay 15 ml de medio de centrifugación de densidad (como Ficoll) solución en tubos de 50 ml (5 tubos por capa leucocitaria). Pre-caliente a temperatura ambiente.
    2. Llenar la capa leucocitaria con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (temperatura ambiente) a 180 ml. Si se utiliza sangre fresca, diluir la sangre con un volumen igual de PBS.
    3. tubo de inclinación hacia un lado y medio de centrifugación de densidad lentamente superposición con ~ 35 ml de sangre diluida por tubo. Añadir la sangre con mucho cuidado, sin ningún tipo de mezcla de la centrifugación de densidad medfase ium y la capa de sangre.
    4. Centrifugar 20 minutos a 1150 xg a temperatura ambiente sin freno. Operar la centrífuga sin freno y, si es posible con una baja a la aceleración medio para evitar la mezcla de las capas.
    5. Sacar el anillo blanco que contenía las PBMC entre el medio de densidad de centrifugación y la fase de plasma. La transferencia a un nuevo tubo de 50 ml (1 vez con 5 ml pipeta y 2 veces con 2 ml de pipeta de plástico-Pasteur). Tomar tan poco como sea posible de plasma y mediana densidad de centrifugación. No toque el sedimento de eritrocitos rojo.
    6. Lavar las PBMC. Dividir las PBMC en tubos de 50 ml (4 tubos por capa leucocitaria). Llenar cada 50 ml con PBS.
    7. Centrifugar 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
    8. Retirar y desechar el sobrenadante, las células en la piscina 1 tubo con 10 ml de suero de ternera fetal RPMI / 10% (FCS) al medio y volver a suspender bien. Si son grupos de células presentes, células de la cepa a través de un filtro de células de 40 micras.
    9. Transferir las células en el matraz de cultivo celular T175 para el anuncioherent células. Enjuague tubos con 40 ml de medio y se combinan con las células (50 ml total). Si es necesario, retirar una alícuota para análisis de citometría de flujo (véase el paso 1.4). Por lo general, las células T CD4 + comprenden de aproximadamente 30 a 40% de las células en la puerta de linfocitos, y las células T vírgenes comprenden de aproximadamente 30 a 60% de las células T CD4 +, dependiendo del donante.
    10. Se incuban las células en la colocación de matraz durante 45 a 90 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Este paso se agotan los monocitos por adherencia plástica. No es obligatorio, pero aumentará el rendimiento de las células T porcentual por cantidad de PBMC en los siguientes pasos.
    11. Resuspender las células (en los 50 ml de medio en el matraz) y enjuague capa de células en el fondo del matraz bien. Distribuir las células por igual en dos tubos de 50 ml (los tubos anteriores se pueden volver a utilizar para el mismo donante). Enjuague matraz con 50 ml de medio fresco RPMI / 10% FCS, y la transfiere en partes iguales en los mismos 2 tubos.
      NOTA: Las CMSP se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C con tubos que pone enel lado, o, idealmente, utilizar directamente para el aislamiento de células T.
  2. nTreg El aislamiento por clasificación de células activadas-Magnética
    1. Preparar tampón de aislamiento: 0,5% (w / v) de albúmina de suero humano y EDTA 2 mM en PBS. Siempre mantenga tampón a 4 ° C. Alternativamente a la albúmina humana, el uso de albúmina bovina.
    2. Volver a suspender las PBMC y contar con un contador de células automático o manual en presencia de azul de tripano (no cuentan pequeñas plaquetas). Si se observan grupos de células, células de la cepa a través de un filtro de células de 40 micras.
    3. PBMCs centrifugar a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Resuspender las células (con pipeta 1 ml) en 90 l de tampón de aislamiento por 10 7 PBMCs para obtener una suspensión de células individuales. Mantener las células en los originales tubos de 50 ml (2 tubos por capa leucocitaria).
    5. Añadir 2 l perlas CD25 por 10 7 células, mezclar e incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
    6. Rellenar con PBS a 30 ml. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 46; C.
    7. Preparar columnas LS (2 por capa leucocitaria): se equilibran con 3 ml de tampón de aislamiento, y descartan fluya a través. Los tubos pueden ser reutilizados para enjuagar más columnas.
    8. Resuspender las células en 3 ml de tampón de aislamiento por tubo (con 1 ml de la pipeta). La transferencia de células a LS columna, y recogen el flujo a través de nuevos tubos de 15 ml.
    9. Enjuagar los tubos de 50 ml con 2 ml de tampón de aislamiento de cada uno. Transferencia de disolución tampón de enjuague a las columnas.
    10. Lavar 2x columna con 3 ml de tampón de aislamiento de cada uno. Siempre espere hasta que la columna se detuvo goteo, antes de añadir cualquier nuevo líquido. fluya a través de la tienda a 4 ° C para las etapas posteriores.
    11. Retirar la columna del imán. Eluir 2x con 3 ml de tampón de aislamiento por columna en 15 ml de tubo.
      NOTA: El eluato de 2 columnas por donante se puede combinar. No moje la columna en el líquido.
    12. Preparar y equilibrar las nuevas columnas LS (1 columna por la capa leucocitaria). Transferir el eluato de 1.2.11 a la columna. El flujo a través se puede descartar. Después de eluato tiene passed través de la columna, enjuague tubo y lavar 3x columna con 3 ml de tampón de aislamiento.
      NOTA: La segunda columna es crucialmente necesario para aumentar la pureza.
    13. Retirar la columna del imán. Eluir CD25 ++ 2x "nTregs" con 3 ml de tampón de aislamiento.
    14. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
    15. Lavar las células con 15 ml de medio de cultivo de células T, se centrifuga a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
    16. Resuspender las células en 0,5 ml de medio de cultivo de células T, suplementado con 100 UI / ml de IL-2, cada uno. La transferencia de células a placas de 24 pocillos. tubo de enjuague con 0,5 ml de medio (+ 100 UI / ml de IL-2) y se combinan en una placa de 24 pocillos.
    17. Contar nTregs (como en el paso 1.2.2). El rendimiento es generalmente cerca de 1-4 x 10 6 células T reguladoras por capa leucocitaria. Ajuste la densidad de células T reguladoras a 1-2 x 10 6 células / ml con medio de cultivo celular T + 100 UI / ml de IL-2.
    18. Se incuban las células T reguladoras a 37 ° C / 5% de CO2 hasta su uso.
    T indiferenciadas CD4 + de aislamiento de células mediante clasificación de células activadas-Magnética
    NOTA: Tome el flujo a través del paso 1.2.8-1.2.10 para proceder con el aislamiento de células. Alternativamente, si no se aislaron nTregs, proceder directamente a partir de PBMCs.
    1. Combinar 2 tubos por los donantes de PBMC-agotado Treg en 50 ml tubo. Rellenar con PBS a 50 ml a temperatura ambiente.
    2. PBMCs centrifugar a 200 g durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Retirar y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 50 ml de PBS.
    3. Repita el paso 1.3.2 dos veces.
      NOTA: Los lavados con PBS son cruciales para la eliminación de las plaquetas, que no puedan ser eliminadas con el siguiente kit de aislamiento negativo. Las plaquetas permanecen en el sobrenadante a esta centrifugación a baja velocidad. agotamiento de plaquetas se puede controlar en los pasos individuales en un portaobjetos de microscopio. Los pasos tienen que ser realizadas con PBS y centrifugados a temperatura ambiente.
    4. Volver a suspender las PBMC en 50 ml de PBS. Recuento de células como en el paso 1.2.2.
    5. PBMCs centrifugar a 450 g durante 10 min a 4 ° C. Desechar células sobrenadante y resuspender en tampón de aislamiento 40 l (4 ° C) por 10 7 células.
    6. Añadir 10 l de T naive CD4 + de la célula de coctel Biotina-Anticuerpo II por 10 7 células.
    7. Mezclar e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
    8. Lavar las células mediante la adición de 40 ml de PBS (4 ° C), y se centrifuga a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 80 l de tampón de aislamiento por 10 7 células.
    9. Añadir 20 l de microperlas anti-biotina por 10 7 células. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
    10. Llenar hasta 50 ml con PBS frío y centrifugar 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
    11. Preparar columnas LS (se equilibran con 3 ml de tampón de aislamiento). Para evitar la sobrecarga de la columna, utilizar una columna de como máximo 250 x 10 6 PBMCs, o menos si PBMCs contienen muchas células rojas de la sangre.
    12. Aspirar el sobrenadante y resuspender cells en tampón 3 ml de aislamiento. La transferencia de células a la columna LS. Recoger el flujo a través, que contiene las células T CD4 + vírgenes, en tubos de 15 ml.
    13. Enjuague el tubo con tampón de aislamiento 2 ml. Transferir a la columna.
    14. 3x Lavar la columna con 3 ml de tampón de aislamiento. Siempre espere hasta que la columna se detiene el goteo, antes de añadir cualquier nuevo líquido.
    15. Tome el flujo a través (células T CD4 + no tratados previamente) y centrifugar 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Las columnas pueden ser descartados.
    16. Aspirar el sobrenadante por completo. Lavar las células con 15 ml de medio, de centrifugación 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante por completo.
      NOTA: tampón de aislamiento contiene EDTA, que quela iones de calcio y por lo tanto afecta la activación de células T. Antes de que los ensayos de estimulación, quitar el tampón de aislamiento completamente y lavar las células dos veces con 15 ml de medio.
    17. Resuspender las células en medio de cultivo de células T a 2-3 x 10 6 células por ml. células de descanso en su caso frasco or bien durante la noche en la incubadora. Si se utilizan células directamente para los ensayos de estimulación, ellos lavar una vez más con medio.
  3. Control de pureza de tinción
    1. Tome ~ 50.000 células (Tnaïve; nTreg; PBMCs) cada una, en 20 l.
      NOTA: Si tanto Tnaïve y el panel nTreg deben ser manchado, tomar 2 muestras cada una.
    2. Preparar 2x premezcla concentrada de anticuerpo (en PBS) de acuerdo con el instrumento, por ejemplo: El panel Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Para el panel de Treg, reemplace CD45RO-PE con CD25-PE, 1:10.
      NOTA: Sólo ciertos anticuerpos CD25, que reconocen diferentes epítopos que los CD25-microperlas, se puede utilizar para teñir nTregs aisladas con microperlas CD25.
    3. Añadir 20 l de premezcla de anticuerpos a 20 células mu l. También hay que preparar coloraciones individuales para cada fluorocromo (utilizando una muestra que contiene células positivas, por ejemplo, PBMC) y una muestra sin teñir, por citometría de flujo settings y compensación.
    4. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    5. Llenar cada muestra con 200 l de PBS y centrifugar 450 g durante 5-10 minutos.
    6. Recoger células en células activadas por fluorescencia (FACS) tampón (= tampón de aislamiento sin EDTA) y analizar por citometría de flujo. La pureza de las células T CD4 + vírgenes suele ser> 95% (véase la Figura 2).

2. La inducción de Treg Cultura

  1. Preparación de estímulo de los medios y las placas
    1. Preparar y medio de cultivo celular T pre-calentamiento: medio hematopoyético-libre de suero suplementado con 2 mM L-alanil-L-glutamina.
    2. Preparar citoquinas, anticuerpos estimulación y concentraciones madre de compuesto.
      1. Preparar IL-2 solución madre: 400.000 UI / ml en ácido acético-filtrada estéril (con filtro resistente al ácido) 100 mM (167 mg / ml si la actividad del lote utilizado es 2.400 UI por 1 g; confirmar con el proveedor de). Alícuota de unión esterilizada tubos de 0,5 ml baja en proteínas, sellar con Parafilm, se congela en hielo seco y almacenar a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo o -20 ° C durante un máximo de 3 meses.
      2. Prepare el TGF-β1 solución madre (10 mg vial, sin soporte): Polvo Centrífuga TGF-β1 (1.000 xg 3 min), añadir 100 l de HCl 4 mM (esterilizada por filtración con filtro resistente al ácido) para preparar la solución madre con 100 g / ml, permitir que se disuelva completamente; vórtice. Alícuota de 5 l cada uno para esterilizar unión a tubos de 0,5 ml baja en proteínas, sellan con Parafilm, se congelan en hielo seco y almacenar a -80 ° C durante un máximo de 6 meses.
      3. Preparar ATRA solución madre: Disuelva el polvo a 20 mg / ml (66,6 mM) en DMSO. Preparar una solución madre de 10 mM por dilución adicional en alícuotas de DMSO y almacenar, protegido de la luz, a -80 ° C hasta por 1 año. ATRA es sensible a la luz, el calor y el aire.
      4. Preparar la solución de rapamicina existencia: 1 mg / ml (1,11 mM) en DMSO, almacenar en alícuotas a -80 ° C durantehasta 1 año.
      5. Preparar una solución de sodio butirato de almacén: M (ml 0,1 mg /) stock 0,908 en H estéril ultrapura 2 O y filtro estéril. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
    3. Preparar 4x premezclas concentradas (50 l por pocillo) en medio de cultivo de células T como en la Tabla 1.
    4. El día anterior, placas de capa con anticuerpo anti-CD3. Escudo deseado número de pozos de la placa de U 96 pocillos con 5 mg / ml de anticuerpo anti-CD3 en PBS, 65 l / pocillo. Envolver la placa con papel de aluminio y se incuba durante la noche a 4 ° C.
      NOTA: No utilice los pozos de margen de placas de 96 pocillos. pozos más grandes pueden ser utilizados, pero los pocillos en forma de U facilitar el uso de los mismos números de células por área a través de experimentos. Si se necesitan más células, aunar la cantidad necesaria de pozos después del cultivo. Por lo general, después de 4-6 días de expansión, 2 pozos cada una de las muestras son suficientes para el análisis de citometría de flujo y análisis de ARN.
      1. En el día de la siembra, poco antes de chapado, quitar Antisolución CD3 de los pozos. Llenar los pocillos con 200 l / pocillo de PBS. Retirar PBS. Repetir el lavado con 200 l / pocillo de PBS. Retirar PBS por completo y utilizar placas inmediatamente.
    5. Preparar placas (no usar pozos de margen):
      1. Para cada pocillo, se añaden 50 l de 4x anti-CD28 / IL-2 de premezcla (a excepción de células "no estimuladas", añadir T medio de cultivo celular), 50 l de 4x TGF-β1 premezcla (para todos los iTregs) o cultivo de células T 50 l medio para la "única estimulación" falso control, 50 l 4x ATRA, ATRA / rapamicina o premezcla butirato (en su caso) o medio
      2. Llenar todos los pocillos vacíos, incluyendo los pozos de margen, con 200 l de PBS. Placas pre-calentamiento a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Preparar las células T vírgenes para la siembra
    1. Después de las células en reposo, traslado al tubo de 15 ml, enjuague frasco / pozos con pre-calentado medio de cultivo de las células T y la piscina al tubo. Llenar el tubo de 15 ml con medio de cultivo celular T. </ Li>
    2. centrifugar las células a 450 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    3. Retire medio y tomar las células en medio fresco, pre-calentado T de cultivo celular a una densidad de 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Recuento de células como en el paso 1.2.2 y ajustar la densidad, si es necesario.
    4. Añadir células a las placas de estimulación preparados (véase 2.1), 50 células l / pocillo (110,000-130,000 células / pocillo). Cada pocillo debe contener ahora un volumen total de 200 l.
    5. Envolver las placas en papel de aluminio para proteger ATRA de la luz; incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante períodos de tiempo deseados.
  3. Supervisar Treg inducción Cultura
    1. Supervisar las culturas Treg por microscopía de luz (40X). Desde aproximadamente el día 2 a 3, pequeños grupos de células en proliferación deben ser visibles, que se funden en grupos más grandes en puntos de tiempo posteriores. Cultivos desarrollados con rapamicina generalmente crecen menos. Véase también la figura 3.
    2. En los puntos de tiempo deseados, tomar muestras de ARN de correoXtraction o citometría de flujo fenotipificación (ver abajo). Para posteriores del tiempo con la proliferación celular, 1 así cada uno es suficiente, de lo contrario tomar de 1 x 10 5 -1 x 10 6 células cada una de ARN y 3 x 10 5 -1 x 10 6 células por citometría de flujo.
  4. La evaluación de FOXP3 Estabilidad
    1. Para evaluar la estabilidad del fenotipo iTreg como se describió previamente 22,27, lavar iTregs dos veces con medio de cultivo de células T, y iTregs de cultivo adicionales en medio de cultivo de células T, ya sea sin o con anti-CD3 y anti-CD28 re-estimulación como se describe en 2.1 y 2.2 . Añadir citoquinas, tales como 50 UI / ml de IL-2, para estudiar su influencia sobre la estabilidad de FOXP3.
    2. En los puntos de tiempo deseados, tomar muestras para la extracción de RNA, citometría de flujo fenotipificación (ver más abajo), y el análisis de metilación como se describe TSDR 22,28.

3. Análisis fenotípico de iTregs de QRT-PCR

  1. Preparación deLas muestras
    1. En los puntos de tiempo deseados, tomar de 1 x 10 5 a 1 x 10 6 células por muestra para la extracción de RNA. La transferencia de células a un tubo de 1,5 ml RNasa libre, y se centrifuga a 500 g durante 5 min.
    2. Si es necesario, extraer parte del sobrenadante y congelar para el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o análisis similar. Extraer el sobrenadante restante completamente a partir de células. Proceder directamente a la extracción de RNA o congelar sedimento de células en hielo seco y almacenar a -20 ° C a -80 ° C durante un máximo de 2 semanas.
    3. Extracto de ARN y realizar QRT-PCR para FOXP3 y un gen de mantenimiento (tales como RPL13A) de acuerdo con protocolos estándar. Además, medir la expresión de otros genes de la firma Treg (por ejemplo `Treg up' genes IL2RA, CTLA4, IKZF4, y` Treg abajo' genes IFNg, SATB1).

4. El análisis fenotípico por citometría de flujo

NOTA: Este protocolo está optimizado para la tincióning en formato de placa de 96U con 3 x 10 5 -1 x 10 6 células. Si hay menos células por pocillo, comenzar con varios pozos y piscina como se describe a continuación.

  1. Reestimulación de células (Opcional)
    1. Si se desea la tinción de citocinas intracelulares, las células de pulso con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) / ionomicina en presencia de un inhibidor de transporte de proteínas.
      NOTA: Este procedimiento no influye en la expresión de FOXP3 en cultivos iTreg descritos anteriormente, pero otros marcadores puede cambiar - por ejemplo, CD4 es downregulated.
    2. Preparar 10x Brefeldina A / PMA / ionomicina premezcla (20 l por pocillo) en medio de cultivo de células T: Brefeldina una solución madre 1: 100, ionomicina (Stock 5 g / l) 1: 1300, PMA (Stock 12,35 g / l, pre -dilute 1: 1235) 1: 100 agotadas previamente diluido.
    3. 4 horas antes de la tinción, añadir 20 l Brefeldina A / PMA / ionomicina 10x mezcla por pocillo para obtener concentraciones finales de 1: 1000 Brefeldina A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomicina, 10 ng / ml de PMA.
    4. Incubar durante 4 horas a 37 ° C / 5% de CO 2
  2. tinción de la superficie
    NOTA: El panel sugiere aquí es una sugerencia; otros paneles pueden ser utilizados en función de los antígenos de interés y la configuración del instrumento.
    1. PBS enfriar en hielo. Preparar tampón FACS (PBS con albúmina de suero humano al 0,5%, HSA) y enfriar en hielo. BSA o FBS se pueden utilizar como una alternativa a la HSA.
    2. células re-placa en placa de tinción: suspender las células con una pipeta y transferir las células a una nueva placa de 96U, dejando así libre alrededor de uno cada pocillo (para evitar efectos colaterales en el procedimiento de tinción más adelante). Si están presentes en el pozo original menos el número de células deseadas, eliminar parte del sobrenadante antes de la resuspensión, y la piscina varios pozos en una tinción también.
    3. Centrifugar la placa 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Eliminar el sobrenadante. Derrama sobrenadante en caja de desechos, deje el plato bocaabajo e inmediatamente (sin vuelta atrás de la placa) toque la placa una vez sobre papel absorbente. A continuación, gire inmediatamente de nuevo la placa. placa de vórtice para volver a suspender las células en el líquido residual.
    5. Añadir 25 l de premezcla tinción de la superficie (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 en tampón FACS) y resuspender.
      NOTA: También se incluyen coloraciones individuales para cada uno de los fluorocromos utilizados con muestras que contienen células positivas para el antígeno respectivo; e incluir una muestra sin teñir. Estos serán necesarios para la configuración de compensación de instrumentos. Como alternativa, utilizar bolas de compensación.
    6. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
    7. Añadir 200 l de PBS, la placa centrífuga 400 xg durante 10 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    8. Repita el paso 4.2.7 dos veces.
  3. La tinción de viabilidad
    NOTA: tinción de viabilidad es indispensable, ya que después de la fijación / permeabilización de las células muertas no pueden ser excluidos por suficientementeFSC / SSC y puede dar lugar a señales inespecíficas. Un colorante viabilidad fijable tiene que ser utilizado.
    1. Resuspender las células en 130 l viabilidad mancha de premezcla (viabilidad corregible tinte eFlour780 1: 1.400 en PBS) y las células inmediatamente resuspender con la pipeta multicanal.
      NOTA: También incluye un solo tinción para el tinte de viabilidad que contiene células muertas, por ejemplo, células T no estimuladas cultivadas durante varios días o matar las células mediante la aplicación de calor como por las instrucciones del fabricante. Estos serán necesarios para la compensación.
    2. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
    3. placa Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante como en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    4. Rellenar con 200 l de tampón FACS. Repita el paso 4.3.3.
    5. Rellenar con 200 l de PBS. Repita el paso 4.3.3.
  4. La tinción intracelular con FOXP3 tinción de autonomía ajustado
    1. Para cada pocillo, se preparan: tampón / Perm 150 l Fix (diluir Fix / Perm concentrate 1: 4 con diluyente); 850 permeabilización de amortiguación l 1x (diluida 10x tampón de permeabilización 1:10 con ultra pura H 2 O).
    2. Después de agitación con vórtex, volver a suspender las células en tampón / Perm 150 l Fix e inmediatamente volver a suspender con pipeta. Es importante para volver a suspender inmediatamente para evitar la fijación de grupos de células.
      Precaución: La fijación tampón contiene paraformaldehído y debe manejarse y desecharse de forma apropiada.
    3. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
    4. Añadir 100 l de PBS frío. Centrifugar a 850 xg durante 10 min a 4 ° C.
      NOTA: A partir de este paso en adelante, la velocidad de centrifugación se incrementa para evitar la pérdida de las células. Tras la fijación, las células se vuelven invisibles y se debe tener cuidado para eliminar los sobrenadantes como se describe en el paso 4.2.4 e inmediatamente después de la centrifugación ha terminado para minimizar la pérdida de las células.
    5. Aspirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
      NOTA: La tinción puede ser pausado en este paso; eneste caso, se lavan las células dos veces con 200 l de PBS; a continuación, tomar hasta en 250 l de PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz. Las células se pueden almacenar durante algunos días, y luego proceder con la permeabilización. Sin embargo, los resultados óptimos se logran cuando continuó directamente a la permeabilización.
    6. Después de agitación con vórtex, se añaden 200 l de tampón de permeabilización. Centrifugar a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    7. Añadir 200 permeabilización de amortiguación l para volver a suspender.
      NOTA: A continuación, las muestras se pueden dividir en tinción intracelular y la muestra de control de isotipo (quitarle la mitad de cada muestra). Si el número de células son limitantes, una muestra agrupada isotipo se puede preparar (quitarle 10-20 l de cada muestra y piscina). También, se pueden tomar muestras de fluorescencia-menos-uno los controles (FMO).
    8. Centrifugar a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    9. Resuspender pellet en44 l de tampón de permeabilización más 1 l de suero de ratón normal (premezclado) para bloquear la unión no específica.
      NOTA: Esto se aplica si los anticuerpos usados ​​en el siguiente paso son de isotipo murino. Si se utilizan otros anticuerpos, tales como derivados de rata,, incluya el suero apropiado para bloquear (por ejemplo, suero de rata).
    10. Se incuba a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad.
    11. Añadir anticuerpos:
      NOTA: Investigar las concentraciones de anticuerpos específicos para los Lotes. Si no se hace en el paso 4.2 con anticuerpos contra antígenos de la superficie (por ejemplo, CD4) con los respectivos fluorocromos, también incluir coloraciones individuales para cada uno de los fluorocromos utilizados con muestras que contienen células positivas para la compensación.
      1. Añadir 15 l de premezcla de anticuerpos a las muestras (excepto para las tinciones individuales, sin teñir muestras, muestras de control de isotipo y controles FMO): Piensos compuestos por muestra: 0,7 l (0,35 mg) anti-interferón gamma (IFN-γ) FITC (si es aplicable después de la re-estimulación ),2.3 l (0,115 g) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 l (0,05 mg) Anti-FOXP3-APC, 10 l de PBS.
      2. Para isotipo muestras de control, añadir 15 l de premezcla de anticuerpos de isotipo, usando las mismas cantidades de anticuerpos como para los anticuerpos utilizados en 4.4.11.1: Piensos compuestos por muestra: 0,7 l (0,35 mg) FITC control de isotipo IgG1 de ratón K (si procede), 0,58 l (0,115 g) IgG2a-BV421 ratón isotipo, 0,5 l (0,05 mg) de control de isotipo IgG1 de ratón K APC, 13,2 l de PBS.
      3. Para los controles FMO, añadir anticuerpos como en 4.4.11.1, en sustitución de un anticuerpo cada uno con PBS.
    12. Se incuba a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
    13. Añadir 200 l de tampón de permeabilización. Centrífuga, eliminar el sobrenadante y agitar como en el paso 4.4.8. Repita una vez.
    14. Resuspender las células en tampón FACS frío (volumen de acuerdo con el instrumento utilizado) y adquirir, a ser posible inmediatamente, en el citómetro de flujo.

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Representative Results

La Figura 1 muestra un esquema de la configuración experimental. La Figura 2 muestra una tinción de control de pureza representativo de las células T CD4 + vírgenes magnéticamente aisladas y nTregs.

FIGURA 3A muestra la citometría de flujo gating estrategia y la Figura 3B muestra representativa FOXP3 y CD25 citometría de flujo coloraciones en el día 6 de cultivo en las condiciones iTreg o control indicadas. Tras la estimulación in vitro, la mayoría de las células upregulate CD25, que se reduce en presencia de rapamicina. Sólo bajo adición de factores de iTreg inductores, una población clara de células FOXP3 + se hace evidente, que también está enriquecido en CD25 + células en condiciones iTreg. Figura 3C muestra la apariencia fenotípica de las culturas iTreg en el microscopio con la proliferación de células visto como racimos oscuros. cada i condición Treg muestra un patrón específico y reproducible de la proliferación celular: Bajo estas condiciones de cultivo, el TGF-β aumenta la proliferación ligeramente, y ATRA aumenta aún más la proliferación. Al mismo tiempo, la inhibición de la proliferación por la rapamicina es evidente por el tamaño del clúster fuertemente reducida. El aspecto microscópico de la fuerza proliferación también se corresponde con el total de células (datos no incluidos).

Figura 4 muestra los resultados representativos de QRT-PCR análisis de la inducción FOXP3 mRNA en iTreg (y control) los cultivos en diferentes puntos temporales. En cuanto a la proteína FOXP3, la expresión de FOXP3 mRNA es mayor en todas las iTregs en comparación con las células control estimuladas, con iTregs rapamicina tratada que tiene niveles relativamente bajos en comparación con otros iTregs. FOXP3 mRNA en nTregs es mayor que en iTregs.

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Figura 1: Esquema para la inducción experimental iTreg, el aislamiento nTreg, y el análisis de Treg. Se aislaron las células T CD4 + vírgenes Humanos de capas leucocitarias y se estimularon en medio libre de suero con las células 100 U / ml de IL-2 durante un máximo de 6 días, ya sea en ausencia ( `simulacros de control de anti-CD3 y anti-CD28 más ') o presencia de diferentes factores de Treg inductores ( `iTreg') como se indica. nTregs se aíslan y se ensayan en paralelo. El análisis fenotípico se puede hacer por citometría de flujo y QRT-PCR. Modificado de Schmidt, A. et al. 2016 22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Cell pureza a partir de poblaciones. CD humano ingenuo 4 + T células fueron aisladas por el Naïve T CD4 kit de aislamiento de la célula II, humano. Panel superior: la pureza de células T ingenuas CD4 +, con base en CD4, CD45RA y CD45RO, fue de 94 a 98% y se muestra la pureza de un donante representativo de más de 30 ( `Tnaïve'). Ex vivo células T reguladoras ( `nTreg') se aislaron mediante el uso de cantidades limitadas de microperlas CD25 y se utilizó como control positivo para los experimentos iTreg. nTreg pureza de un donante representativo, basado en CD25 y CD4, se muestra. Panel inferior: tinción intracelular FOXP3 (realizada como en la Figura 3 y pre-cerrada en vivo las células CD4 +) se muestra para las células T CD4 + vírgenes y nTregs respectivamente, utilizando células del mismo donante como en el panel superior. Modificado de Schmidt, A. et al. 2016 22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figura 3
Figura 3: El aspecto fenotípico de iTregs y nTregs. Células T CD4 + vírgenes humanos se cultivaron en medio libre de suero en las condiciones indicadas. Las células T se estimularon con anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 más 100 U / ml de IL-2 ( `Stim.'). Donde se indique, se añadieron TGF-β1 ( `TGF'), rapamicina (` Rapa'), el ácido trans-retinoico ( `ATRA') o butirato. nTregs (aislado células ex vivo periférica CD25 sangre ++) se dejó sin estimular ( `unstim.') y se utiliza como control positivo. células T vírgenes no estimuladas se utilizaron como control negativo. (A) En el día 6 de cultivo, las células se tiñeron con anticuerpos de superficie, incluyendo anti-CD25 y anti-CD4, y luego teñidas con colorante de viabilidad se puede fijar y posteriormente fijos / permeabilizadas y manchadas intracelular con anti-FOXP3 y anti-CTLA-4 o isotipo cont anticuerpos Rol. Adquisición y compensación se realizó en un flujo de Cyan ADP citómetro y los datos se analizaron con el software FlowJo. La estrategia gating se indica por las flechas rojas, y el ejemplo que se muestra es una muestra iTreg inducida con TGF + ATRA. (B) Las células se tiñeron como en (A), y se muestra la expresión de FOXP3 y CD25 en las células T de control y iTregs inducidos por los diferentes protocolos. Las parcelas PseudoColor muestran FOXP3 y CD25 tinciones representativos de un donante, previamente cerrada en singlete, en vivo las células CD4 + como en (A). El ejemplo de isotipo se muestra para un iTreg (estim. + + ATRA TGF) de la muestra. (C) Imágenes de microscopía representativos (ampliación 40X) de los pozos de 96U de placa individuales de células cultivadas durante 4 días. racimos de células oscuras representan las células proliferantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: la expresión del ARNm de FOXP3 en el uso de diferentes protocolos para la diferenciación iTreg. iTregs se generaron como en la figura 3 en las condiciones indicadas, y en los puntos de tiempo dados, se tomaron muestras de células y se extrajo el ARN. Células no estimuladas naïve T y nTregs no estimuladas, se tomaron muestras en el día 0. Las muestras se analizaron mediante qRT-PCR, y la expresión de FOXP3 mRNA se normalizó a la expresión RPL13A para cada muestra. FOXP3 expresión de ARNm en las células T vírgenes no estimuladas se establece en 1, y el doble cambio de FOXP3 mRNA se calculó. Se muestran los valores medios y el alcance de la PCR se replican pozos para un donante representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito permite la inducción robusto de CD4 humano + FOXP3 + iTregs de células T CD4 + vírgenes humanos. Incluye un nuevo protocolo que describimos hace poco, el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina, para la inducción de iTregs con superiores función supresora in vitro 22. En comparación con otros protocolos publicados, otra ventaja es la inducción de diferentes poblaciones iTreg en paralelo por diferentes protocolos, lo que permite la comparación directa de los efectos de ciertos factores iTreg inductores, junto con las células de control que se activan en presencia de IL-2 sola . Los protocolos descritos permiten la inducción reproducible de FOXP3 con la variación de pocos donantes. Las células T CD4 + vírgenes en este protocolo se aíslan mediante clasificación de células activadas-magnética, pero la clasificación de células activadas por fluorescencia también es posible. El rendimiento esperado de las células T CD4 + vírgenes con este protocolo es típicamente entre 5-10%, sino que depende en gran medida del donante (edad) y aparece también más bajo cuando las altas fracciones de eritrocitos están presentes. Si se necesita una estimación, las PBMC se pueden teñir (véase el paso 1.4) durante la etapa de agotamiento de monocitos. Típicamente, el rendimiento de las células T CD4 + vírgenes es aproximadamente la mitad de las "células ingenuas porcentuales T CD4 + de la puerta de linfocitos" en la mancha PBMC. Este protocolo utiliza cantidades limitadas de cuentas CD25 para obtener células CD25-alta (29) nTreg. Sin embargo, estos no son Tregs puros, pero estos son sólo enriquecen en células T reguladoras para ser usado como control positivo. Si se necesitan células T reguladoras puros, otros kits deben ser utilizados (por ejemplo, en combinación con CD4 enriquecimiento y CD127-agotamiento) o, alternativamente, las células CD25 + pre-enriquecidos con 8 l perlas de CD25 por 10 7 células y se tiñeron y ordenados por células activadas por fluorescencia la clasificación con acotamiento estrictas CD4 + CD25 ++. También la inclusión de otros marcadores, como la exclusión CD127, debe ser considerado.

_content "> Es importante considerar que FOXP3 es necesario, pero no suficiente para conferir identidad Treg 30. Mientras iTregs se pueden utilizar para estudiar algunos aspectos de, por ejemplo, la regulación de FOXP3, es sin embargo importante señalar que iTregs difieren de nTregs en varios aspectos. por tanto, es crucial para nTregs cultivo (idealmente derivados del mismo donante) en paralelo a iTregs en todos los ensayos para la comparación. la diferencia entre nTregs y iTregs se ejemplifica por única coincidencia parcial del transcriptoma nTreg y iTreg como se mide en iTregs murinos 31. Otros genes Treg firma, además de FOXP3 deben medirse por esta razón, y para asegurar la discriminación de la expresión de FOXP3 inducida por activación en las células humanas. por ejemplo, iTregs debería mostrar una mayor expresión de CD25, CTLA-4 y EOS compararon a las células T activadas, mientras que la expresión de IFN-γ y SATB1 debe ser baja en nTregs y iTregs inducidos por los protocolos descritos aquí, según lo publicado previamente 13. También en un genoma de gran escala, se ha descrito que los patrones epigenéticos de metilación del ADN y las histonas modificaciones en iTregs murinos no reflejan los patrones encontrados en nTregs 30. Hemos descrito previamente que iTregs inducidos por el aquí describen protocolos, en contraste con nTregs, no exhibió TSDR desmetilación. En consecuencia, iTregs perdió FOXP3 cuando volvieron a estimular, pero mantiene la expresión de FOXP3 cuando se cultivaron adicionalmente en presencia de IL-2 y sin reestimulación 22. Curiosamente, iTregs inducidas por un protocolo alternativo utilizando sobrenadantes de macrófagos M2 visualizan estabilidad mejorada FOXP3, a pesar de la falta de desmetilación TSDR y TGF-β ser causal para la inducción FOXP3 27.

Modificación de iTreg-inducing protocolos de la adición de los compuestos (como la vitamina C o sulfuro de hidrógeno) que influyen en Ten-once Translocación (TET) enzimas metilcitosina dioxigenasa, como se ha descrito muy recientemente 32-34, puede añadir en la estabilización de FOXP3 al afectar la metilación del ADN. Además, la fuerza y el tiempo de estimulación tiene una influencia sobre la expresión de FOXP3 y estabilidad 35. A lo largo de estas líneas, se demostró que el uso de anticuerpos / CD28 de talón de acoplamiento de CD3 en lugar de anticuerpos unidos a la placa para aumentar la murino iTreg in vivo función supresora y la estabilidad aunque independiente de TSDR desmetilación 36. Otro factor que debe ser considerado como una fuente potencial de variación es el uso de suero, que contiene factores no definidos, incluyendo TGF-β que incluso de fuente bovina es 100% de reacción cruzada con las células humanas. Además, la fuente y la actividad de IL-2 pueden influir drásticamente los resultados de la inducción FOXP3.

Un importante feature de células T reguladoras es su capacidad supresora, que tiene que ser probado posteriormente con iTregs generados en este protocolo. Cabe señalar que los análisis de supresión con iTregs no son triviales y la literatura acerca de las capacidades de supresión de iTregs es controvertido. Existen varios métodos y protocolos para evaluar la función supresora de las células Treg humanos han sido publicados en otro lugar 22,37 - 41, con in vitro ensayos de proliferación basado en citometría de flujo lecturas tales como la dilución de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) que se utiliza la más comúnmente. Es importante lavar y descansar iTregs antes de su uso en ensayos de supresión, y tiene que tener en cuenta que iTregs, en contraste con nTregs, pueden no ser anérgicos pero proliferan sí mismos durante los ensayos de supresión. Consideramos que es muy importante utilizar `mock' células T estimuladas como células de control de supresores para identificar el grado de supresión inespecífica (tales como a través de CTLA-4 expresión, IL-2 consumpción y el crecimiento excesivo de cultivo por las células T activadas) que no está relacionada con FOXP3 + Treg-efectos específicos, y la frecuente falta de este control pueden contribuir a algunas controversias en la literatura. El uso de este control, se definió que sólo el TGF-ß / iTregs inducida por ATRA Rapa / muestran actividad supresora in vitro 22. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que en relación con la actividad supresora (aunque no más alta fracción de células FOXP3 +), el TGF-β / ATRA / Rapa es la mejor combinación de factores de los protocolos descritos para inducir iTregs. Sin embargo, la actividad supresora in vitro no necesariamente refleja la actividad supresora in vivo, y de hecho que determina que iTregs humanos generados por estos protocolos no suprimió en un frente -host modelo de enfermedad de injerto xenogénico al menos en las condiciones ensayadas 22. Esto puede estar relacionado con la expresión de FOXP3 inestable que se había perdido en iTregs sobre la re-estimulación, en línea con la falta de TSDR desmetilación 22

Dependiendo de qué aspecto de características iTreg (alta fracción de FOXP3 + células, la actividad supresora superior, la estabilidad FOXP3) es más importante para una pregunta de investigación, diferentes protocolos pueden ser más adecuado para estudiar estas cuestiones, lo que hace que sea difícil definir el general 'mejor "protocolo para la inducción de Treg. Además, varias diferencias sutiles experimentales descritos anteriormente pueden influir en los resultados y pueden contribuir a controversias con respecto al fenotipo y función de supresión del TGF-beta inducida iTregs que aparecen entre los informes incluso con protocolos aparentemente similares para la generación de iTreg 42. Por ejemplo, incluso dentro de un laboratorio, se observó que iTregs inducidas con TGF-β y la IL-2 en un medio RPMI que contenía suero muestran alguna actividad supresora en comparación con las células de control 27, mientras que iTregs inducida por IL-2 de TGF-β / generan en definido, medio de cultivo de células T sin suero no lo hizo 22, dese a niveles similares de FOXP3.

Las futuras aplicaciones basadas en estos protocolos deben esforzarse para optimizar aún más las condiciones de inducción de Treg para lograr un fenotipo con la expresión de FOXP3 estable, desmetilación TSDR, fenotipo estable sin necesidad de conversión a las células T efectoras productoras de citoquinas y la actividad supresora óptima. Un mayor desarrollo de los protocolos de inducción iTreg puede ser útil para la transferencia adoptiva se acerca en el futuro, en el que la terapia por transferencia Treg es muy prometedor para el tratamiento potencial de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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Inmunología No. 118 las células T reguladoras Treg células T CD4 + el aislamiento de células magnético, citoquinas FOXP3 TGF-β IL-2 intracelular citometría de flujo QRT-PCR
Diferenciación <em>in vitro</em> de las células CD4 <sup>+</sup> humano FOXP3 <sup>+</sup> células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 <sup>+</sup> células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen
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Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

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