Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.
Naast hun essentiële rol bij het genereren van ATP, mitochondriën ook als lokale calcium (Ca2 +) buffers strak reguleren de intracellulaire Ca2 + -concentratie. Om dit te doen, mitochondriën gebruik maken van de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (ΔΨ m) naar sekwestreren Ca 2+. De instroom van Ca 2+ in de mitochondriën stimuleert drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus, het verhogen van elektronen overdracht via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) complexen. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix.
We beschrijven hier een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Doordringbaar door de cellen, mitochondriale Ca2 + kanworden gemeten met de fluorescerende Ca2 + indicator Fluo-4, AM, met bepaling van de ΔΨ m met de fluorescente kleurstof tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM). Het voordeel van dit systeem is dat er zeer weinig spectrale overlap tussen de fluorescerende kleurstoffen, waardoor accurate meting van mitochondriale Ca2 + en m gelijktijdig ΔΨ. Met de opeenvolgende toevoeging van Ca2 + aliquots, mitochondrial Ca2 + opname kan worden gevolgd, en de concentratie waarbij Ca2 + induceert mitochondriale permeabiliteit transitie en het verlies van ΔΨ m bepaald.
Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het reguleren van intracellulaire Ca2 + -concentratie door als lokale Ca2 + buffers 1. Ca 2+ komt in de mitochondriën via het Ca 2+ uniporter, een proces gedreven door de elektrochemische gradiënt die over het mitochondriale binnenste membraan (ΔΨ m) 2 bestaat. Eenmaal in de mitochondriale matrix, kunnen Ca2 + oxidatieve fosforylatie activeren door het stimuleren drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus 3. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix. Als de Ca2 + -concentratie in de mitochondriën erg hoog wordt, kan mitochondriale permeabiliteitsovergang worden gestart, waardoor de dissipatie van ΔΨ m, de cessation van oxidatieve fosforylering en de inductie van celdood signaalroutes 4.
De belangrijke rol die de mitochondriën spelen in de ruimtelijke buffering van cellulaire calcium maakt de nauwkeurige monitoring van mitochondriale calcium kritisch. Verschillende methoden zijn vastgesteld mitochondriale calcium, waaronder het gebruik van rhodamine gebaseerde kleurstoffen controleren. Een dergelijke kleurstof, Rhod-2, AM, is zeer effectief in verdeling naar de mitochondriën mitochondriale Ca2 + niveaus 5 meten 6. Wel moet erop worden gebruikt als een kleurstof ophopen in andere organellen, zoals liposomen of blijven in de cel cytosol. Niettemin kan stroomafwaarts analyses worden gebruikt om deze signalen te onderscheiden van die van de mitochondriën 7.
Een andere techniek om mitochondriale calcium monitoren gebruikt fluorescente reporter constructen 8 </s up>. Het voordeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze specifiek naar de mitochondriën kan worden gericht door endogene N-eindstandige peptiden, bijvoorbeeld de N-terminale targeting signaal menselijke COX subeenheid VIII. Dit systeem is gebruikt om een mitochondriaal aequorine gerichte probe die uiterst nuttig voor het onderzoeken van mitochondriale calcium signaling 9 is gebleken genereren. Het belangrijkste nadeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze moeten in de cellen door tijdelijke expressie worden ingevoerd (die niet haalbaar is voor bepaalde celtypes en kunnen variabele resultaten) of door stabiele expressiesystemen (die tijdrovend).
Om de hierboven geschetste problemen te omzeilen, hebben we een nieuw protocol ontwikkeld om mitochondriale Ca 2+ en ΔΨ m gelijktijdig meten. Dit protocol is gebaseerd op een eerder beschreven methode exogeen calcium bijdraagt aan gepermeabiliseerde cellens = "xref"> 10. Ons protocol heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: ten eerste maken we gebruik van Fluo-4, AM en TMRM om mitochondriale Ca 2+ en ΔΨ m, twee kleurstoffen die zeer verschillende spectrale eigenschappen volgen; ten tweede worden de cellen permeabel gemaakt zodat de Fluo-4 signaal alleen detecteert mitochondriale Ca2 + en Ca2 + niet gelokaliseerd op andere organellen en de cel cytosol; en ten derde, het gebruik van Fluo-4 mitochondriale Ca 2+ detecteren maakt een snelle en eenvoudige celkleuring, ontkennen elke cel transfectie of transformatie problemen die bestaan bij gebruik van genetisch gecodeerde probes.
Calcium speelt een cruciale rol in vele celprocessen, waaronder spiercontractie, neuronale signalering en celproliferatie 13. Toename in cel calciumconcentraties worden vaak geassocieerd met energievraag, met calcium rechtstreeks kan stimuleren mitochondriale oxidatieve fosforylering ATP generatie 3 verhogen. Het is daarom van essentieel belang dat we de mogelijkheid hebben om effectief toezicht mitochondriale calcium accumulatie en om te kunnen vergelijken hoe deze functi…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Dr Kirstin Elgass en Dr Sarah Creed uit Monash Micro Imaging voor technische bijstand, en de Wellcome Trust en de Medical Research Council UK voor financiële steun. MMcK wordt ondersteund de Australian Research Council Future Fellowship Scheme (FT120100459), de William Buckland Foundation, The Australian Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research en Monash University. Dit werk werd ondersteund door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Regeling.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
hemacytometer | VWR | 631-0925 |
10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |